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方法論記事

キセノプス・レービス胚における眼芽へのDNAのマイクロインジェクションとGFPのイメージングは、無傷で光学軸軸樹園を発現し、生きているキセノプス・タマジャクシ

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DOI：

10.3791/60123

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2019年9月4日

 ,  , 
1College of Osteopathic Medicine, Touro University California

この記事について

サマリー

このプロトコルは、DNA/DOTAP混合物を1日齢のXenopus laevis胚の眼芽にマイクロインジェクションする方法、およびテクター中脳における視神経軸軸樹園を発現する個々の緑色蛍光タンパク質(GFP)を画像化して再構築する方法を示すことを目的としています。無傷で、生きているキセノプスオタマジャクシ。

要約

水生カエルXenopus laevisのオタマジャクシの主な視覚投影は、神経結合の発達を調節するメカニズムを研究するための優れたモデルシステムとして機能する。レティノテクター投影の確立の間、光学軸が目から伸び、彼らの標的組織、視体に到達するために脳の異なる領域をナビゲートする。光学軸がテクタムに入ると、彼らはテクタム内のターゲットインターニューロンで行うことができるシナプス接続の数を増やすために機能するターミナルアーバーを精巧に作ります。ここでは、キセノプス胚における光ニューロン(再生神経節細胞)において、緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードするDNAを発現する方法と、機能低下遺伝子構築物を発現する方法について述べる。1日齢の胚の眼帯にDNA/リポフェクション試薬をマイクロインジェクションし、外因性遺伝子を単一または少数の光学ニューロンで発現させる方法について説明する。遺伝子をGFPでタグ付けするか、GFPプラスミドと共に注入することにより、分子シグナル伝達を変化させた個々の光学ニューロンの末端軸索アーバーは、数日後に生きているXenopusオタマジャクシとその形態をそのままの脳に直接画像化することができる。定量化できます。このプロトコルは、生体内の光学軸ゾン樹木化の開発の根本にある細胞自律分子機構の決定を可能にする。

概要

神経系の発達中に、シナプス前ニューロンの軸は、彼らのターゲット領域に到達するために脳の多様な領域をナビゲートします。軸が標的組織に侵入すると、シナプス標的ニューロンとのシナプス結合を確立します。多くの種類のニューロンでは、軸が端子分岐またはアーバー1のネットワークを詳述することによって行うことができるシナプス接続の数と空間範囲を増加させます。水生カエルXenopus laevisのオタマジャクシの網状粘薬投影は、末端軸ゾンの樹木化とシナプス接続性2、3、4の基礎となるメカニズムを調べるための強力な脊椎動物モデルです。.正常および変化した分子シグナル伝達を有する視神経軸軸アーバーを発現する個々のGFPは、無傷で直接観察することができ、生きているキセノプスオタマジャクシ5、6、7、8。少数の光学ニューロンで遺伝子の全長または切り捨てバージョンと一緒にGFPを単独で表現するために、我々は1日古いXenopus胚9の眼帯にDNAのマイクロインジェクション/リポフェクションを含む技術を使用し、10.この技術は、もともと若いキセノプスオタマジャクシにおけるオプティック軸線の経路発見のメカニズムを研究するために開発されたもので、それ以来、光学軸ゴンの基礎となる細胞自律分子機構を決定するために私たちや他の人によって適用されています。キセノプスオタマジャクシ5、6、7、8、9、10のアーボライゼーション。

