このプロトコルは、DNA/DOTAP混合物を1日齢のXenopus laevis胚の眼芽にマイクロインジェクションする方法、およびテクター中脳における視神経軸軸樹園を発現する個々の緑色蛍光タンパク質(GFP)を画像化して再構築する方法を示すことを目的としています。無傷で、生きているキセノプスオタマジャクシ。
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方法論記事
キセノプス・レービス胚における眼芽へのDNAのマイクロインジェクションとGFPのイメージングは、無傷で光学軸軸樹園を発現し、生きているキセノプス・タマジャクシ
この記事について
サマリー
要約
水生カエルXenopus laevisのオタマジャクシの主な視覚投影は、神経結合の発達を調節するメカニズムを研究するための優れたモデルシステムとして機能する。レティノテクター投影の確立の間、光学軸が目から伸び、彼らの標的組織、視体に到達するために脳の異なる領域をナビゲートする。光学軸がテクタムに入ると、彼らはテクタム内のターゲットインターニューロンで行うことができるシナプス接続の数を増やすために機能するターミナルアーバーを精巧に作ります。ここでは、キセノプス胚における光ニューロン(再生神経節細胞)において、緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードするDNAを発現する方法と、機能低下遺伝子構築物を発現する方法について述べる。1日齢の胚の眼帯にDNA/リポフェクション試薬をマイクロインジェクションし、外因性遺伝子を単一または少数の光学ニューロンで発現させる方法について説明する。遺伝子をGFPでタグ付けするか、GFPプラスミドと共に注入することにより、分子シグナル伝達を変化させた個々の光学ニューロンの末端軸索アーバーは、数日後に生きているXenopusオタマジャクシとその形態をそのままの脳に直接画像化することができる。定量化できます。このプロトコルは、生体内の光学軸ゾン樹木化の開発の根本にある細胞自律分子機構の決定を可能にする。
概要
神経系の発達中に、シナプス前ニューロンの軸は、彼らのターゲット領域に到達するために脳の多様な領域をナビゲートします。軸が標的組織に侵入すると、シナプス標的ニューロンとのシナプス結合を確立します。多くの種類のニューロンでは、軸が端子分岐またはアーバー1のネットワークを詳述することによって行うことができるシナプス接続の数と空間範囲を増加させます。水生カエルXenopus laevisのオタマジャクシの網状粘薬投影は、末端軸ゾンの樹木化とシナプス接続性2、3、4の基礎となるメカニズムを調べるための強力な脊椎動物モデルです。.正常および変化した分子シグナル伝達を有する視神経軸軸アーバーを発現する個々のGFPは、無傷で直接観察することができ、生きているキセノプスオタマジャクシ5、6、7、8。少数の光学ニューロンで遺伝子の全長または切り捨てバージョンと一緒にGFPを単独で表現するために、我々は1日古いXenopus....
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プロトコル
ここに記載されているすべての方法は、トゥーロ大学カリフォルニア州の機関動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています(プロトコル#TUCA003TE01X)。
1. X. レービス胚の取得
- ヒト絨毛性ゴナドトロピン(HCG)を用いた雄と雌の成人カエルのペアの自然交配によってX.laevis胚を得る、HCGでプライミングされた雌の成人カエルから流された卵の体外受精によって、または直接注文することによって(表材料)。
-
室温で2%のシステイン溶液で得られた脱ゼリー胚(材料の表)16.
