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方法論記事

グルコース-6-リン酸イソメラーゼ(G6PI)誘発RAマウスにおけるiNKT細胞の導入免疫療法

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DOI:

10.3791/60048

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2020年1月31日

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1Medical School of Hebei University, 2Key Laboratory of Pathogenesis Mechanism and Control of Inflammatory-Autoimmune Diseases in Hebei Province

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルは、G6PI混合ペプチドを使用して、CD4+ T細胞およびサイトカインにおけるヒト関節リウマチのモデルに近い関節リウマチモデルを構築します。特定の表現型および機能を有する高純度不変不変天然キラーT細胞(主にiNKT2)は、養子免疫療法のためのインビボ誘導およびインビトロ精製によって得られた。

要約

関節リウマチ(RA)は、複雑な慢性炎症性自己免疫疾患である。この疾患の病因は、不変性のナチュラルキラーT(iNKT)細胞に関連している。活性RAを有する患者は、より少ないiNKT細胞、欠損細胞機能、およびTh1の過剰な分極を有する。本研究では、hGPI325-339とhGPI469-483ペプチドの混合物を用いてRA動物モデルを確立した。iNKT細胞をインビボ誘導およびインビトロ精製により得られ、続いて、採用免疫療法用のRAマウスへの注入が行われた。インビボイメージングシステム(IVIS)の追跡により、iNKT細胞は主に脾臓および肝臓に分布していたことが明らかになった。細胞療法後12日目、疾患の進行は著しく低下し、臨床症状は緩和され、胸腺におけるiNKT細胞の存在量は増加し、胸腺におけるiNKT1の割合は減少し、TNF-α、IFN-γ、およびIL-6のレベルは1000年に増加した。血清が減少した。iNKT細胞の養子免疫療法は免疫細胞のバランスを回復させ、身体の過剰な炎症を矯正した。

概要

慢性関節リウマチ(RA)は、0.5~1%発生率1、2の慢性進行性侵襲を特徴とする自己免疫疾患である。その根底にある病因は自己反応性CD4+およびCD8+T細胞の異常増殖に起因し、CD4+IFN-γ+およびCD4+IL-17A+T細胞の割合の増加、およびCD4+IL-4+ + FoxP3+T細胞の減少した数によって明らかにされる。したがって、炎症性サイトカインの分泌が増加し、過度の炎症反応が身体の免疫系のネイティブバランスおよび耐性機能を破壊する。また、ヘルパーTリンパ球(Th)を関節に浸透させる1細胞は炎症反応や関節損傷を悪化させる。したがって、過剰な炎症反応の阻害と免疫寛容および免疫バランスの回復がRA3の治療の鍵である、4。

iNKT細胞は、NK細胞とT細胞の両方の機能と特性を有する。iNKT細胞には、限定TCRβ鎖レパートリー5を有する異なる不変T細胞受容体(TCR)α鎖を有し、抗原提示細胞の表面に主要組織適合性複合体(MHC)クラスI分子CD1dによって提示される糖脂質抗原を認識する。ミツオら6は、RAを含む多くの自己免疫疾患において多数のiNKT細胞および機能的欠陥を検出した。Aurore et al.7は、iNKT細胞が自己免疫寛容を維持するのにプラスの効果を有し、iNKT細胞の数と機能が回復すると、疾患が緩和されることを実証した。さらに、ミエロット・ガフソウら8は、iNKT細胞が病気を失起しただけでなく、病気の進行を増加させたことを発見した。これらの矛盾した結果は、iNKT細胞が異種T細胞であり、異なるサブセットの機能が逆転する可能性があることを示唆している。RAの臨床研究において、iNKT細胞の頻度は、疾患活性9のスコアと相関した。また、結果は、INKTの頻度がRA患者において減少し、CD4+IFN-γ+T細胞サブセットの数が増加し、炎症性サイトカインIFN-γおよびTNF-αの分泌レベルが10、11増加したことを確認した。さらに、シャリフら12は1型糖尿病(T1D)を調査し、iNKT細胞の選択的注入が炎症性サイトカインIL-4の発現をアップレギュレートし、免疫寛容を維持し、1型糖尿病の発症を妨げた。したがって、特定のiNKT細胞の導入またはiNKT細胞の標的活性化は、RA患者におけるiNKT細胞のレベルを増加させ、RA治療において画期的となり得る。

