巨大ウイルス混合物分離のための蛍光活性化細胞選別の代替戦略としての単一細胞マイクロ吸引

サマリー

ここでは、感染アメーバの分離のための単一細胞マイクロ吸引法について説明する。ファウストウイルスと未知の巨大ウイルスに感染したヴェルマメーバ・バーミフォルミスのウイルス亜集団を分離するために、以下に詳述するプロトコルを開発し、2つの低存在量の新規巨大ウイルスを分離する能力を実証した。

要約

アメーバ共培養プロセス中に、複数のウイルスを単一のウェルで単離してもよい。我々は以前、ウイルス集団に適用される終点希釈および/または蛍光活性化細胞選別(FACS)によってこの問題を解決した。しかし、混合物中のウイルスが類似した形態学的特性を有し、ウイルスの1つがゆっくりと増殖すると、ゲノムアセンブリの段階で2つのウイルスの存在が発見され、ウイルスはそれ以上の特徴付けのために分離することができない。この問題を解決するために、類似性の高いウイルスの分離とクローニングを可能にする単一細胞マイクロ吸引手順を開発しました。本研究では、この代替戦略により、クランデスチノウイルスST1とウスルパティウイルスLCD7の小さなウイルス亜集団を分離し、ゆっくりと成長し、溶解性および急速に成長するアメーバル溶解に至らない巨大ウイルスをどのように分離することができたかを提示する。ファウストウイルス。純度制御は、特異的遺伝子増幅によって評価され、ウイルスはさらに特徴付けのために産生された。

概要

核細胞質大DNAウイルス(NCLDV)は、真核^生物1に感染する4つのファミリーによって定義される非常に多様である。300kbpを超えるゲノムを有する最初の記載のウイルスはフィコドナウイルス科、パラメシウムブルサリアクロレラウイルス1 PBCV12を含む。MimiVirusの単離および最初の説明は、ウイルスの大きさが粒子の大きさ(450nm)とゲノムの長さ(1.2Mb)3の両方の点で倍増することを示した。それ以来、多くの巨大ウイルスが記載されており、通常はアメーバ共培養手順を用いて単離される。異なる形態と遺伝的内容を持ついくつかの巨大なウイルスは、マルセイユウイルス、パンドラウイルス、ピトウイルス、モリウイルス、セドラットウイルス、パックマンウイルス、トゥパンウイルス、および最近を含むアカントアメーバ球細胞から単離することができるメデューサウイルス^{4,5,6,7,8,9,10,11,12,13、14、15、16、17}.並行して、ベルマモエバ・バーミフォルミスの単離により、ファウストウイルス、カウモエバウイルス、およびオルフェオウイルス18、19、20の巨大ウイルスの単離および説明が可能となった。他の巨大ウイルスは、カフェテリア・レンゲン^シス21、アウレオコッカス・アノファゲフェレン^ス22、クリソクロムリナ・エリチ^ナ23、ボド・サルタンなどの宿主プロティストと共に単離された。 ²⁴.これらの分離はすべて、分離に取り組むチームの数が増え、高スループット戦略の更新が導入された結果^です。フローサイトメトリーを用いる共培養システムの改善

2016年には、共培養とフローサイトメトリーを関連付ける戦略を用いて巨大^{ウイルス27}を単離しました。この戦略は、接種するサンプルの数を増やし、細胞支持体として使用されるプロティストを多様化し、細胞支持体の上昇を迅速に検出するために開発されました。システムは、Pacmanvirus²⁹の場合のように、予備的な分子生物学の同定と未知のウイルス集団の迅速な検出を避けるために補足ステップを追加することによって更新された。細胞選別への結合フローサイトメトリーは、ミミウイルスとセドラトウイルスA11³⁰の混合物の分離を可能にする。しかし、後にフローサイトメトリーによるこれらのウイルス亜集団の分離と検出の限界に遭遇しました。シーケンシング後、ファウストウイルスST1²⁵とファウストウイルスLCD7(未発表データ)のゲノムを組み立てたとき、公共ゲノムデータベースで同定されていない2つの新規ウイルスの2つの補足ゲノムを各アセンブリで驚くほど見つけました。しかし、フローサイトメトリーも透過電子顕微鏡(TEM)も、アメーバが2つの異なるウイルス、クランデスチノウイルスST1およびウスルパティウイルスLCD7によって感染していることを示さなかった。我々は、ファウストウイルス、ウスルパティウイルス、クランデスチノウイルスマーカーをそれぞれゲノムに基づいて増幅する特定のPCRシステムを設計した。私たちの目的は、分離されているウイルスの純度の検証を可能にするPCRベースのシステムを持つことです。しかし、終点希釈とフローサイトメトリーはそれらを分離できませんでした。クランデスチノウイルスおよびウスルパティウイルス集団の形態および複製要素のいずれも特徴付けされていないため、この単一のウイルス集団の分離は困難であった。2つの集団の重複(有効分離後に試験)により、フローサイトメトリーによってウイルス集団を1つだけ検出した。96ウェルプレート上で単一粒子選別を行って分離しようとしましたが、細胞障害効果は観測されず、PCR増幅によってクランデスチノウイルスもウスルパティウイルスも検出しませんでした。最後に、エンドポイント希釈の組み合わせのみに続いて、ファウストウイルスからこれら2つの低存在量の巨大ウイルスの分離を可能にした単一のアメーバマイクロ吸引の組み合わせだけでした。この分離方法は、この資料の対象です。