- 大きなペトリ皿に50−100個の胚を集める。胚が入っている溶液をデカントするか、プラスチック転写ピペットを使用して取り除きます。胚を含む皿に2%システイン溶液(25 mL ddH2Oで0.5gシステイン、pH~8.0)を加えます。
- 胚のゼリーコートが落ち、胚が皿の中央に集まるまで、システイン溶液中の胚を含むペトリ皿を穏やかに旋回します(−10分)。この時点で、ゆっくりとゆっくりと廃棄物ビーカーにシステイン溶液を注ぎます。システイン溶液と一緒に廃棄物ビーカーにあまりにも多くの胚を注ぐしないように注意してください。
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結果
この記事で説明するプロトコルは、1~10個の光学軸軸アーバーでGFP(単独または追加のDNA構築物と一緒に)を発現する注入されたXenopus胚の30−60%の成功率をもたらす。図3では、最近発表された研究7から無傷のXenopusオタマジャクシ中のコントロールおよび変異型視軸軸アーバーを発現するGFPの代表的な共焦点画像を示す。本研究では、APC(APCNTERMおよびAPCβ-cat)の2つのドメイン変異体をpCS2プラスミドにクローンし、これらのプラスミドをpCS2-GFP標識プラスミドと共に1日前のキセノプス胚の眼芽に注入した。図4は、分岐数、総アーバー枝長、枝の平均長さを含む、コントロールおよびAPC変異軸軸樹園の再構成に関して行ったいくつかの定量的測定の結果を示しています。
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ディスカッション
本稿では、単一または少数の光学ニューロンで外因性DNA構築物を発現する方法と、カエルXの生きているオタマジャクシをそのまま正常かつ変化した分子シグナル伝達で視体軸軸アーバーを発現する個々のGFPを画像化する方法を示す。 .ラエビス.また、生体内で撮影した画像から光学軸軸アーバーを発現するGFPの形態を再構築・定量化する方法についても説明する。少数の光学ニューロンで外因性DNAプラスミドを発現させるには、DNA/リポフェクション試薬混合物を1日前のキセノプス胚の眼帯原始にマイクロ注入し、クリスティン・ホルトの研究室で最初に開発された技術を用いて光学を研究した。若いオタマジャクシ9、10、19、20、21の軸ゾンパスファインディング。我々と他の人はまた、このDNAマイクロインジェクシ.......
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開示事項
著者は何も開示していない。
謝辞
私たちの研究を支援してくださったトゥーロ大学カリフォルニア大学オステオパシー医学カレッジに感謝します。私たちは、研究室でこのマイクロインジェクション技術を実装するのを助けた研究室の前の学生(エスター・ウー、グレゴリー・ペン、テグン・ジン、ジョン・リム)を認めます。私たちは、ゼノプス胚のこのDNAマイクロインジェクション/リポフェクション技術が最初に開発された研究室で、クリスティン・ホルト博士に感謝しています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 3.5インチマイクロピペット | ドラモンドサイエンティフィック | 3-000-203 - G/X | |
| μ-managerソフトウェア(バージョン1.4) | Vale Lab | www.micro-manager.org | |
| CCDカメラ | サイオンコーポレーション | CFW-1312 M | |
| Chorulon (Human Chorionic Gonadotropin) | AtoZ Vet Supply | N/A | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 168149-100G | |
| DOTAP | Sigma-Aldrich | 11202375001 | |
| Dumont Forceps #5 | Fine Science Tools | 11250-10 | |
| Eclipse E800 落射蛍光顕微鏡 | Nikon | Objectives: Nikon Plan Apo 20x/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75 | |
| GNU Image Manipulation Program (Version 2.10.10) | GIMP | ||
| Illustrator (2017 Creativeクラウド) | Adobe | ||
| ImageJ (Version 1.46r) | NIH | ||
| Microfil | World Precision Instruments | MF 34G-5 | |
| Micromanipulator with universal adaptor and support | base Drummond Scientific | 3-000-024-R | |
| 3-000-025-SB | |||
| 3-000-024-A | |||
| マイクロピペット プーラー | サッター機器 | P-30 | |
| ミニプレップキット | Qiagen | 27104 | |
| 電動 z-stage | 応用科学機器 | MFC-2000 | |
| Nanoject II インジェクター | ドラモンドサイエンティフィック | 3-000-204 | |
| パワーポイント (バージョン 15.31) | Microsoft | ||
| Xenopus laevis胚 | Nasco | LM00490 |
参考文献
- Gibson, D. A., Ma, L. Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system. Development. 138 (2), 183-195 (2011).
- Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: d....
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再版と許可