細胞免疫療法は現在、大きな関心を持っており、癌治療に広く使用されています。しかし、iNKT細胞は稀であり、異種免疫調節細胞(PBMCの総数のわずか0.3%)13であり、潜在的な臨床応用を制限する。これらの細胞は主に3つの亜集団に分けられる:1)iNKT1細胞は、前骨髄球性白血病ジンフィンガータンパク質(PLZF)およびTボックス転写因子(T-ベット)の高発現を有する。2) PLZFおよびGATA結合タンパク質3(GATA3)の中間発現を有するiNKT2細胞。3)INKT17細胞の発現が低いPLZF及びレチノイド関連の孤児核受容体(ROR)-γtがIFN-γ、IL-4、およびIL-1714を分泌する。活性化されたiNKT細胞は、Th1、Th2、およびTh17様サイトカインを分泌し、iNKT細胞15の異なる免疫調節効果を決定する。iNKT細胞の様々な亜集団の特異的活性化の免疫調節作用および免疫療法効果は異なる。従って、体の免疫応答を調節する抗炎症機能を有するiNKT細胞(主にiNKT2)の特定の表型の選択は、RAにおける免疫の不均衡および免疫障害を補正することができる。

理想的な動物モデルの確立は、RA病因の治療および研究にとって非常に重要である。現在、最も一般的に使用される成熟した動物モデルには、コラーゲン誘発関節炎、アジュバント関節炎、ジモサン誘発関節炎、多糖による関節炎16-17が含まれる。しかし、人間のRAのすべての特徴を完全にシミュレートできるモデルはありません。II型コラーゲン誘発関節炎(CIA)は、古典的な関節炎モデルです。CIAは、II型コラーゲン特異的モノクローナル抗体を用いたマウスの免疫によって誘導され、この疾患モデルの抗体依存性を反映している。Be歳代は、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ(G6PI)に対する全身免疫応答を有するモデルを記載し、これは、感受性マウス株における末梢対称多関節炎を誘導する18、19である。このモデルでは、関節炎の発症はT細胞、B細胞、および自然免疫18、19、20に依存する。堀越21は、G6PIポリペプチド断片を有するDBA/1マウスの免疫から生じるRAモデルが、CIAモデルよりもCD4+T細胞およびサイトカイン(すなわち、IL-6およびTNF-α)の点でヒトRAに類似していることを発見した。TCR認識部位に対する刺激効果を高めるために、G6PI(hGPI325-339およびhGPI469-483)の混合ポリペプチド断片を使用して、DBA/1マウスを免疫化し、RAマウスモデルを構築した。hGPI325-339 および hGPI469-483 は I-A q 制限 T 細胞応答に対して免疫優位であるため、このアプローチの成功率は高くなる可能性があります。したがって、このモデルは、RA患者22におけるCD4+T細胞およびiNKT細胞欠損の過剰増殖をシミュレートすることができる。RA免疫病理学の基礎研究は、さらに詳細な調査の基礎を築きました。

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プロトコル

全ての実験マウス(合計150匹)は健常な雄DBA/1マウス、6~8週齢(20.0±1.5g)で、特異的病原体フリー(SPF)環境で飼育した。モデリング前に特別扱いはありません。実験は、健常対照群(15匹)、モデル対照群(15匹)、及び細胞療法群(55匹のマウス)に分けた。この研究は、ヘバイ大学動物福祉倫理委員会によって承認されました。

