このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

超高性能液体クロマトグラフィーによる免疫グロブリンG N-グリカン分析

8K 閲覧数

⸱

DOI：

10.3791/60104

⸱

2020年1月18日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Key Laboratory of Clinical Epidemiology, School of Public Health, Capital Medical University, 2School of Public Health, Shandong First Medical University & Shandong Academy of Medical Sciences, 3School of Medical and Health Sciences, Edith Cowan University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

免疫グロブリンG(IgG)N-グリカンは、親水性相互作用クロマトグラフィーUPLCを用いて特徴付けられている。 また、IgG N-グリカンの構造は明確に分離されている。ここでは、研究設定で広く使用できるように、この実験方法の紹介です。

要約

グリコミックスは、疾患感受性、創薬、精密医療のための次世代バイオマーカーの発見に大きな可能性を秘めた、オミックスシステム研究の新しいサブスペシャリティです。代替IgG N-グリカンは、いくつかの一般的な慢性疾患で報告されており、臨床応用に大きな可能性を有することが示唆されている(すなわち、疾患の診断および予測のためのバイオマーカー)。IgG N-グリカンは、親水性相互作用クロマトグラフィー(HILIC)超高性能液体クロマトグラフィー(UPLC)の方法を用いて広く特徴付けられている。UPLCは、再現性と高い相対定量精度を備えた安定した検出技術です。さらに、IgG N-グリカンの構造が明確に分離され、血漿中のグリカン組成と相対的な存在量が特徴です。

概要

ヒトタンパク質のN-グリコシル化は、一般的かつ必須の翻訳後修飾1であり、比較的正確に疾患の発生および発症を予測するのに役立ち得る。その構造の複雑さのために、5,000以上のグリカン構造があり、疾患の診断および予測バイオマーカーとして大きな可能性を提供することが期待される2.免疫グロブリンG(IgG)に結合したN−グリカンは、IgGの機能に必須であることが示されており、IgG N-グリコシル化は、プロおよび抗炎症系3との間のバランスに関与する。微分IgG N-グリコシル化は、疾患の発症および進行に関与し、疾患病理に関与する素因および機能機構の両方を表す。IgG N-グリコシル化の炎症役割は、老化、炎症性疾患、自己免疫疾患、および癌4に関連している。

検出技術の開発に伴い、 以下の方法は、高スループットグリコミクスで最も広く使用されています:蛍光性相互作用クロマトグラフィー(HILIC)超高性能液体クロマトグラフィー(UPLC-FLR)、レーザー誘導蛍光検出による多重キャピラリーゲル電気泳動 (xCGE-LIF)、マトリックスアシストレーザー脱離/イオン化時間質量分析(MALDI-TOF-MS)、液体クロマトグラフィーエレクトロスプレー質量分析法(LC-ESI-MS).これらの方法は、低フラックス、不安定な結果、および低感度特異性の以前の欠点を克服しています5,6.

UPLCは、IgG N-グリコシル化と特定の疾患(すなわち、老化7、肥満8、脂質異常症9、II型糖尿病10、高血圧11、虚血性脳卒中12、およびパーキンソン病13)との関連を探索するために広く使用されている。上記の他の3つの方法と比較して、UPLCは以下の利点を有する5、14である。まず、相対的な定量分析方法を提供し、総面積正規化を伴うデータ分析により、各サンプルの比較性が向上します。第二に、機器のコストと必要な専門知識は比較的低いため、グリコシル化バイオマーカーの実装と臨床応用への変換が容易になります。ここでは UPLC の概要を紹介します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

議定書に含まれるすべての科目は、首都医科大学、北京、中国12の倫理委員会によって承認されています。書面によるインフォームド・コンセントは、研究の開始時に各被験者から得られた。

