小型RNA-seqの改善:バイアスの減少と2'-O-メチルRNAの検出の改善

サマリー

我々は、標準的な方法よりもバイアスが少ない詳細な小さなRNAライブラリー修復プロトコルと2'-O-メチルRNAの感度の増加を提示する。このプロトコルは、コストを節約するために自家製試薬を使用するか、便宜上キットを使用して従うことができます。

要約

次世代シーケンシング(NGS)による小型RNA(sRNA)の研究は、図書館準備中のバイアス問題に挑戦しています。植物マイクロRNA(miRNA)のようないくつかのタイプのsRNAは、3'末端ヌクレオチドで2'-O-メチル(2'-OMe)修飾を運ぶ。この変更は、3' アダプターのライゲーションを阻害するので、別の難しさを追加します。以前に、'TruSeq(TS)プロトコルの変更バージョンはバイアスが少なく、2'-OMe RNAの検出が改善されたことを実証しました。ここでは、最高の全体的なパフォーマンスを示したプロトコル'TS5'を詳細に説明します。TS5は、同等の性能を持つTSキットの自家製試薬または試薬を使用して従うことができます。

概要

小さなRNA(sRNA)は、生物学的^{プロセス1}の多様性の制御に関与している。真核生物調節sRNAは、通常、サイズが20〜30 ntの間です。主な3つのタイプは、マイクロRNA(miRNA)、ピウィ相互作用RNA(piRNA)、小干渉RNA(siRNA)です。異常なmiRNA発現レベルは、様々な^疾患2に関与している。これは、健康と病気におけるmiRNAの重要性と、sRNA全般を検出するための正確で定量的な研究ツールの要件を強調しています。

次世代シーケンシング(NGS)は、sRNAを研究するために広く使用されている方法です。定量的PCRやマイクロアレイ技術(qPCR)などの他のアプローチと比較したNGSの主な利点は、sRNA配列の事前知識を必要としないため、新しいRNAを発見するために使用できることであり、さらに、より少ないバックグラウンド信号と彩度効果。さらに、単一ヌクレオチドの違いを検出でき、マイクロアレイよりも高いスループットを有する。ただし、NGS にはいくつかの欠点もあります。シーケンス実行のコストは比較的高く、サンプルをシーケンス用ライブラリに変換するために必要なマルチステップ プロセスによってバイアスが発生する可能性があります。典型的なsRNAライブラリー調製プロセスでは、3'アダプターは、ATPが存在しない場合に、RNAリガーゼ2(RNL2)の切り捨てられたバージョン....

プロトコル

1. 小型RNAの分離

1. フェノール系試薬またはその他の方法を用いて総RNAを抽出する。RNA の品質が良好かどうかを確認します。
2. 200Vで15%のTBE-ureaゲル(材料の表を参照)を15分間事前に実行します。
3. ゲルがプレランニングされている間、5-15 μLの総RNAを5-20 μLの総体積に混合し、同量のホルムアミドローディング色素を含む(材料表、95%脱イオン化されたホルムアミド、0.025%ブロムフェノールブルー、0.025%キシレンシアン、5mM EDTA pH)を20μHの管に混ぜる。同様に、10 μL(200 ng)の小型RNAラダー(材料の表を参照)を同量のホルムアミドローディング色素と混合します。加熱された蓋を持つサーモサイクラーで65°Cで5分間インキュベートし、その後、すぐに氷の上にチューブを置きます。
4. はしごとサンプルを少なくとも1つのレーンで同じゲルに積み込み、ブロモフェノールブルー(ダークブルー)がゲル長の約3分の2(約40分)に移行するまで200Vで走ります。
5. 次のようにゲルからRNAを溶出させるシステムを準備する:21ゲージの針でヌクレアーゼフリー0.5 mLマイクロ遠心管の底部を穿刺する。パンクした0.5 mLチューブをヌクレアーゼフリーのラウンドボトム2mLマイクロ遠心分離管に入れます。