1. 疾患モデルの構築

  1. RA動物モデルの複製
    1. hG6PI 325-339およびhG6PI 469-483断片の両方の1.75 mgを計量し、4°C三重蒸留水の5.25 mLにそれらを溶解します。
    2. 50°Cの水浴で完全なフロイントのアジュバント(CFA)を溶解し、別の10 mL遠心管に5.25 mLを引き込み、使用するためにそれを冷却します。
    3. hG6PI溶液とCFA溶液の混合物を、2つのガラスシリンジが接続された人工乳化ユニットに入れます。
    4. 一定の速度と周波数で10~20x/分でシリンジを押し込み、混合ペプチド溶液とCFA溶液を完全に乳化します。氷浴で操作を行い、乳化終了後10分間、乳化液滴を分散せずに水中に保管します。
    5. 150 μLの乳化されたhG6Pを皮下にマウスの尾根に注入する。
    6. hG6PI注入後0時間および48時間でマウス腹腔内に200mgの百日性毒素を注入する。
  2. RAモデルの実験的検証
    1. バーニアキャリパー(1日2倍)でマウスの足の厚さを測定します。
    2. 足の赤みや腫れの程度を観察し、マークします。次のスコア基準を使用してください: 1) 軽度の腫脹を伴うつま先;2)ドーサムペディスと足パッド、透明な赤い腫脹;3)赤い腫れと足首。
    3. 深い麻酔下でマウスを安楽死させる 1% ペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射によって (50 mg/kg 体重) 14 モデル後 14 日と HE 染色のための足を削除します。.
    4. 市販のサイトメトリックビーズアレイ(CBA)を用いて、血清IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF-α、およびIFN-γの分泌レベルを決定します。

2. 養子細胞療法によるiNKT細胞の獲得

  1. iNKT細胞の指向性誘導
    1. 正常マウスを腹腔内にα-GalCer(体重0.1mg/kg)で注射する。
  2. iNKT細胞の分離
    1. モデル化の3日後、麻酔用に1%のペントバルビタールナトリウム(体重50mg/kg)でマウスを腹腔内注射する。適切に麻酔されたマウスは、つま先のピンチに対する後足離脱応答を示さない。
    2. Α-GalCerを腹腔内注射した後、DBA/1マウスの脾臓を分離します。200メッシュのふるいに脾臓を切り、粉砕して単一細胞懸濁液を調製する。
    3. 細胞懸濁液をPBSで洗浄し、遠心分離器を200xgで5分間、上清を捨てる。 繰り返します。
    4. 全血および組織希釈液の1 mLで細胞を再懸濁する。マウスリンパ球分離培地を3 mL加え、室温で300xgで20分間細胞を遠心分離する。
    5. 乳白色リンパ球の層(すなわち、上から2番目の層)を収集し、PBSで2倍に洗浄し、自動細胞カウンターでカウントする。
  3. iNKT細胞の精製のための磁気活性化細胞選別(MACS)陽性選択戦略
    注:CD1d四量種の前処理のために、1mg/mLのα-GalcerをTween-20の0.5%およびNaClの0.9%で200 μg/mLに希釈し、得られた溶液の5μLをCD1d四量式溶液の100μLに添加した。混合物を室温で12時間インキュベートし、使用のために4°Cに置いた。TCR βを脱イオン水で80倍希釈した。他のすべての抗体は、ストック溶液として使用した。
    1. 10個の7個の細胞を4°CPBSの100μLで再懸濁し、α-GalCer搭載CD1dテトラマー-PEを10μL加え、暗闇の中で15分間4°Cでインキュベートした。
    2. 細胞をPBSで2x洗浄し、PBSの80μLで再サスペンドする。
    3. 20 μLの抗PE-マイクロビーズを加え、暗闇の中で20分間4°Cでインキュベートします。
    4. PBSで2倍洗浄し、500μLのPBSで細胞を再懸濁します。
    5. 選別カラムをMACSソーターの磁場に入れ、500 μLのPBSですすいでください。
    6. ステップ 2.3.4 のセル懸濁液をソート列に追加し、フロースルーを収集し、PBS バッファーで 3 x をリンスします。
    7. 磁場を取り除き、ソート列からセルを収集します。この時点で、1 mL の PBS バッファーをソート列に追加し、一定の圧力でプランジャを迅速に押し込み、ラベル付けされたセルを収集チューブに駆動し、精製された iNKT 細胞を得ます。自動セル カウンターを使用してカウントします。
  4. iNKT細胞表現型の同定
    1. ステップ2.2.5と2.3.7から1 x 106細胞をそれぞれ取り出し、PBSの50 μLで再サスペンドします。
    2. 抗体インキュベーション:陰性対照管に抗体を添加しないで、α-GalCer-PE-CD1dテトラマーの0.5 μLまたは10 μLのFITC-TCR βを単一陽性コントロールチューブに添加する。サンプルチューブに0.5 μLのα-GalCer-PE-CD1dテトラマーと10 μLのFITC-TCR βを加えます。暗闇の中で30分間4°Cでインキュベートします。
    3. PBSの細胞を洗浄し、5分間200 x gで遠心分離します。
    4. 上清を捨て、Foxp3 Foxation/パーメアビレーション作動液の1 mLを加え、暗い時4°Cで45分間細胞をインキュベートする。
    5. 1xパーメアビライゼーションバッファーの働き溶液の1 mLを加え、5分間室温で500 x gの細胞を遠心分離します。
    6. 上清を捨てます。アレクサ・フルオール647マウスのアンチPLZFとPerCP-Cy 5.5マウスのアンチTベット(またはPerCP-Cy 5.5マウスアンチRORСtの1 μL)を暗闇の中で室温で30分間加えます。
    7. 洗浄のためのパーメアビライゼーションバッファーの働く溶液の2 mLに加える。
    8. 上清を廃棄し、細胞をPBSの500μLに再懸濁し、フローサイトメトリーで測定する。
  5. iNKT細胞の機能識別
    1. ステップ2.3.7から3 x 106 iNKT細胞を取り、1.5 mLのRPMI-1640不完全培地(すなわち血清なし)の12ウェルプレートに再懸濁します。
    2. フォルボルエステル(PMA、50ng/mL)とイオノマイシンカルシウム(IO、1μg/mL)を加え、CO2インキュベーターに24時間入れる。
    3. 細胞上清を収集し、メーカーのプロトコルに従って市販のCBAアッセイを使用して、IL-2、IL-17A、TNF-α、IL-6、IL-4、IFN-γ、およびIL-10の分泌レベルを検出します。
  6. RAマウスにおけるiNKT細胞の遊入経路に関する実験的研究
    1. DmSOにDiR染料(2.5mg/mL)を溶解します。
    2. iNKT細胞を6つのウェルプレートにRPMI-1640不完全培地で再懸濁します。密度は1×106細胞/mLである。
    3. DiR(5 μg/mL)溶液を加え、CO2インキュベーターで25分間インキュベートします。
    4. PBSで洗浄し、細胞を再懸濁(3 x 106/300 μL)して、DiR標識iNKT細胞(DiR-iNKT)を得る。
    5. 1%ペントバルビタールナトリウム(50mg/kg体重)を腹腔内に注入してマウスを麻酔する。適切に麻酔されたマウスは、つま先のピンチに後足離脱を示さない。画像化のための麻酔下での乾燥を防ぐために、マウスの目に獣医の軟膏を適用します。
    6. DiR-iNKT細胞をRAモデルでマウス1個あたり3 x106個のマウスに8日間注入する。インビボイメージングシステム(IVIS)を用いて、マウスの注射後0分、10分、30分、60分、および0日目(3時間後)、1、3、6、12、26、34、38、および42日間のiNKT細胞をモニタリングします。使用した励起波長は748nm、発光波長は780nm、露光時間は自動であった。
    7. 各観察の後、各マウスを別々のケージに入れ、胸骨の骨の痛さを維持します。麻酔からの回復まで観察する。