少数の光学ニューロンで外因性遺伝子を発現させる代替技術は、他のモデル種、ならびにX.laevisで開発されている。しかし、これらのアプローチのそれぞれは、キセノプス胚の眼帯におけるDNA/リポフェクション試薬のマイクロインジェクションと比較した場合の課題と限界を提示する。マウスでは、トランスジェネシスは少数の光学ニューロンで遺伝子を発現するために使用することができるが、トランスジェニックマウスの生成は、多くの場合、望ましくない副作用を有する高価かつ時間がかかり、トランスジェニックマウスが存在する。視神経ニューロンで外因性遺伝子を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュは、初期切断段階胚12にプラスミドを注入することによっても作成することができる。しかし、このプロセスは、ゼブラフィッシュ幼虫12の光学ニューロンにおけるモザイクパターンで遺伝子を発現する特定のプロモーターのクローニングを必要とする。トランスジェニックゼブラフィッシュにおける視細胞ニューロンにおける外因性DNAの発現頻度もやや低い(<30%)DNA/リポソーム試薬をマイクロ注入したキセノプスオタマジャクシと比較して(30−60%)12.ovoエレクトロポレーションでは、ひよこ13の少数の光学ニューロンで遺伝子を発現するためにも使用されている。しかし、この手順は、光学軸ゾンの植樹は、生きているひよこ胚をそのままに画像化することができないため、光学投影を確立するメカニズムを完全に特徴付けることができなかった。最後に、いくつかの研究室は、Xenopusオタマジャクシ14、15の少数の光学ニューロンに遺伝子をトランスフェクトするためにエレクトロポレーションを使用しています。しかし、エレクトロポレーションは、DNA/リポフェクション試薬をXenopus胚の眼芽にマイクロインジェクションするために使用される以上の装置とプロトコル(刺激器、電極、空間および時間的パターン)の最適化を必要とします。

我々らは以前、Xenopus胚の眼帯にDNAのマイクロインジェクション/リポフェクションの技術を使用して、光軸ゾン樹盤化5、6を確立する細胞自律シグナル伝達機構を決定した。7,8.我々は当初、キセノプスオタマジャクシ5、6における視薬軸樹園におけるカドヘリンおよびWntアダプタータンパク質β-カテニンの機能を解剖するためにこのアプローチを用いた。ある研究では、β-カテニンとPDZへの結合が、それぞれ生体内の視軸樹園を始め、形成するために必要であることを示した。第2の報告では、α-カテニンおよびGSK-3βに対するβ-カテニン結合ドメインが、腹部視軸軸樹園6の突起パターンを逆に調節することを実証した。さらに最近では、Xenopusオタマジャクシ7における視薬軸樹園の形態学的特徴を調節する際に、Wnt因子、腺腫性ポリポシス大腸菌(APC)の役割を同定した。β-カテニン安定性および微小管組織を個々の光学ニューロンにおけるGFPと共に調節するAPCのN末端および中央ドメインを共発現することにより、これらのAPC相互作用ドメインの共有および明確な役割を分岐数で決定し、長さ、および生体内7の光学軸軸のアーバーの角度。別の実験室では、ブセノプスオタマジャクシ8の光学軸軸樹園におけるBDNF受容体TrkBによるシグナル伝達のための細胞自律的役割を決定するために、マイクロインジェクション/リポフェクション技術を使用した。この群は、生体内8における個々の光学軸軸高アーバーにおける優勢陰性TrkB摂動およびシナプス成熟の発現を示した。全体的に、Xenopusの脂肪形成技術は、すでにネイティブ環境における視認軸分岐における異なる遺伝子の特定の役割を明らかにしている。

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プロトコル

ここに記載されているすべての方法は、トゥーロ大学カリフォルニア州の機関動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています(プロトコル#TUCA003TE01X)。