1. IgGの分離

  1. 結合緩衝液(リン酸緩衝生理食塩水、PBS):1x PBS(pH=7.4)、中和緩衝液:10x PBS(pH=6.6-6.8)、溶離剤:0.1Mギ酸(pH=2.5)、溶離液中和溶液:1M炭酸アンモニウム、貯蔵緩衝液を含む化学物質を調製する: 20%エタノール + 20 mM トリス + 0.1 M NaCl (pH = 7.4), タンパク質 G: 0.1 M NaOH + 30% プロパン-2-オールのための洗浄液.
    注: このプロトコルでは、pH のレベルが重要です。IgGの溶出は非常に低いpHを必要とし、酸加水分解によるシアル酸の損失の危険性がある。したがって、溶出は数秒以内に発生し、pHは急速に中性に回復し、IgGおよびシアル酸の完全性を維持する。
  2. サンプルを準備する:冷凍プラズマサンプルを解凍し、80 x gで10分間遠心分離し、タンパク質Gモノリシックプレートと上記の化学物質を室温で30分間残します(RT)。
  3. 100 μL サンプル (最初の故障を防ぐために 2x を検出するために使用できます) を 2 mL コレクション プレート (ここでは、合計 6 つの標準サンプル、1 つの制御サンプル [超純水]、および 89 個のプラズマ サンプルを 96 ウェル プレート用に設計し、ランダムに割り当てられました)をプレートに)
  4. サンプルを 1x PBS で 1:7 (v/v) 希釈します。
  5. 超純水200μL(繰り返し2倍)で0.45μmの親水性ポリプロピレン(GHP)フィルタープレートを洗浄します。
  6. 希釈したサンプルをフィルタープレートに移し、真空ポンプ(266.6-399.9 Paで真空圧を制御)を使用して回収プレートにサンプルを濾過します。
  7. タンパク質Gモノリシックプレートの調製
    1. ストレージ バッファを破棄します。
    2. 超純水2mL、1x PBSの2mL、0.1 Mギ酸の1mL、10x PBSの2 mL、1x PBSの2 mL(順次)でモノリシックプレートを洗浄し、真空ポンプを使用して流れる液体を除去します。
  8. 濾過したサンプルをIgG結合および洗浄用のタンパク質Gモノリシックプレートに移し、次いで1x PBSの2mLでモノリシックプレートを洗浄します(クリーニング2xを繰り返します)。
  9. 1 mLの0.1 Mギ酸でIgGを溶出し、真空ポンプで回収プレートにサンプルを濾過し、170μLの1M重炭酸アンモニウムを回収プレートに加えます。
  10. 吸収分光光度計(最適波長=280nm)を用いてIgG濃度を検出する。
    1. ソフトウェアを開き、タンパク質CY3モードを選択します。
    2. 超純水を2°L引き、画面にロードし、ソフトウェアの「ブランク」をクリックして画面をクリアします(1xを繰り返します)。
    3. 超純水を2°L引き、画面にロードし、ソフトウェアのサンプルをクリックして超純水を検出します。
    4. IgGサンプルを2μL引き出して画面にロードし、ソフトウェアの「サンプル」をクリックしてサンプルを検出します。
    5. 超純水を2°L引き、画面にロードし、ソフトウェアの「ブランク」をクリックして画面をクリアします。
    6. ソフトウェアを閉じます。
      注: IgG 濃度を計算する式は次のとおりです。

      CIgG = 吸光度 x 消滅係数 (13.7) x 1,000 μg/mL
  11. 抽出したIgGを60°Cのオーブンで乾燥させ、抽出したIgG(300μL抽出IgGを4時間抽出)に保存します。
    1. 濃度が1,000μg/mLを超える場合は、抽出されたIgGを300μL除去します。
    2. 濃度が500~1,000μg/mLの場合は、抽出したIgGを350μL取り除く。
    3. 濃度が200~500μg/mLの場合は、抽出したIgGを400μL取り除く。
    4. 濃度が200μg/mLより小さい場合は、抽出されたIgGの600 μLを除去します。
      注:IgGの濃度は、後続の検出のために>200 μg/mLであることが好ましいはずです。IgGの平均量は、最初のテストが失敗した場合に2倍にテストすることができる>1,200 μgであることが好ましいはずです。
  12. 再利用のためのタンパク質Gモノリシックプレートの洗浄
    1. 2mLの超純水、1mLの0.1 M NaOH(沈殿タンパク質を除去する場合)、4mLの超純水、1x PBS(順次)でプレートを洗浄し、真空ポンプを使用して流れる液体を除去します。
    2. 超純水2mL、30%プロパン-2-オール(結合疎水タンパク質を除去する場合)の2mL、超純水2mL、1x PBS(順次)の4mLでプレートを洗浄し、真空ポンプを使用して流れる液体を除去します。
    3. 1 mL のバッファー (20% エタノール + 20 Mm Tris + 0.1 M NaCl) でプレートを洗浄し、1 mL のバッファー (20% エタノール + 20 Mm Tris + 0.1 M NaCl) をプレートに追加し、プレートを 4 °C のままにします。