3. iNKT細胞を用いたRAマウスの導入免疫療法の評価

  1. RAマウスに対するiNKT細胞導入免疫療法
    1. マウスあたり3 x 106細胞iNKT細胞を尾静脈を通して注入する。8日前にモデル化した15匹のマウスを無作為に選択し、尾静脈注入によるステップ2.3.7からDiR標識を行わずにiNKT細胞を得る。
  2. iNKT細胞に対する養子免疫療法の有効性を評価する。
    1. マウスの足の厚さを測定し、足首関節の腫れを定量化し、ステップ1.2.1~1.2.2で説明したようにiNKT細胞を注入した後に体系的にスコアを付けます。
    2. ステップ 1.2.3 で説明したように、マウス関節の炎症細胞浸潤および関節変化を観察する。
    3. ステップ 1.2.4 で説明したように、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF-α、および IFN-γ の分泌レベルを決定します。
  3. iNKT細胞とサブセットの頻度を決定します。
    1. マウス胸腺を分離し、単一細胞懸濁液を調製する。
    2. リンパ球分離液でリンパ球を分離する。
    3. ステップ 2.4 で説明した iNKT セル周波数とサブグループ周波数を決定します。
  4. 統計分析
    注: すべてのデータは平均値として表示されます ± SD. P < 0.05 の値は統計的に有意と考えられていました。
    1. 分散の 1 要素分析 (ANOVA) を使用します。分散が満たされている場合は、LSD 検定を使用してさらに比較します。
    2. 分散が均一でない場合は、ノンパラメトリック検定を使用します。さらに比較のために、クラスカル-ウォリスH検定を使用します31.

