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方法論記事

ラットの急性脳卒中後の脳回復を評価する前臨床モデル

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DOI:

10.3791/60166

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2019年11月6日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Yinfeng Dingcheng Biological Engineering Technology Ltd., 2Hulunbuir People's Hospital, 3Shandong Qilu Stem Cell Engineering Co. Ltd.

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本研究の目的は、1-90後の中大脳動脈閉塞/再灌流(MCAO/R)後の脳梗塞および感覚運動機能を試験することにより、脳虚血の回復および後遺症の研究のための動物モデルを確立し、検証することですネズミの日。

要約

本研究の目的は、回復段階および後遺症段階における動物脳虚血モデルを確立し、検証することにあった。男性スプレイグ・ドーリーラットにおける中大脳動脈閉塞/再灌流(MCAO/R)モデルが選択された。ラットの重量(260-330g)、糸ボルトタイプ(2636/2838/3040/3043)、脳梗塞時間(2-3時間)を変更することにより、ロンガのスコアが高く、より大きな梗塞量とより大きなモデル成功率をロンガのスコアとTTC染色を用いてスクリーニングした。最適なモデル条件(300g、3040スレッドボルト、3時間脳梗塞時間)を取得し、感覚運動機能と梗塞量の評価を介して再灌流後1〜90日間の観察期間に使用した。これらの条件では、両側非対称性試験は1日から90日の間に有意な差があり、グリッドウォーキング試験は1〜60日の有意な差を有した。両方の違いは、適切な感覚運動機能試験である可能性があります。したがって、脳虚血の回復および後遺症段階における新規ラットモデルの最も適切な状態が発見された:3時間の脳梗塞のための3040スレッドボルトでMCAOを受けた300gラットが見つかり、その後再浸透した。適切な感覚運動機能試験は、両側非対称性試験とグリッドウォーキング試験であった。

概要

脳虚血は、急性期(1週間以内)、回復段階(1週間~6ヶ月)、後遺症の3つの段階に分けられる。現在、ほとんどの研究は、その有意な効果と多対相対研究モデル1、2、3のために脳虚血の急性期に焦点を当てています。しかし、脳虚血の回復と後遺症の段階は、障害の長期的な合併症のために無視することはできません。そこで、本研究の目的は、脳虚血の回復段階と後遺症を研究するために、安定した信頼性が高く比較的単純な動物モデルを探索することになる。

多くの実験的脳虚血モデルの中で、中脳動脈閉塞(MCAO)を使用して、右中大脳動脈(MCA)への糸ボルト挿入を使用しています。このモデルは、より大きな梗塞量を産生し得るヒト脳卒中に類似しており、脳卒中に関連する多くの行動障害をもたらし、糸ボルト4、5、6を除去することによって血液再灌流(R)を可能にすることができる。MCAO/Rはまた、脳虚血7の金標準動物モデルと考えられている。さらに、脳損傷の重症度は、糸ボルトの直径および挿入長さ、脳虚血の持続時間、および動物重量(より大きなラットは、より大きな脳およびより厚い脳血管を有する)8に依存する。したがって、糸ボルトの種類、梗塞時間、およびラット重量を変更することにより、MCAO/Rラットにおける脳虚血の回復および後遺症の段階に適したモデルを見つけることができる。ラットモデルを検証するために、TTC染色と感覚運動機能実験(両側非対称性試験、グリッドウォーキング試験、ロタロッド試験、リフティングロープテスト)を用いて、MCAO/Rモデルの1日間、35日間、60日間、90日間の研究を行いました。

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プロトコル

動物の被験者の手順と使用は、実験動物のケアと使用のための国立衛生研究所によって承認されています。このプロトコルは、中大脳動脈閉塞/再灌流(MCAO/R)および感覚運動機能のテストのために特に調整される。

1. 実験計画とグループ化

  1. ラットMCAO/Rモデルを使用して、ロンガのスコアとTTC染色を使用して、より重度の脳損傷とより大きなモデル成功率を有するラット脳虚血モデル法をスクリーニングします。
    1. 7-9週齢の体重260-330gの雄スプレイグ・ドーリーラットに対して実験を行う。実際のラット重量は275gで275±15g、300gで300±10g、320gで320±10gです。
    2. 次の 7 つのグループ (重量、ねじボルトタイプ、梗塞時間): 15 ラットのグループ 1 (275 g, 2636, 2 h) を使用します。グループ 2 15 ラット (275 g, 2636, 3 h);グループ 3 15 ラット (275 g, 2838, 2 h);グループ 4 15 ラット (275 g, 2838, 3 h);グループ 5 13 ラット (300 g, 3040, 3 h);グループ 6 10 ラット (320 g, 3040, 3 h);グループ7は13匹のラット(300g、3043、3時間)を有する。
  2. TTC染色による脳回復状態を研究し、適切な感覚運動機能試験を用いて、両側非対称性試験、グリッドウォーキング試験、ロタロッド試験およびMCAO/Rの1、35、60、90日後のリフティングロープ試験による長期的な機能障害を示す。
    1. 体重が8~9週の男性スプレイグ・ドーリーラットを300±10g使用してください。
    2. 次の 5 つのグループを使用します: 20 匹のラットを持つコントロール (通常) グループ。16匹のラットを持つ1日のグループ;16匹のラットを持つ35日間のグループ;17匹のラットを持つ60日間のグループ;19匹のラットを持つ90日間のグループ。
  3. ステップ1.1のロンガのスコアまたはステップ1.2の感覚運動機能テストの後、TTC染色のためにすべてのラットを麻酔し、切断します。