1. X. レービス胚の取得

  1. ヒト絨毛性ゴナドトロピン(HCG)を用いた雄と雌の成人カエルのペアの自然交配によってX.laevis胚を得る、HCGでプライミングされた雌の成人カエルから流された卵の体外受精によって、または直接注文することによって(表材料)。
  2. 室温で2%のシステイン溶液で得られた脱ゼリー胚(材料の表)16.
    1. 大きなペトリ皿に50−100個の胚を集める。胚が入っている溶液をデカントするか、プラスチック転写ピペットを使用して取り除きます。胚を含む皿に2%システイン溶液(25 mL ddH2Oで0.5gシステイン、pH~8.0)を加えます。
    2. 胚のゼリーコートが落ち、胚が皿の中央に集まるまで、システイン溶液中の胚を含むペトリ皿を穏やかに旋回します(−10分)。この時点で、ゆっくりとゆっくりと廃棄物ビーカーにシステイン溶液を注ぎます。システイン溶液と一緒に廃棄物ビーカーにあまりにも多くの胚を注ぐしないように注意してください。
    3. 10%改変されたマークのリンガー溶液(MMR)またはその他の適切な溶液(例えば、変更されたバース溶液、MBS)でペトリ皿6xの胚をすすいで、溶液が交換されるたびに皿を旋回させる。
  3. 胚を発達段階22−2417に達するまで10%MMRで培養する。キセノプス胚は、15−25°Cの温度でインキュベートすることができる。胚の発達速度は、それらが17でインキュベートされる温度に依存する。
    注:カタログから注文されたキセノプス胚は、通常、発達段階20−24で実験室に到着するので、すぐに脱ジェリとマイクロ注入することができます。

2. DNAプラスミドの調製とDNA/DOTAP混合物の作製

  1. サブクローンDNA発現は、Xcs2+またはpCS2+MTまたはその誘導体(もともとD.ターナーおよびR.Ruppによって構築された)5、6、7に構築される。pCS2+ベクターは、カエルの遺伝子発現を促進する改変サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターを含有する。
  2. GFPおよび/または関心のある遺伝子を含むpCS2プラスミドを、標準的な手順に従ってミニプレップキット(材料の表)で増幅します。miniprepプロトコルの最終溶出工程では、DNAをddH2 Oに順次溶出し、最終的な濃度を>1 μg/μLで得た。
  3. すべてのpCS2プラスミドを-80°Cで保存し、マイクロインジェクション/リポフェクション実験を行う準備ができるまで、すなわち、胚が発達段階にある場合は22−24を保存する。
  4. DNAプラスミドを解凍し、室温でリポファクテックする。リポフェクションの直前に、簡単に遠心分離DNAプラスミド。これは、微小キャピラリーピペットの先端を詰まらせる可能性のあるDNA/DOTAP混合物中に沈殿物が形成されるのを防ぐことができます。
  5. DNAプラスミドをDOTAPリポソームトランスフェクション試薬(材料の表)と1:3(w/v)比9,10で組み合わせます。例えば、2 μgのDNAを1.5mLマイクロ遠心分離管に移し、DOTAPの6 μLを加えるか、マイクロ遠心管に3μgのDNAを移し、DOTAPの9μLを加えます。
  6. DNAとDOTAPを組み合わせたら、マイクロ遠心管を軽くフリックして溶液を混合します。DNA/DOTAP溶液は、混合後にわずかに不透明になるはずです。
  7. 2つのプラスミドを一緒にリポフェックする場合(例えば、2番目のpCS2プラスミドを含む2番目のpCS2プラスミドを有する遺伝子の切り捨てまたは全長バージョンを含む)、最初に2つのプラスミドを組み合わせます(両方を短時間遠心分離した後)1:1の比率で追加します。DOTAP の比率は 1:3 (w/v) です。たとえば、pCS2-GFP の 1 μg と 2 番目の pCS2 プラスミドの 1 μg を組み合わせ、DOTAP の 6 μL を追加します。
    注:研究は、これらの発達段階でキセノプス胚の眼帯に2つのプラスミドの脂肪の脂肪が個々の光学ニューロン9、10における共発現をもたらすことを示している。