結果

重要なステップは、開始総RNA材料(図3)および所望の最終ライブラリー産物(図4)の小さなRNA分率の単離である。両方のステップは、ポリアクリルアミドゲル精製を含みます;小さなRNAは15%TBE尿素ゲルから単離され、最終ライブラリーは6%天然TBEゲルから単離されます。ゲルから単離された小さなRNAは、小さなRNA毛細血管電気泳動チップ(材料の表;図 3B)これにより、ユーザーは回収された小さなRNAの量と調製中のmiRNAの割合を推定できるようになります。

最終ライブラリー産物のゲル精製は、所望のライブラリの近くに移行する多数の追加製品が形成されるにつれて微妙なステップである。これは、アダプタダイマーなどの他の種でライブラリを汚染するリスクを増加させるので、ゲルを過負荷にしないことが重要です。例として(

ディスカッション

小さなRNAライブラリーの準備は、主にアダプタライゲーションステップ中に導入されるバイアスのために困難なままです。植物miRNA、昆虫、線虫および哺乳類のpiRNA、昆虫および植物における小さな干渉RNA(siRNA)のような3'末端に2'-OMe修飾を伴うRNAは、2'-OMe修飾が3'アダプターリゲーションを阻害するので、特に研究が困難である。sRNAライブラリー調製プロトコルを改善するために多くの解決策が文献に提案されているが、市販されているキットのほとんどは依然として、深刻なバイアスを有する古典的なTSプロトコルに基づいている。しかし、ライゲーション反応にランダム化されたアダプターとPEGを備えたNfキットを含むいくつかの「低バイアス」キットが存在し、アダプタライゲーションを完全に回避するいくつかのキットが最近登場^{しました12。}我々は以前、Nfが標準的なTSプロトコルよりも異なるmiRNAを検出することを報告したが、プロトコル'S'(アダプタライゲーションなし)は、副^産物12の有意な形成のために比較的不十分に行われた。驚くべきことに、.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2100バイオアナライザー機器	アジレント	G2939BA
酸フェノール:クロロホルム、pH 4.5 (IAA と、125:24:1)	サーモフィッシャー	AM9720
アデノシン 5'-三リン酸 (ATP)	Nex England Biolabs	P0756S
Agencourt AMPure XP ビーズ	ベックマン・コールター	A63880
バイオアナライザー 高感度 DNA キット	アジレント	5067-4626
バイオアナライザー スモール RNA キット	Agilent	5067-1548
Corning Costar Spin-X 遠心分離管フィルター	Sigma Aldrich	CLS8162-96EA
Dark Reader トランスイルミネーター	各種サプリメント
HotStart PCR Kit, with dNTPs	Kapa Biosystems	KK2501
NEXTflex small RNA-seq V3 kit	BIOO Scientific	NOVA-5132-05	オプションの
Novex TBEゲル6%	ThermoFisher	EC6265BOX
Novex TBE尿素ゲル15%	ThermoFisher	EC6885BOX
QIAquickヌクレオチド除去キット	Qiagen	28304
Qubit 4 定量スターターキット	ThermoFisher	Q33227
Qubit ssDNA Assay Kit	ThermoFisher	Q10212
RNA Gel Loading Dye (2X)	ThermoFisher	R0641
RNA Gel Loading Dye (2X)	ThermoFisher	R0641
RNase Inhibitor, Murine	Nex England Biolabs	M0314S
SuperScript IV 逆転写酵素	ThermoFisher	18090200
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain	ThermoFisher	S11494
T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase)	Nex England Biolabs	M0204S
T4 RNA Ligase 2, truncated	Nex England Biolabs	M0242S
TrackIt 50 bp DNAはしご	ThermoFisher	10488043
TruSeq Small RNA Library Prep Kit	Illumina	RS-200-0012/24/36/48	オプション
UltraPure グリコーゲン	ThermoFisher	10814010
XCell SureLock Mini-Cell	ThermoFisher	EI0001
XCell SureLock Mini-Cell	ThermoFisher	EI0001
ZR small RNA ladder	Zymo Research	R1090<

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