オープンソースマイクロプレート互換照明パネルのアプリケーション

Summary

マイクロプレート支援ピペッティングライトエミッタ(M.A.P.L.E.)は、マイクロプレートの手動調製のためのガイダンスを提供するために、マイクロチターウェルを系統的に照射するコンピュータ駆動デバイスです。 M.A.P.L.E.は、データ記録管理を自動化しながら、マイクロプレート調製の精度を向上させます。 さらに、マイクロプレートの品質を調べるのを助けたり、エラーの検出を助けたりすることができます。

Abstract

マイクロプレートは、小規模な実験室のベンチトップ操作と大規模なハイスループットスクリーニング(HTS)キャンペーンの両方で幅広いタスクのために、現代の実験室環境で一般的に使用されています。実験室の自動化はマイクロプレートの有用性を大幅に高めましたが、オートメーションベースの計測器が実現不可能で、費用対効果が高く、マイクロプレートフォーマットのニーズと互換性がないインスタンスが残っています。このような場合、マイクロプレートは手動で準備する必要があります。手動マイクロプレート操作の問題点は、サンプル操作の正確な追跡、データ記録の保持、品質管理(QC)検査に関連して、井戸のアーティファクトや書式設定エラーに関して多くの問題が発生する可能性があることです。マイクロプレートの密度が高くなるにつれて(すなわち、96ウェル、384ウェル、1536ウェル)、エラーを導入する可能性も大幅に増加します。 さらに、小さいベンチトップの実験室操作のために費用効果が大きい方法のサンプル処理の容易さそして正確さを改善する必要性がある。本明細損では、マイクロプレート支援ピペッティングライトエミッタ(M.A.P.L.E.)と呼ばれる半自動ピペッティングガイドとして機能するシステムについて説明する。 M.A.P.L.E.は、ハイスループットスクリーニングまたは実験室ベンチトップ操作におけるアッセイ開発のための化合物ヒットピッキングおよびマイクロプレート調製、ならびにマイクロプレートのQC/品質保証(QA)診断評価をサポートするための複数の用途を有しています。品質または適切な書式設定エラーを視覚化します。

Introduction

最近発表^{された1、}スクリプス^{リサーチ2}の鉛同定研究所は、マイクロプレート調製用のオープンソース照明パネルを開発し、マイクロプレート支援ピペッティングライトエミッタ(M.A.)と呼ばれるオープンソースの照明パネルを開発し、リリースしました。P.L.E.)。マイクロプレートの手動調製は、それらが化合物管理またはバイオアッセイのニーズのために作られるかどうかにかかわらず、マイクロプレートの密度が増加するだけでなく、劇的に増加するヒューマンエラーを起こしやすい。さらに、マイクロプレートのコンテンツ/フォーマットの適切な記録管理とデータロギングも、手動入力エラーを起こしやすくなります。ハイ スループット スクリーニング (HTS) オートメーション機能では、これらの問題は、自動化されたデータベース記録管理と統合されたコンピュータ駆動のロボット ワークステーションを使用して軽減されます。手動操作を最小限に抑え、書式設定やデータ記録エラーの可能性を減らします。しかし、オートメーションベースのインストルメンテーションが単に実現可能でないか、マイクロプレートのフォーマットのニーズと互換性がない場合が多く、手動による介入が必要です。さらに、マイクロプレート調製のスループット、精度、データ記録管理の自動化を向上させるために、小型でコスト効率の高い半自動デバイスを必要とする小規模な実験室での運用をサポートする必要もあります。

他のマイクロプレート照明システムが存在する一方で、それらはマイクロプレートフォーマットとその独自のフォーマットを選択するために限定された独自の商用ソリューション3、4、5、6、7ですクローズドソースの性質は、特殊な操作のためにこれらのデバイスを適応することを可能にするユーザー主導の変更を防ぎます。 M.A.P.L.E.は安価なオープンソースデバイスとして設計されており、ソースコードとすべてのデザインファイルを無料で^{オンライン8}で利用できます。表面マウントはんだ付け技術の知識を持つユーザーは、GitHubで利用可能なコードと設計ファイルを使用して独自のM.A.P.L.E.デバイスを組み立てることができるか、提供されたプリント回路基板(PCB)設計、3Dプリントエンクロージャコンピュータ支援を変更することができます。特定のニーズを満たすために、モデルとコードを設計します。ライトガイドPCBを製造するために必要な部品の完全なリストは補足表1および2で見つけることができ、ライトパネルの設計および実装に関する詳細は最近公開されたドキュメント¹.オープンソースファイルに基づいて組み立て済みのライトガイドPCBを購入したいユーザーは、^{オンライン9}に記載されているそれらを見つけることができます。