2. グリカンリリース

  1. 乾燥したIgGを準備し、1.33%SDS、4%イゲパル(光から離れて保存)、およびRTで5x PBSを含む化学物質を保存します。
  2. 250 ΜLの超純水で250U酵素を希釈してPNGase F酵素を調製します。
  3. IgGの変性
    1. 30°Lの1.33%SDSを加え、ボルテックスで混ぜ、サンプルを65°Cのオーブンに10分間移し、オーブンから取り出して15分間休ませます。
    2. 4%イゲパルの10 μLを加え、5分間振るインキュベーターの上に置きます。
  4. グリカンの除去と放出
    1. 5x PBSの20 μLと0.1モル/L NaOHの30-35 μLを加え、8.0のpHを調節し、ボルテックスで混合します。PNGase F酵素を4μL加え、ボルテックスで混ぜます。次いで、37°水浴中で18〜20時間インキュベートする。
    2. 放出したグリカンを60°Cのオーブンで2.5~3.0時間乾燥させます。
    3. さらに測定するまで、放出されたグリカンを-80°Cで保存します。
      注: この手順は重要です。グリカン放出の鍵は、その効率を最大化するためにPNGase F酵素の活性を改善することです。

3. グリカンの表示と精製

  1. 2-アミノベンズアミド(2-AB)標識試薬を0.70mgの2-AB、10.50μLの酢酸、6mgのシアノボロ水素ナトリウム(NaBH3CN)、24.50μLのジメチルスルホキシド(DMSO)(総体積=35μL)で調製します。次に、酢酸、2-AB、および NaBH3CN を DMSO に順番に追加します。
  2. 2-AB標識試薬の35μLを使用してグリカンにラベルを付け、標識されたグリカンを5分間発振器に移し、65°Cで3時間オーブンに移し、30分間RTに移す。
    注: グリカンラベリングステップ全体を光から保護しながら実行する必要があります。
  3. 0.2μm GHPフィルタープレートを200°Lのエタノール700°L、200°Lの超純水、200μLの96%アセトニトリル(4°)で除去し、真空ポンプを使用して廃棄物を除去します。
  4. 2-AB標識グリカンの精製
    1. 2-AB標識グリカンに100%アセトニトリルの700 μLを加え、5分間振とうインキュベーターに移します。
    2. 134 x g での遠心分離は5 分間 (4 °C)。
    3. サンプルを0.2μm GHPフィルタープレートに2分間移し、真空ポンプを使用して濾液(流動液体)を除去します。
  5. 2-AB標識グリカンを96%アセトニトリル(4°)の200°Lで洗浄し、真空ポンプ5x-6xを使用して濾液(流動液体)を除去します。
  6. 超純水3xの100°Lで2-ABラベルグリカンをエルテ。
  7. 2-AB標識グリカンをオーブンに移し、60°Cで3.5時間乾燥させます。
  8. さらに測定するまで、ラベル付けされたN-グリカンを-80°Cに保存します。

4. 水酸相互作用クロマトグラフィーとグリカンの分析

  1. UPLC機器のコンディショニングと移動相の準備
    1. 溶媒A:100 mMアンモニウムギ酸(pH=4.4)、溶媒B:100%アセトニトリル、溶媒C:90%超純水(10%メタノール)、および溶媒D:50%メタノール(超純水)を含む移動相を調製する。
    2. モバイルフェーズを制御するソフトウェアを開きます。
    3. 流量0.2mL/分(50%溶剤Bおよび50%溶媒C)で30分間のバランスをとり、流量0.2mL/分(25%の溶媒Aおよび75%の溶媒B)で20分間バランスをとり、次いで流量0.4 mL/分のバランスをとります。
  2. 標識したN-グリカンを100%アセトニトリルと超純水の混合物の25°Lで2:1の比率(v/v)で溶解します。次いで、134×gで5分間(4°)で遠心分離機を行い、標識されたN-グリカンの10μLをUPLC機器にロードする。
  3. 標識されたN-グリカンを流量0.4mL/分で、75%~62%のアセトニトリルの直線勾配で25分間分離します。次いで、60°CのUPLC上でデキストランキャリブレーションラダー/糖ペプチドカラムによる分析実行を行う(ここでは、サンプルを注射前に4°Cに保った)。
  4. 330 nmおよび420 nmの励起および発光波の長さでN-グリカン蛍光をそれぞれ検出する。
  5. ピーク位置と保持時間に基づいてグリカンを統合します。
  6. 各グリカンピーク(GP)/すべてのグリカンピーク(GP)(パーセンテージ、%)次のように: GP1: GP1/GP*100, GP2: GP2/GP*100, GP3: GP3/GPs*100 など