2. ラットにおける一方的MCAO/Rモデルの確立9

メモ:手術中は、マイクロフォースプを穏やかに使用して血管の破損を防ぎます。血管が単離されるとき、ラットの頸部の神経や他の血管への損傷を避けてください。すべての生存外科的処置のための適切な無菌技術を提示するために注意が必要です。ビデオの後半で説明するテクニックは、手順全体を通して実践する必要があります。

  1. 手術を通じて、ラットの体温を37.0±0.5°Cの小動物サーモスタットに保ちます。4つの6 cm 5-0縫合糸を準備します。
  2. 小動物麻酔機(廃ガス処理装置付き)の酸素流量を0.4−0.6 L/min、イソフルランの濃度を5%に設定します。麻酔機にラットを置きます。
  3. 動物が気を失った後、ラットを外科的固定テーブルの上に置く。ラットの口を麻酔機のマスクに接続します(酸素流量は変わりません;アイソフルランの濃度を3%に調整します)。四肢の緊張、角膜反射、痛みの欠如を観察して、動物が深い麻酔に入っていることを確認します。
  4. 紙の包帯(または他のツール)で手術台に横たわるように手足を固定します。
  5. 電気剃風器でネックコートを取り外し、75%のアルコールで殺菌します(ヨウドファーの方が良いです)。ラットの口をフックで固定します。
  6. 眼科はさみで首の中央縦形状に沿って2−3センチメートルをカットします。
  7. 一般的な頸動脈を分離します。皮下筋を眼科鉗子で分離する。完全に視野を露出するために自家製リトラクタを使用してください。気管の前筋を眼科鉗子で分離した後、一般的な頸動脈が見えるまで右胸鎖筋腫性腱に沿って分離する。
  8. 一般的な頸動脈、外頸動脈、眼科鉗子を用いて内頸動脈を分離する。一般的な頸動脈(硬い結び目)、心臓端から遠く離れた外頸動脈(硬い結び目)、内頸動脈(緩い結び目)を5-0縫合でリゲートします。心臓端の近くの外頸動脈を5-0縫合で並べて下ろします。
  9. ねじボルトを挿入します。眼科はさみを使って外頸動脈の小さな開口部を切り、糸ボルトをそっと挿入します。緩い結び目にあった外頸動脈の縫合糸をリゲートし、外頸動脈を切断する。
    1. 内頸動脈の緩い結び目を緩め、中大脳動脈の始まりに糸ボルトを挿入し続けます(縫合糸がマークされています)。次に、露出したねじボルトを切り取ります。
  10. 虚血時間(2-3時間)に達したら、外頸動脈の骨折を1つのマイクロフォースプで固定し、別のマイクロフォースプで糸ボルトをそっと引き出します。ねじボルトの前端が内頸動脈から完全に引き抜かれたら、5-0縫合糸が並んでいた外頸動脈をリゲートし、その後、糸ボルトを完全に引き出します。
  11. 一般的な頸動脈を緩め、感染を防ぐために創傷の表面にペニシリンナトリウム粉末のダウブ〜50,000 U。縫合皮下筋肉と皮膚を4縫合。
  12. ラットをケージに戻した後の術後水不足を防ぐために、1 mL注射器(SQ-PEN注入の方が良い)を使用してラットに滅菌生理食塩水の〜0.2mLを経口与える。
  13. ロンガのスコア10に従って再灌流の24時間後に動物を選択してください。ステップ 1.1 の次の TTC 染色に対してロンガのスコアが 1-3 の動物と、ステップ 1.2 で 1、35、60、90 日の学習で 2-3 のスコアを持つ動物を選択します。
    注:ロンガのスコア10:0スコア、神経学的な欠陥なし。1スコア、左前爪を拡張する失敗。左に回る2スコア。左に落ちる3スコア。4スコアは、自発的に歩くことができず、意識が落ち込んでいます。
  14. 一方向ANOVAでロンガのスコアを分析します。示された値は平均±S.D. P < 0.05の差を示す。