M.A.P.L.E.はマイクロプレートベースのフットプリントとマイクロ^{プレート10}の生体分子スクリーニング協会(SBS)仕様に一致するLEDからLEDへの間隔を持つ容易に制御可能な照明パネルをユーザーに提供します。M.A.P.L.E.は96および384ウェル密度のマイクロプレートを支え、ユーザーが望ましい構成、色および強度の井戸を照らすことを可能にするために開発された。これらの光パネルは、ピペッティング^操作11のためのマイクロプレートを照射するために使用することができ、教育およびデモンストレーションのためのマイクロプレート^{リーダー12、13}などの実験室のフォーマット操作または器械をシミュレートする目的。プロジェクトのオープンソースの性質により、ユーザーはパネル、ファームウェア、グラフィカルユーザーインターフェイス(GUI)ソフトウェアを簡単に変更して、新しい必要な機能をサポートすることができます。ガイダンスとデータ記録管理はコンピュータ駆動型であり、スプレッドシートと統合したり、データベース システムに移植したりできます。M.A.P.L.E.はプレーンテキストのコミカ区切りファイルで動作するように設計されているため、CSV形式のファイルをインポートまたはエクスポートできるスプレッドシートまたはデータベースソフトウェアは、M.A.P.L.E.で動作するように簡単に拡張できます。さらに、このシステムのために設計されていたプロジェクトエンクロージャはピペッティング操作の間にユーザーに向かってマイクロプレートを傾け、実験室のベンチの間にユーザーのためのより自然な姿勢を提供することによって人間工学を高める。M.A.P.L.E.システムの特定の運用機能には、(i)手動ピペッティングガイダンス用のマイクロプレート全体で単一のソースウェルと宛先を照らすことによって、カスタマイズされたプレートを準備する複合管理の取り組みを促進することが含まれます。電子記録の完了として保存することができるコンピュータスクリプトを介して支援されます。(ii) M.A.P.L.E. は、マイクロプレートの行または列を横切って任意の数のウェルを照らすことができます。これは、迅速なシリアル希釈ガイダンスまたはセレクトレプリケートコントロールの配置に最適です。(iii) M.A.P.L.E.は、実験室のトレーニングニーズを容易にしたり、サンプルおよび制御の配置や専用の適切な使用(例えば、エッジ効果バリアギャップ)に関する書式設定要件を強調するために、デモンストレーションモードで使用することができます。(iv) M.A.P.L.E.は、沈殿/結晶化、気泡、よく異種、空の井戸などのアーティファクトの視覚化を可能にするために、透明/半透明のウェルをバックライトすることができます。また、エンドユーザーがドキュメントのニーズに合わせてプレート画像を簡単に撮影できる