3. DNA/DOTAPを用いるマイクロインジェクション針の装填

  1. 引っ張られたガラスのマイクロキャピラリーピペットの先端を細かい鉗子でそっと切り取ります(材料の表)。
  2. マイクロピペットの切り取られた先端に小さな一滴のミネラルオイルが現れるように、マイクロフィルを使用してガラスマイクロキャピラリーピペットをバックフィルします。マイクロキャピラリーピペットをミネラルオイルで半分に充填します。
  3. インジェクターに接続された適切な注入ホルダーに、ミネラルオイルで満たされた引っ張られたガラスマイクロキャピラリーピペットをロードします。インジェクター(材料のテーブル)を使用する場合は、マイクロキャピラリーピペットをロードする前に、プランジャーを途中で排出します。マイクロキャピラリーピペットがインジェクターにしっかりと取り付けられたら、プランジャーを完全に伸ばして、マイクロキャピラリーピペットがインジェクターに強く取り付けられ、プランジャーの延長に伴って動かないようにします。
  4. DNA/DOTAP混合物の3 μL滴をパラフィン紙の切り分け四角(1インチ正方形)シートに移します。
  5. ステレオ解剖顕微鏡の下で、ガラスマイクロキャピラリーピペットの先端をDNA/DOTAPドロップに移動します。
  6. 注射装置の充填オプションを使用して、ガラスマイクロキャピラリーピペットにDNA/DOTAPドロップをゆっくりと吸い込みます。液体がマイクロキャピラリーピペットにロードされると、ドロップが小さくなります。DNA/DOTAP溶液のわずかな不透明性のために、鉱物油とDNA/DOTAP溶液の境界はガラスマイクロキャピラリーピペットに見えるはずです(図1)。必要に応じて、マイクロキャピラリーピペットの充填を定期的に停止し、ガラスマイクロキャピラリーピペットの圧力を再較正できるようにします。

figure-protocol-1
図1:微小キャピラリーピペットの画像。画像は、注射装置上の微小キャピラリーピペットを示し、前(A)、および(B)DNA/DOTAPで充填した後である。開いている矢印、マイクロキャピラリーピペット(A、B)のプランジャーの先端。閉じた矢印は、充填された微小キャピラリーピペット(B)における鉱物油とDNA/DOTAPの間の線である。スケールバー = 1 mm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

4. 1日古いキセノプス胚の眼芽にDNA/DOTAPをマイクロ注入

  1. 0.1x MMRで満たされた10mmペトリ皿で細かい鉗子を持つ10段階20−24キセノプス胚を手動で逸脱する。胚を傷つけないように、ウエストのビテリンエンベロープをつかみます。実験者の左右の手の両方に鉗子を持つ、ビテリンエンベロープの泡をポップし、ビテリンエンベロープから胚を解放します。ビテリンの封筒を取り除くときに胚を傷つけないように注意してください。
    注:ステージ20から始まり、キセノプス胚は、胚の前半分と後部半分の間にインデントまたは「ウエスト」を発症する。このウエストは、この位置でビテリンエンベロープと胚の間にギャップを形成することができます。
  2. 5-10脱逸ステージ22−24胚を1x MMRで満たされた10mmペトリ皿に移すには、カットチップ付きのプラスチック転写ピペットを使用します。
    注:1x MMRのより高い塩溶液はマイクロ注入から生じる穿刺創傷の治癒を促進する。
  3. 立体顕微鏡の下で、それぞれの手に鉗子でペトリ皿の逸脱した胚の1つをつかみ、その前極が視野に向けられるように胚を配置する。胚が横に横たわっていて、その眼同種(左または右)の1つが上向きに向かるように、胚の向き。
  4. 立体顕微鏡の下で、実験者の非支配的な手に鉗子で胚を保持し、実験者の支配的な手で、ガラスマイクロピペットの先端を眼芽に導入する(腹部または背部側から、半分に応じて)現在注入されている胚は、表皮のすぐ下にある(図2)。DNA/DOTAP溶液の70−210 nLの間に注入する。これは、インジェクタが設定されているパルスの大きさに応じて、いくつかのパルスで行うことができます(通常70 nL)。
    注:注射の深さは、光学ニューロンへの脂肪フェクションのために非常に重要です.マイクロキャピラリーの先端の位置がアイブドに非常に表面的に挿入された場合、マイクロインジェクションに続いて、アイバッドの上に灰色の表皮が膨らみます。位置が深すぎると、灰色の眼帯は変化を示せず、光学ニューロンにおけるDNAの発現頻度は低くなります。
  5. 胚を回し、胚の反対側の眼芽に同じマイクロインジェクションを実行します。
  6. 各実験で6−10(またはそれ以上)胚の両方の眼芽を注入する。
  7. マイクロインジェクションの後、創傷治癒を容易にするために約30分間1x MMRのペトリ皿に胚を貯蔵する。
  8. 30分後、注入された胚を0.001%の漂白剤(フェニルチオカルバミド)で0.1x MMR溶液に移し、色素沈着を減らす。胚を約5日間培養し、胚がステージ46−4716でオタマジャクシに成長するまで。