3. TTC染色

注:ラット脳スライス金型とブレードは、大きな温度差による密着性を防ぐために、使用前に-20°Cの冷蔵庫で事前に冷却する必要があります。染色中は、脳スライスと培養プレートとの密着性を防ぎ、染色が不十分になる可能性があります。

  1. ステップ1.1のロンガのスコアまたはステップ1.2の感覚運動機能テストの後に400mg/kgの塩素水和物の腹腔内注射によってラットを麻酔する。
  2. 外科的なはさみまたはラットの切断装置でラットを切断します。外科的はさみと止血性鉗子で脳を取り除く。
  3. スライスを容易にするために、脳を-20°Cの冷蔵庫に30分間入れます。
  4. 冷蔵庫から脳を取り除き、事前に冷却されたラットの脳スライス型に入れます。あらかじめ冷却されたブレードで、脳を6つの2mmの厚さの連続したセクションにカットします。
  5. セクションを2%5-トリフェニル-2H-塩化テトラゾリウム(TTC)で6ウェル培養プレートに染色します。
  6. 揺れるベッドで37°Cで30−60分のセクションを培養する。脳虚血領域と正常領域が明らかに白と赤になるまで10分ごとにセクションを反転します。
  7. 脳のスライスを背中から脳の前に向けた順序で垂直に並べられます。ルーラーを使用して、各行の全長が同じであることを確認します。デジタル カメラで写真を撮る。
  8. 梗塞の体積を分析します。
    1. フォトショップソフトウェアで写真を前処理
      1. フォトショップCS6を使用して写真をインポートします。00:00-00:14
      2. [選択]をクリックして脳スライスを選択し、[選択|逆.00:15-00:36
      3. [前景]をクリックして黒を選択し、[OK]をクリックします。00:37-00:42
      4. Alt キーを押しながら Del キーを押して背景色を塗りつぶし、Ctrlキーを押しながら D キーを押して選択を解除します。00:43-00:46
      5. [ファイル|デスクトップに保存します。00:47-01:08
    2. イメージプロプラスソフトウェアで写真を前処理します。
      1. イメージプロプラス6.0ソフトウェアを開き、写真をインポートします。01:09-01:24
      2. 欠陥の変更については、コントラストエンハンスメントツールで明るさを調整し、背景が黒になるようにします。01:25-01:37
      3. [フィルター]の[中央値]ツールを使用して、ハイライトを削除します。01:38-01:46
    3. Image Pro Plusソフトウェアで左(通常)の脳領域を計算
      1. セグメンテーションを使用して色を選択し、脳のスライスが黒の背景から分離されるようにH/S/Iの値を調整します。01:47-02:12
      2. カウントに戻る |サイズ:02:13-02:16
      3. カウントをクリック |[編集]でオブジェクトを分割して、脳を中間線から分離します。ソフトウェアは自動的に左右の脳領域を区別します。02:17-02:49
    4. イメージプロプラスソフトウェアで右梗塞脳領域を計算
      1. ステップ 3.8.1-3.8.2 を実装します。02:50-03:14
      2. カウントを選択 |サイズ:03:15-03:21
      3. [描画]をクリックします。 |[編集]の[オブジェクトのマージ]ツール 。虚血領域を手動で選択し、[カウント]をクリックして虚血領域を計算します。03:16-05:31
    5. イメージプロプラスソフトウェアで健康脳領域を計算
      1. ステップ 3.8.1-3.8.2 を実装します。05:32-06:44
      2. セグメンテーションを使用してカラーを選択し、脳スライスの通常の部分が黒の背景から分離されるようにH/S/Iの値を調整します。06:45-07:10
      3. カウントに戻る |サイズを設定し、[カウント]をクリックしてこの領域を計算します。07:11-07:21
      4. [編集]で[オブジェクトを分割]をクリックして、脳を中間線から分離します。ソフトウェアは自動的に左右の脳領域を区別します。07:22-08:08
  9. 梗塞量の計算 (%)梗塞と収縮量 (%):

    梗塞量(%) = [右梗塞領域/(2×左脳領域)] x 100.
    梗塞および収縮体積(%) = [(左脳領域 - 右健康脳領域)/(2 x 左脳領域)] x 100.