プロトコル

1. アメーバ文化

1. 細胞サポートとしてベルマメーバ・バーミフォルミス(株CDC19)を使用してください。
2. プロテアーゼ-ペプトン-酵母エキスグルコース培地(PYG)(表1)とアメーバの3mLを75cm2細胞培養フラスコに1x10 ⁶細胞/mLの濃度で加えます。
3. 培養を28°Cに保つ。
4. 48時間後、カウントスライドを用いてアメーバを定量する。
5. すすぐために、細胞を1x 10⁶細胞/mLの濃度で採取し、720 x gで遠心分離してアメーバを10分間ペレット化し、上清を除去し、適切な量の飢餓媒体でペレットを再び踏み込み、1 x 10 6を得るセル/mL (表 1)

2. アメーバにおけるストックウイルスの伝播

注:希釈する前に、十分な新鮮な培養を得るためにストックサンプルを培養し、次いで濾過に進むことが重要である。

1. 飢餓培地でアメーバ培養物の1 x 10⁶を使用してください。
2. 0.01の多重性(MOI)での細胞支持に関する共培養プロセスの後に、原液(ファウストウイルス/ウスルパティウイルスLCD7またはファウストウイルス/クランデスチノウイルスST1)から発行されたウイルスの混合物を接種する。
   注:MOIは、主要なウイルス集団の豊富さと感染細胞の数を減らすために重要です。
3. 細胞障害効果(CPE)が誘導されるまで30°Cでインキュベートし、例えばアメーバル丸めやリジス、感染後約10〜14時間。
4. メディアを収集し、5 μm フィルタを使用して濾過し、細胞の破片を除去します。

3. 終点希釈

1. 飢餓培地中のウイルス試料のシリアル希釈(10-1~10-11)を行う(表1)。
2. 各ペトリ皿に含まれる1 x 10⁶ Vermamoeba vermiformisの2 mLを、混合物接種体の100μLで接種する。
3. ペトリ皿を30°Cの密封可能なビニール袋に入れます。
4. 6時間後の感染時に逆光学顕微鏡でペトリ皿の観察を開始し、4~8時間ごとに細胞形態を確認します。
5. 細胞の丸めを特徴とする細胞障害効果の出現時に、単一細胞マイクロ吸引プロセスを開始する。