figure-protocol-2
図2:マイクロインジェクションの眼芽領域の境界。発達段階22/23におけるX.laevis胚の概略図(A)および光顕微鏡(B)は、マイクロインジェクション(赤色ハイライト)を標的とすべき眼芽領域を示す。スケールバー = 1 mm. パネルAはZahnら18から変更されました。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

5. 無傷で光学軸軸樹園を発現するGFPのイメージング、生きたオタマジャクシ

注:DNAでリポフォックされたオタマジャクシが発達段階46−47に達すると、イメージングの準備が整います。

  1. イメージングの前に、オタマジャクシは麻酔を受ける必要があります。オタマジャクシを麻酔するには、10mmペトリ皿でddH2Oで0.02%トリカイン溶液にリポフェックオタマジャクシを移します。オタマジャクシが動かなくなるまで5~10分待ちます。オタマジャクシがステレオ解剖顕微鏡で心臓の鼓動を観察して、まだ生きていることを確認します。
  2. ガラススライドの上にカスタムメイドのシリコーンチャンバーに麻酔されたオタマジャクシを1つ置き、カバースリップでシールします。オタマジャクシは、頭の片側(左右)が上向きに傾き、カバースリップにほとんど触れないように少し傾く必要があります。
  3. 光学軸高アーバーを発現するGFPの低倍率で上方に傾いているオタマジャクシの後部皮中脳の半分をスクリーニングする。
    注:蛍光照明とアポクロマティック対物レンズ(材料表)を備えた広視野直立顕微鏡を使用して、蛍光アーバーのスクリーニングを行うことができます。
  4. テクタル半球が光学軸軸アーバーを発現する1~3つのGFPの間に含まれている場合は、高コントラスト40倍の空気長距離目標を使用して、これらのアーバーのZシリーズの画像をキャプチャします(材料の表)。各軸軸アーバーについて、1.5 μm間隔で10−20 zシリーズスライスをキャプチャします。
  5. テクタル中脳の反対側に軸ゾンアーバーを表示するには、シリコンチャンバにオタマジャクシをリロードして、反対側に傾き、カバースリップでシールします。次に、手順 5.3 と 5.4 を繰り返します。

6. 視軸樹園形態の再構成と定量

  1. 光軸アーバーを表す 1 ~ 3 つの GFP を含む画像スタックを選択します。
  2. グラフィック編集ソフトウェア(材料の表)のフリーハンド描画ツールを使用して、各Zスライスに表示される各光学軸軸アーバーの部分をトレースします。各Zスライスで明らかな各アーバーの部分をトレースすると、アーバーの正確な2D投影が作成されます。異なる色は、光学軸軸アーバーを発現する別個のGFPをトレースするために使用することができます。
  3. 必要に応じて元のZシリーズの画像を参照して、軸線アーバーの2D再構成に関するすべての形態測定を行います。イメージJソフトウェア(材料の表)を使用して、分岐の数(すなわち、分岐先端または分岐点の数)、総アーバー枝の長さ、枝ごとの長さ、アーバーの長さと幅、アーバーの全体的な形状(L/W)などの形態パラメータを測定します。比率、円形度)、および枝の角度7.