Protocol

1.半自動化された「プレートからプレート」サンプル転送製剤

1. スプレッドシート編集アプリケーションを使用して、ソースプレートと宛先プレートを含む図 1に示すように、CSV ファイルを生成します。生成される CSV ファイルには、次のヘッダー列がリストされている順序である Source_barcode が必要です。宛先_バーコード;ソース_ウェル;Dest_well;転送_ボリューム。
2. ヘッダー列の下には、必要なピペッティング操作 (サンプル転送) ごとに CSV ファイルに 1 行を含め、次の情報を含むようにしてください。
   1. Source_barcode: ソースマイクロプレートの英数字バーコード、例えば、S1007372;バーコードが関連付けられていない場合は、空白のままにします。
   2. 宛先バーコード: 宛先マイクロプレートの英数字バーコード(D0573282など)。バーコードが関連付けられていない場合は、空白のままにします。
   3. Source_well: ソースプレートから配管されるウェルの英数字行と列識別子(例えば、行HのH10(8^行目)、列10(ANSI/SLAS標準ウェル指定、例えば、A1、C10...)。
   4. Dest_well: 宛先プレートから配管される英数字の行と列識別子(例えば、行 A (1^行目)の A3、列 3 (ANSI/SLAS 標準ウェル指定、例えば、A1、C10...)。
   5. 転送ボリューム: source_barcode の source_well から宛先バーコードの dest_well に転送されるボリューム (数値と単位なし: 通常は μL)。
3. マイクロプレート補助ピペッティングライトエミッタプレートを開き、ライトガイドプログラム(Maple-LightGuide.exe)を開いて、図2に示すGUIアプリケーションをプレートします。
4. GUIの左上隅にある「チェリーピックファイルの選択」ボタンをクリックします。
5. 図 3に示すファイル ブラウザ ウィンドウを使用して、上記の手順 1.1 および 1.2 で生成された CSV ファイルに移動し、[開く]ボタンをクリックします。アプリケーションは、CSV ファイルの最初の行を解析し、ソース プレートと宛先プレートの対応するウェルを照らします。
6. 図 4に示す GUI の右上隅にある [前のウェル]ボタンと[次のウェル]ボタンを使用して、必要に応じて CSV ファイルを走査します。GUI は、以前に照らされた行を灰色でハイライト表示し、現在アクティブな行を茶色で強調表示します。
7. 必要に応じてピペッティング操作を実行し、ソースプレートのソースウェル間でサンプルを宛先プレートの宛先ウェルに転送します。M.A.P.L.E. 手のピペッティング操作の例を図 5に示し、図 4 および図 6に示す現在のユーザー ピペッティング ビューを比較します。ユーザーGUIに加えて、プレートバーコードは、照明パネルに取り付けられたLCDディスプレイを介して確認することができます。
8. CSV ファイルの最後に [次のウェル]ボタンを使用して続行します。新しい CSV ファイルを読み込むには、いつでもチェリーピックファイルを選択してクリックできます。プログラムを終了するには、GUIの右上隅にある赤いXをクリックすることができます。

2.並列転送とシリアル希釈のためのマルチウェルイルミネーション

1. シリアル希釈プログラム(Maple-SerialDilution.exe)を開いて、マイクロプレート補助ピペッティングライトエミッタ「シリアル希釈」アプリケーションを開きます。
2. 図 7および図 8に示す GUI を使用して、目的の滴定モード (列または行)、プレート密度、開始行(s) または列を指定します。GUI を使用すると、特定の行または列内のどの LED が照らされるかを制御する列または行マスクを指定することもできます。これにより、行または列全体を照らす代わりに、行または列内の LED のサブセットを照らできます。
3. [次へ]ボタンと[前へ] ボタンを使用して、最初の開始行または列からプレート内の最後の行または列まで、行または列を順番にステップスルーします。[次へ] または [前へ] ボタンをクリックするたびに、ライト パネルがマイクロプレートの対応する LED を点灯します。
4. 滴定シーケンスの終了に達するまで続行します。プログラムを終了するには、GUI の右上隅にある赤いXをクリックします。

3. 実験室研修:アッセイ開発とスクリーニングフォーマット技術

1. 96ウェルまたは384ウェルマイクロプレートをポータブルライトガイドに入れます。ポータブルライトガイドには、コンピュータとは別に使用するために必要なバッテリーとすべての電子機器が含まれています。これにより、ポータブルライトガイドをハンドヘルドモードで使用することができ、内蔵の押しボタンで制御してデモンストレーションモードを切り替えることができます。
2. ポータブル・ライト・ガイド・エンクロージャーの電源切りスイッチを使用して、システムの電源を入れます。
3. ポータブル ライト ガイドのモードを確認します。既定では、ポータブル ライト ガイドは既定のHTS デモモードに読み込まれ、図 9に見られるように一般的なアッセイ プレートの視覚的な表現をユーザーに提供します。このモードでは、ポータブルライトガイドの上部にある右の押しボタンスイッチを使用して、次のサンプルイルミネーションパターンを切り替えることができます。
   1. すべてのウェルは、アッセイの試薬分配をシミュレートするために赤色で照らされ、例えば、(培養中の懸濁細胞)。
   2. すべての井戸は、染料試薬の添加をシミュレートするために黄色で照らされます。
   3. ウェルの最初の列と最後の列は緑色に照らされ、残りの中間の「サンプルフィールド」カラムは、マイクロプレートリーダー上で読み取られているプレートを示すために青色に照らされました。サンプルフィールドのランダムウェルは、ヒットを表すために様々な強度の緑色を持ちます。
4. HTS デモモードと滴定デモモードの間でライト ガイドを切り替えるには、左の押しボタンスイッチを押します。これを行うと、ポータブルライトガイドをTitrationデモモードに切り替え、複合プレートで滴定を実行する方法をユーザーに視覚的ガイドとして提供します。ライトガイドが滴定デモモードに入ると、次のことが起こります。
   1. 列 3 および 13 のすべての井戸は黄色で照らされます。
   2. 右端の押しボタンスイッチの後続の押しボタンスイッチの後続の押しボタンは、例えば、(4および14、5および15など)順番に列を照らす。
   3. 列 12 と 22 に達した後に押しボタンを押すと、列 4-12 および 13-22 のウェルが、滴定を表す黄色の強度を減少して照らされます。
5. ライトガイドのデフォルト動作を変更するには、USBケーブルを介してコンピュータにポータブルライトガイドを接続し、プロジェクトGitHub^ページ8で見つけることができるArduino IDEを介してデフォルトのファームウェアを更新するための詳細な手順に従ってください。ファームウェアを更新することにより、これらのモードを変更して、他のシーケンスまたは LED セットを表示できます。