4. 単一細胞マイクロ吸引

1. ホストを準備します。
   注:この調製物は、感染した単一細胞を新鮮な細胞サポートに放出するために行われます。
   1. 10 μg/mL のバンコマイシン、10 μg/mL のイミペネム、シプロフロキサシンの 20 μg/mL、ドキシサイクリンの 20 μg/mL、および 20 μg/mL のボリコナゾールを含む抗菌剤で培養中のアメーバを処理します。この混合物は、細菌や真菌の汚染を避けるために使用されます。
      注:プロシージャは微生物学的安全ステーションの外のベンチで行われる。1 x 10⁶セル/mLに濃縮されたアメーバをそれぞれ15ペトリ料理に加えます。アメーバの付着のために、30°Cで30分間培養をインキュベートする。
2. 以下の基準に従って限界希釈からマイクロ吸引に使用されるペトリ皿を選択する:1)真菌および細菌剤による目に見える汚染の欠如、2)ウイルスによるアメーバの細胞障害効果の証拠、および3)前析アメーバの丸め相(ウイルス粒子の吸引を避けるため)。
3. 以下の資料を使用してワークステーションをセットアップします (図 1A,B を参照)。
   マイクロマニピュレータ、マイクロキャピラリーの位置を可能にします。
   手動制御圧力装置は、細胞を吸引し、マイクロキャピラリーに放出するために使用される;
   反転顕微鏡;
   モーターモジュールをプラグアンドプレイ。
   カメラ;
   操作を視覚化し、写真を撮るためのコンピュータモジュール。
4. マイクロキャピラリーを選択します (図 1Cを参照)。
   注:細胞の大きさ、膜の表面への変形や付着、細胞運動性は、マイクロ吸引の円滑な進行に影響を与える可能性があります。マイクロキャピラリー直径は正確に選択され、吸引のサイズおよび方法に応じて特定の細胞タイプに合わせることができる。内径20μmのマイクロキャピラリーを用い、丸めアメーバ(直径~10μm)を吸引した。これにより、内部位置の維持とセルの容易な解放が可能になります。
5. システムをマウントします。
   1. 電動モジュールのグリップシステムの動作角度を45°に固定します。
   2. ダブルインストールを実行し、最初にグリップシステムで、次にマイクロキャピラリーで実行します。
   3. マイクロキャピラリーを通して油の数滴を実行した後、細胞に焦点を当てます。
      注:生物学的適合性を有する鉱物油は装置によって供給される。
   4. 製造元の推奨事項に従って取り付けを完了します。
6. セルのクローンを作成します(図 2A,B を参照)。
   注:この手順は、フレーリッヒとケーニッヒ³¹で説明されている手順に似ています。
   1. 2mLの感染アメーバを含むペトリ皿を顕微鏡下に置きます。
   2. まず細胞に焦点を当て、次に培養に浸漬した微小毛細血管に焦点を当てる。
   3. 丸みを帯びた単一セルを選択し、マイクロマニピュレータにマイクロキャピラリーを近づけます。
   4. 細胞に手動圧力制御で柔らかい吸引を発揮し、マイクロキャピラリーの中に取り込む。最初のサンプルから単一の細胞を取り出し、細胞サポートで放出し、30°Cでインキュベートします。
   5. 反転光学顕微鏡で毎日観察を行い、細胞の外観を観察し、細胞障害効果の出現を監視します。

5. PCRスクリーニング

注:ステップ4に続いて、PCRによる系統的スクリーニングは、分離を確認するために重要である。ウスルパティウイルス/ファウストウイルスおよびクランデスチノウイルス/ファウストウイルスの両方において、特定のプライマーおよびプローブシステムの設計および応用は、Primer-BLAST^{オンライン32}を用いて行われた(表2)。

1. 陽性培養サンプルの一部(すなわち、細胞障害効果が観察される)からDNAを抽出し、製造業者のプロトコルに従って自動抽出システムを使用する。
2. 適切に設計されたプライマーを使用します。
   注:ここでは、RpB2(ファウストウイルス)、LCD7主要キャプシドタンパク質(ウスルパトウイルス)およびマイナーキャプシドタンパク質(クランデスチノウイルス)として標識されたコア遺伝子を増幅するためのプライマーを設計しました。
3. サーモサイカーを使用して標準PCRを実行します。
   1. 各プライマーの50μM(表2)、1xマスターミックス、およびRNaseフリーウォーターで20μL PCR反応を行います。
   2. Taq DNAポリメラーゼを95°Cで5分間活性化し、95°Cで10°変性の45サイクル、58°Cで30sのプライマーのアニーリング、72°Cで30sの延長を行います。
4. 1.5%のアガロースゲルでPCR製品を実行し、DNAゲル染色(材料表)で染色し、UVで可視化します。

6. ウイルスの生産と精製

1. 残りのペトリ料理文化を小さなフラスコに戻します。
2. ウイルス産生のために、145cm2のフラスコ15個を調製し、飢餓培地中に40mLのベルマメーバ・バーミフォルミスを含み、既にペトリ皿から小さなフラスコに移された単離されたウイルスの5mLを含む。
3. ステップ4.1で使用したのと同じ抗生物質および抗真菌混合物で治療する。
4. 30°Cでインキュベートする。逆光学顕微鏡で毎日観察してください。
5. 完全な感染の後、すべてのフラスコをプールします。0.45μmフィルタを使用して、破片を除去します。
6. 超遠心噴機は45分間50,000 x gですべての上清。
7. 遠心分離後、吸引により各チューブから上清を除去し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)のペレットを1mLで再サスペンドする。
8. 25%スクロース(27.5gのスクロースを100mLのPBSで27.5g、濾過により殺菌)を用いて生成したウイルスを精製する。
9. スクロースの遠心8 mLとウイルス懸濁液の2mLを80,000 x gで30分間30分間再懸濁し、PBSの1mLでウイルスペレットを再懸濁する。-80°Cで保管してください。

7. 負染色と透過型電子顕微鏡

注:Bou Khalilら以前にこの^{プロトコル27}を公開しました。

1. 光を排出したグリッド上にリシス上清の5μLを堆積させる。室温で約20分間放置します。
   注:グロー放電により、プラズマ塗布により親水性グリッドを得ることができる。
2. グリッドを慎重に乾燥させ、1%のモリブデン酸アンモニウムを10sのために少し入金し、グリッドを5分間乾燥させます。
3. 200keVで電子顕微鏡観察に進みます。

8. クランデスチノウイルスST1とウスルパティウイルスLCD7の特性評価

1. ゲノムシーケンシング、ゲノムアセンブリ、バイオインフォマティクス解析を用いたクランデスチノウイルスST1およびウスルパティウイルスLCD7の純粋な集団を特徴付け、他の^{ウイルス10、20}に対して行ったような複製周期の^{研究、 29}.