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

図1に示すように、IgG N-グリカンはピーク位置と保持時間に基づいて24個の初期IgGグリカンピーク(GP)に分析した。N-グリカン構造は、以前の研究(表1)15に従った質量分析検出を通じて利用可能である。結果が同等であることを確認するために、各ピークのグリカン量を総集積面積に対するパーセンテージで表した総面積正規化が適用された。

この方法の再現性および安定性を評価するために、標準試料を6回並行して試験した。表2に示すように、24 GPの変動係数(CV)は1.84%-16.73%、15(62.50%)そのうち10%を下回った。比率が比較的小さい GP (≤1.16%)高い測定誤差(CVの10%以上)を示した。さらに、76個体から組み合わせたI...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

UPLCは相対定量分析方法5、15として機能する。この結果は、UPLCが再現性と相対的な定量精度を備えた安定した検出技術であることを示しています。各ピークのグリカンの量は、UPLCを使用して総統合領域のパーセンテージとして表されます。相対定量は、試験サンプルの比較性を向上させます。さらに、96ウェルタンパク質Gプレートを使用して、一度に96サンプルでIgGを精製し、高スループット検出を行います。IgGに結合するタンパク質Gの能力は、タンパク質Aの能力よりも大きく、以前の研究15、16で説明したように。

また、IgG N-グリカンの構造は明確に分離されている。由来のIgGグリカンは、初期IgG N-グリカンによって計算されるガラクトシル化、シアリル化、二分GlcNAc、およびコアフコシル化のレベルを記述する。以前の研...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者たちは何も開示する必要はない。

謝辞

この研究は、中国国立自然科学財団(81673247&81872682)とオーストラリア・中国共同補助金(NH&MRC - APP1112767 -NSFC 81561128020)からの助成金によって支援されました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2-アミノベンズアミド、2-ABシグマ、中国
96ウェル収集プレートAXYGEN
96ウェルフィルタープレートPol0.45 um GHP
96ウェルモノリシックプレートBIA セパレーション
96ウェルプレートローターEppendorf Co., Ltd, GermanyT_1087461900
Aceticacid Sigma、中国
アセトニトリルHuihai Keyi技術有限公司、中国
重炭酸アンモニウムShenggong生物工学有限公司、中国
ギ酸アンモニウム北京Minruida技術有限公司
コンスタントシェーキングインキュベーター/ロッカーZhicheng分析機器製造有限公司、中国ZWY-10313
デキストラン校正はしご/糖ペプチドカラムWatts技術有限公司、中国BEHカラム
ジメチルスルホキシド(DMSO)シグマ、中国
リン酸二ナトリウムShenggong生物工学有限公司、中国
電気オーブンテスター機器株式会社202-2AB
Empower 3.0Waters technology Co., Ltd, America
EthanolHuihai Keyi Technology Co., Ltd, 中国
ギ酸シグマ, 中国
GlycoProfile 2-AB ラベリングキットシグマ, 中国
HClJunrui Biotechnology Co., Ltd, China
高速遠心分離機Eppendorf Co., Ltd, ドイツ5430
IgepalSigma, China
低温遠心分離機Eppendorf Co., Ltd, ドイツ
低温冷蔵庫Qingdao Haier Co., Ltd
マニホールド 96 ウェル プレートワット技術株式会社、中国186001831
メタノールHuihai Keyi技術有限公司、中国
Milli-Q純水メーターMillipore株式会社、アメリカアドバンテージA10
NaOHShenggong生物工学株式会社、中国
PHテスターザルトリウス株式会社、ドイツPB-10
リン酸緩衝生理食塩水、PBSShenggong生物工学Co.、株式会社、中国
ピペットEppendorf株式会社、ドイツ4672100、0.5-10μL&10-100μ;L&20-200μL&1000μ;l
PNGase F酵素シグマ、中国
リン酸二水素カリウムShenggong生物工学有限公司、中国
Propan-2-olHuihai Keyi技術有限公司、中国
SDSシグマ、中国
塩化ナトリウムShenggong生物工学有限公司、中国
シアノ水素化ホウ素ナトリウム(NaBH3CN)シグマ、中国
分光光度計上海元渓計器有限公司B-500
トランスファー液体ガンスマーフェル科学技術有限公司、中国4672100
トリス・アムレスコ、アメリカ
超低温冷蔵庫サーモ株式会社、アメリカMLT-1386-3-V;MDF-382E
超高速液体クロマトグラフィーWatts technology Co., Ltd, ChinaAcquity MLtraPerformance LC
Vacuum PumpWatts technology Co., Ltd, China725000604
Volatilizing machine/DryerEppendorf Co., Ltd, GermanyT_1087461900
VortexChangzhou Enpei instrument Co., Ltd, ChinaNP-30S
ウォーターバステスター機器株式会社DK-98-IIA
計量天秤上海Jingke科学機器有限公司MP200Bの