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結果

モデル化後、関節炎指数スコアと足の厚さが増加しました。対照群と比較して、RAモデル群のつま先は、モデル化後6日目に赤い腫脹を示し始め、徐々に悪化した。14日で、足首関節の赤い腫れがピークに達し、その後徐々に軽減した。足の太さは同様に変更されました(P < 0.05) (図 1)。

炎症細胞浸潤は、モデリング後に有意に増加した。病的な結果は、RAモデルマウスの足首滑膜組織における炎症細胞の浸潤度が異なる段階で異なっていることを示した。14日目のポストモデリングでピーク炎症が起こった(図2)。

炎症性サイトカインが増加し、血清中の抗炎症性サイトカインが減少した。RAモデル群では、炎症促進サイトカイン(TNF-α、IFN-γ、およびIL-6)の血清レベルが有意に増加した(P< 0.05)、抗炎症性サイトカイン(IL-4およびIL-10)が有意に減少した(P<0....

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ディスカッション

iNKT細胞は、自然免疫と適応免疫を橋渡しする特殊なT細胞であり、主にCD4++ /CD8+胸腺細胞から開発されています。iNKT細胞は多様な免疫調節機能を有し、異なるサイトカイン23の直接接触および分泌により他の免疫細胞と相互作用し、樹状細胞(DC)、マクロファージ、好中球、B細胞、T細胞、およびNK細胞の分化および発達24に影響を及ぼす。α-GalCerはスポンジから抽出された古典的なiNKT細胞特異的な活性化剤である。いくつかの研究は、脾臓iNKT細胞周波数が3日間のα-GalCerの単一腹腔注射の後にピークに達することを示しています25.我々の実験結果は、主に抗炎症性サイトカインIL-4およびIL-10を分泌するα-GalCerの腹腔内注射後3日間、マウス脾臓におけるiNKT2サブセットの優位性を示した...

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開示事項

著者らは、資金や利益相反を宣言していない。

謝辞

我々の研究は、中国自然科学財団(NSFC)(81771755)、河北省の大学と大学の科学技術主要研究プロジェクト(ZD2017009)、河北大学動物実験センターによって支援されました。私たちは彼らのサポートに感謝しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Alexa Fluor 647 マウス Anti-PLZFBD563490America
Anti-PE MicroBeadsMiltenyi130-048-801ドイツ
カラムMiltenyiMSドイツ
極低温遠心分離機BeckmanAllegra®X-15Rアメリカ
DiRサーモフィッシャーサイエンティフィックD12731アメリカ
埋め込みセンター天津航空電気機械有限公司BMJ-1中国
FITC ハムスター アンチマウス TCR &β;チェーンBD553170アメリカ
フローサイトメーターBDAccuri C6アメリカ
フロイントの完全なアジュバントシグマF5881アメリカ
hGPI325-339 (IWYINCFGCETHAML)カレベイ バイオケム18062202中国
hGPI469-483 (EGNRPTNSIVFTKLT)カレベイ バイオケム18062203中国
In Vivo イメージングシステムPerkinElmerノギス IVIS lumina IIアメリカ
イオノマイシン カルシウムケイマン10004974アメリカ
KRN7000AdipoGenAG-CN2-0013アメリカ
マウス CD1d テトラマー-PEMBLTS-MCD-1日本
マウス percollSolarbioP8620中国
光学顕微鏡オリンパスOlympus-II日本
PerCP-CyTM5.5マウス抗ROR-ϒtBD562683アメリカ
PerCP-CyTM5.5 マウス 抗 T-betBD561316アメリカ
百日咳毒素シグマP7208アメリカ
ホルボールエステルケイマン10008014アメリカ
赤血球溶解バッファーBD555899アメリカ
RPMI-1640生物産業01-100-1ACSイスラエル
Th1/Th2/Th17サイトカインキットBD560485America
UltramicrotomeLeicaLeica EM UC6ドイツ

参考文献

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