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結果

この記事で説明するプロトコルは、1~10個の光学軸軸アーバーでGFP(単独または追加のDNA構築物と一緒に)を発現する注入されたXenopus胚の30−60%の成功率をもたらす。図3では、最近発表された研究7から無傷のXenopusオタマジャクシ中のコントロールおよび変異型視軸軸アーバーを発現するGFPの代表的な共焦点画像を示す。本研究では、APC(APCNTERMおよびAPCβ-cat)の2つのドメイン変異体をpCS2プラスミドにクローンし、これらのプラスミドをpCS2-GFP標識プラスミドと共に1日前のキセノプス胚の眼芽に注入した。図4は、分岐数、総アーバー枝長、枝の平均長さを含む、コントロールおよびAPC変異軸軸樹園の再構成に関して行ったいくつかの定量的測定の結果を示しています。

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ディスカッション

本稿では、単一または少数の光学ニューロンで外因性DNA構築物を発現する方法と、カエルXの生きているオタマジャクシをそのまま正常かつ変化した分子シグナル伝達で視体軸軸アーバーを発現する個々のGFPを画像化する方法を示す。 .ラエビス.また、生体内で撮影した画像から光学軸軸アーバーを発現するGFPの形態を再構築・定量化する方法についても説明する。少数の光学ニューロンで外因性DNAプラスミドを発現させるには、DNA/リポフェクション試薬混合物を1日前のキセノプス胚の眼帯原始にマイクロ注入し、クリスティン・ホルトの研究室で最初に開発された技術を用いて光学を研究した。若いオタマジャクシ9、10、19、20、21の軸ゾンパスファインディング。我々と他の人はまた、このDNAマイクロインジェクシ...

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開示事項

著者は何も開示していない。

謝辞

私たちの研究を支援してくださったトゥーロ大学カリフォルニア大学オステオパシー医学カレッジに感謝します。私たちは、研究室でこのマイクロインジェクション技術を実装するのを助けた研究室の前の学生(エスター・ウー、グレゴリー・ペン、テグン・ジン、ジョン・リム)を認めます。私たちは、ゼノプス胚のこのDNAマイクロインジェクション/リポフェクション技術が最初に開発された研究室で、クリスティン・ホルト博士に感謝しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
3.5インチマイクロピペットドラモンドサイエンティフィック3-000-203 - G/X
μ-managerソフトウェア(バージョン1.4)Vale Labwww.micro-manager.org
CCDカメラサイオンコーポレーションCFW-1312 M
Chorulon (Human Chorionic Gonadotropin)AtoZ Vet SupplyN/A
CysteineSigma-Aldrich168149-100G
DOTAPSigma-Aldrich11202375001
Dumont Forceps #5Fine Science Tools11250-10
Eclipse E800 落射蛍光顕微鏡NikonObjectives: Nikon Plan Apo 20x/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75
GNU Image Manipulation Program (Version 2.10.10)GIMP
Illustrator (2017 Creativeクラウド)Adobe
ImageJ (Version 1.46r)NIH
MicrofilWorld Precision InstrumentsMF 34G-5
Micromanipulator with universal adaptor and supportbase Drummond Scientific3-000-024-R
3-000-025-SB
3-000-024-A
マイクロピペット プーラーサッター機器P-30
ミニプレップキットQiagen27104
電動 z-stage応用科学機器MFC-2000
Nanoject II インジェクタードラモンドサイエンティフィック3-000-204
パワーポイント (バージョン 15.31)Microsoft
Xenopus laevis胚NascoLM00490

参考文献

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