参考文献

  1. Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. Glycomics, glycoproteomics and the immune system. Current Opinion in Chemical Biology. 16, 214(2012).
  2. Cummings, R., Pierce, J. M. The Challenge and Promise of Glycomics. Chemistry Biology. 21 (1), (2014).
  3. Shade, K. T. C., Anthony, R. M. Antibody Glycosylation and Inflammation. Antibodies. 2, 392(2013).
  4. Gudelj, I., Lauc, G., Pezer, M. Immunoglobulin G glycosylation in aging and diseases. Cellular Immunology. 333, 65(2018).
  5. Huffman, J. E., et al. Comparative performance of four methods for high-throughput glycosylation analysis of immunoglobulin G in genetic and epidemiological research. Molecular Cellular Proteomics. 13, 1598(2014).
  6. Stockmann, H., Adamczyk, B., Hayes, J., Rudd, P. M. Automated, high-throughput IgG-antibody glycoprofiling platform. Analytical Chemistry. 85, 8841(2013).
  7. Kristic, J., et al. Glycans are a novel biomarker of chronological and biological ages. Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences Medical Sciences. 69, 779(2014).
  8. Nikolac, P. M., et al. The association between galactosylation of immunoglobulin G and body mass index. Progress in Neuropsychopharmacology Biological Psychiatry. 48, 20(2014).
  9. Liu, D., et al. The changes of immunoglobulin G N-glycosylation in blood lipids and dyslipidaemia. Journal of Translational Medicine. 16, 235(2018).
  10. Lemmers, R., et al. IgG glycan patterns are associated with type 2 diabetes in independent European populations. Biochimica Biophysica Acta General Subjects. 1861, 2240(2017).
  11. Wang, Y., et al. The Association Between Glycosylation of Immunoglobulin G and Hypertension: A Multiple Ethnic Cross-Sectional Study. Medicine (Baltimore). 95, e3379(2016).
  12. Liu, D., et al. Ischemic stroke is associated with the pro-inflammatory potential of N-glycosylated immunoglobulin G. Journal of Neuroinflammation. 15, 123(2018).
  13. Russell, A. C., et al. The N-glycosylation of immunoglobulin G as a novel biomarker of Parkinson's disease. GLYCOBIOLOGY. 27, 501(2017).
  14. Bones, J., Mittermayr, S., O'Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation. Analytical Chemistry. 82, 10208(2010).
  15. Pucic, M., et al. High throughput isolation and glycosylation analysis of IgG-variability and heritability of the IgG glycome in three isolated human populations. Molecular Cellular Proteomics. 10, M111(2011).
  16. Berruex, L. G., Freitag, R., Tennikova, T. B. Comparison of antibody binding to immobilized group specific affinity ligands in high performance monolith affinity chromatography. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24, 95(2000).
  17. Ren, S., et al. Distribution of IgG galactosylation as a promising biomarker for cancer screening in multiple cancer types. Cell Research. 26, 963(2016).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

IgG N Protein G F 2 UPLC
超高性能液体クロマトグラフィーによる免疫グロブリンG N-グリカン分析
お問い合わせ
図書館への推薦

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。