結果

単一細胞マイクロ吸引は、この原稿で最適化されたマイクロマニピュレーションプロセスです(図1)。この技術により、丸みを帯びた感染アメーバ(図2A)の捕捉と、未感染アメーバを含む新規プレートでの放出が可能になります(図2)。これは、共培養システムに適用され、正常に非溶解性巨大ウイルスを隔離した機能的なプロトタイプです。このアプローチは、巨大なウイルスの分野で初めて使用され、2つの新しい低存在量の巨大ウイルスを分離することを可能にしました。我々は、新しいウイルスクランデスチノウイルスST1とウスルパティウイルスLCD7と名付けました, 高豊富なファウストウイルスに比べて低い存在でした.マイクロ吸引手順後の各プレートにおけるウイルス存在を分析するために、15マイクロ吸引にPCRを適用した。純粋なウスルパティウイルス(ウスルパティウイルスLCD7[+]の存在およびファウストウイルス[–]の欠如)はクローン7のみで観察した(

ディスカッション

単一細胞マイクロ吸引処理の持続時間および良好な機能はオペレータに依存する。実験の異なるステップは、精度を必要とします。ワークステーションのマイクロ操作コンポーネントの使用は、マイクロ吸引のプロセスと細胞の放出を観察することによって一定の制御下になければなりません。顕微鏡観察によるフォローアップは、細胞の捕獲と移動に必要です。経験豊富なオペレータは、1〜2時間を取って10個の細胞を分離し、分離するウイルスの豊富さに応じて1つずつ再転送することができます。操作の数はさまざまです。私たちは、10の操作から始まるお勧めします。定義上、未知のウイルスの本質的な特徴は分かりません。したがって、これらのウイルスを分離する成功を最適化するためには、分離のための異なる戦略の使用と開発が必要です。

マイクロ吸引プロセスは、無菌条件下(微生物学的安全ステーションの外のベンチで)で行われるため、その使用を制限し、ヒト病原体の研究への応用を妨げる。したがって、汚染物質を制限するために抗生物質と抗真菌剤の混合物の使用が必須である。この方法のもう一つの制限は、マイクロマニピュレーションコンポーネントが取り付けら...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アガロース スタンダード	Euromedex	アンカウン	スタンダードPCR
AmpliTaq Gold 360 マスターミックス	アプライドバイオシステム	4398876	スタンダードPCR
CellTram 4r オイル	エッペンドルフ	5196000030	微小吸引プロセス中の細胞の制御
コーニング細胞培養フラスコ 150 cm2	Sigma-aldrich	CLS430825	Culture
コーニング 細胞培養フラスコ 25 cm2	Sigma-aldrich	CLS430639	培養
コーニング細胞培養フラスコ 75 cm2	Sigma-aldrich	CLS430641	培養
DFC 425C カメラ	LEICA	不明	観察・モニタリング
Eclipse TE2000-S 倒立顕微鏡	ニコン	不明	観察・モニタリング
EZ1 アドバンスト XL	Quiagen	9001874	DNA 抽出
Glasstic Slide 10 with Counting Grids	Kova International	87144E	Cell count
Mastercycler nexus	Eppendorf	6331000017	Standard PCR
Microcapillary 20 & micro;m	エッペンドルフ	5175 107.004	細胞の微小吸引と放出
マイクロマニピュレーター InjectMan NI2	エッペンドルフ	631-0210	マイクロキャピラリーポジショニング
ヌクレアーゼフリー水	サーモフィッシャー	AM9920	標準PCR
オプティマ XPN 超遠心分離機	ベックマン・コールター	A94469	ウイルス精製
ペトリ皿 35 mm	同上	81158	培養/観察
滅菌シリンジフィルター5 & micro;m	Sigma-aldrich	SLSV025LS	ろ過
SYBR 緑色 Type I	Invitrogen	不明	蛍光分子プローブ/フローサイトメトリー
SYBR Safe	Invitrogen	S33102	標準 PCR;DNAゲル染色
Tecnai G20	FEI	Unkown	電子顕微鏡
Type 70 Ti 固定角チタンローター	BECKMAN COULTER	337922	ウイルス精製
ウルトラクリアチューブ、25 x 89 mm2	BECKMAN COULTER	344058	ウイルス精製