4. マイクロプレートにおけるアーティファクトの照性

1. 96ウェルまたは384ウェルマイクロプレートをポータブルライトガイドに入れます。
2. 左端の押しボタンスイッチを2回押して、ライトガイドをイルミネーションモードに切り替えます。
   注:このモードの実用的な使用例は、図10および図11で見ることができ、そこで化合物は溶液から沈殿し、マイクロプレートの底部で観察することができる。バックライト照明がなければ、沈殿物のほとんどは肉眼では見えませんが、M.A.P.L.E.バックライトはユーザーの検査や写真のドキュメントの沈殿物を明らかにします。
3. 適切な押しボタンを使用して、アプリケーションに必要に応じて定義済みの色のセットを切り替えます。ライトパネルは、右ボタンの各プッシュで順番に次の色にすべてのLEDをオンにします:赤、青、緑、オレンジ、白、紫、黄色と藍。
4. オプションの手順として、カメラまたはスマートフォンを使用して、照明付きプレートを撮影して、作業を記録または文書化します。

Results

M.A.P.L.E.プラットフォームは、96および384ウェルのマイクロプレートでウェルをさまざまなユーザー設定可能な方法で照らすことができ、各ウェルの色と光の強度を簡単かつ独立して制御できます。M.A.P.L.E.は、手動ピペッティング操作のエラーの機会を減らすことで、ユーザーが各井戸に必要な内容を含むという確信を高めてマイクロプレートを準備するのに役立ちます。プレート間のサンプルの転送とシリアル希釈プレートの調製(図12および図13に見られる例など)は、ユーザーが作業中に気を散らし、何を見失うか心配することなく達成することができます。ピペッティング操作は残ります。ピペッティング作業が完了すると、M.A.P.L.E.プラットフォームを使用してマイクロプレートを照らし、沈殿物、空の井戸、部分的に充填された井戸、気泡などの潜在的なアーティファクトを識別するのに役立ちます。マイクロプレートの作成時にこれらのアーティファクトを検出することにより、ユーザーは下流の実験室プロセスにそれらを提供する前にサンプルを改善するための措置...

Discussion

M.A.P.L.E.をオープンソースプラットフォームとしてリリースすることで、ユーティリティを提供するラボツールを導入しましたが、エンドユーザーの進化するニーズに合わせて簡単に拡張できます。ベンチトップマイクロプレートサンプル調製は、多種多様な実験室環境で行われる一般的なタスクであり、このタスクはM.A.P.L.Eなどの技術によって実証的に改善することができます。

M.A.P.L.E.プラットフォームは、将来のアプリケーションを念頭に置いて適応性を備えて特別に設計されています。各コンポーネント(電子照明パネル、ファームウェア、GUI、エンクロージャ)は、個別に使用するために抽出することができ、より大きなシステムまたはその任意の中間組み合わせの一部として使用される。例えば、3Dプリントプロジェクトエンクロージャは、単にベンチトップピペッティングの人間工学を向上させるために、照明パネルなしで使用することができます。照明パネルは、+5V制御信号、+5Vソースとグランド(GND)を生成することができる任意のシステムに接続することができる簡単な3線インターフェイスを持っています。ソフトウェア...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96または384ウェルマイクロプレート			https://en.wikipedia.org/wiki/Microplate
プレート支援ピペッティングライトエミッター			https://github.com/pierrebaillargeon/Microplate-Assistive-Pipetting-Light-Emitter
ピペッター			https://www.jove.com/science-education/5033/an-introduction-to-the-micropipettor
分光計	オーシャンオプティクス	USB-650赤潮