    メモ:右脳は負傷した部分です。データは一方向ANOVAによって分析された。示された値は平均±S.D. P < 0.05の差を示す。

4. 感覚運動機能の評価

注:ロンガのスコアが2~3のラット(300g、3040スレッドボルト、3時間脳梗塞時間)を選択し、1~90日の感覚運動機能実験を行いました。静かにして、この研究期間中に動物を邪魔しないでください。データは双方向ANOVAによって分析された。示された値は平均±S.D. P < 0.05の差を示す。

  1. 二国間非対称試験11
    1. 同じ圧力でラットの各前爪のサフェノウス部分に紙テープ(長さ5cm、幅0.8cm)をラップします。
    2. 各ラットについて、各前爪に接触し、影響を受けない足の時間と影響を受けた足の時間を含むカメラで5分でテープを取り外した回数を記録します。
    3. 30 分後、手順 4.1.1 と 4.1.2 をもう一度繰り返します。
    4. 感覚運動バイアスの平均値(%)を計算します。
      感覚運動バイアス(%) = (影響を受けない足の時間 - 影響を受ける足の時間)/(影響を受けない足の時間 + 影響を受ける足の時間) x 100
  2. グリッドウォーキング試験
    1. 2.5 cm2のグリッド開口部を持つ高いグリッド サーフェス プラットフォーム (面積: 1 m2; 高さ: 90 cm) の中央にラットを配置します。
    2. ラットの腰を軽く押して、ラットがグリッドサーフェスを横断するように促します。
    3. 影響を受けていない(右)手足と影響を受けた(左)手足による足の断層の数と、カメラで1分で合計ステップ数を記録します。
    4. エラー時間を計算します。
      エラー時間 (%) = [影響を受けない (右) 四肢 - 影響を受ける (左) 四肢]/合計ステップ番号 x 100.
      注: 20 ステップデータを下回るステップの合計数は削除されました。
  3. ロタロッド試験12、13
    1. 支持ソフトウェアを用いたラットのラット回転バー疲労装置(直径90mm)を、コンピュータ上で5分の期間にわたって13rpmの速度に設定します。
    2. コンピュータプログラムを起動し、ラットをロタロッドラングに同時に置きます。
    3. ラットがラングから落ちたり、5分間歩き続けたり、回転時間を記録したりする場合は、トライアルを終了します。
    4. ラットを30分間休ませなさい。
    5. 手順 4.3.2-4.3.4 をさらに 2 回繰り返し、最後の回転時間となる最大値を選択します。
  4. リフティングロープテスト14
    1. リフティングロープの器具(高さ70cm、直径0.2cm、長さ40cm)を机の上に置きます。
    2. ラットに前肢でロープをつかみ、ネズミをぶら下げさせます。
    3. ぶら下がり時間を記録し、スコアを計算します。
      注:ロープ上の3:0-2 sのスコア。ロープ上の2:3−4 sのスコア;ロープ上の1:5−6のスコア;0のスコア:ロープに7 s以上。

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結果

ロンガのスコアとTTC染色を持つMCAO/Rモデルの上記の手順を使用して、平均重量(275/300/320 g)、ボルトタイプ(2636/2838/3040/3043;)表 1)虚血時間(2-3時間)と1日の再灌流は、ラットにおける最適な脳虚血モデルのスクリーニングに使用された。300 g重量、3040スレッドボルト、および3時間脳梗塞時間のモデルパラメータは、最大の脳梗塞、最も高いロンガのスコアと最大のモデル成功率に最も適していました。これは、275g重量、2636スレッドボルト、および2時間脳梗塞時間の従来の治療において有意に改善された(図1)。

さらに、300g重量、3040スレッドボルト、3時間脳梗塞時間、2−3ロンガのスコアを有するラットは、感覚運動機能試験(両側非対称性試験、グリッドウォーキング試験、ロタロッド試験、およびリフティングロープ試験)と...

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ディスカッション

急性脳虚血によく使用されている方法および行動指標を確立する多くのモデルは、脳虚血16、17の回復および後遺症段階に有意な変化を有しないかもしれない。しかし、回復および後遺症期における脳虚血患者の数は最も多い。虚血脳卒中の回復および後遺症段階に適した動物モデルを選択することが不可欠である。

ラットのMCAO/Rモデルを使用して、ラットの適切な重量(260−330g)、糸ボルトの種類(2636/2838/3040/3043)、および最も重篤な梗塞損傷の脳梗塞時間(2-3時間)、高いモデル成功率、および目に見える行動の指標をスクリーニングします。脳虚血の回復および後遺症の段階に適しているであろう。

3040スレッドボルトと3時間の脳梗塞時間で300gの重さのラットは、より大きな梗塞量、より重度の行動欠陥、およびより大きなモデル成功率を有する(図1)。さらに、...

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開示事項

著者たちは何も開示する必要はない。

謝辞

この研究は、中国国立自然科学財団(81603315,81603316)、中国江西省の主要な研究開発計画(20171ACH80001)、福建省の大学における産業・学術協力プロジェクトによって支援されました。中国 (2018Y41010011).

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
解剖顕微鏡ライカ(ドイツ)S8顕微鏡手術器具
ブレードジェレット/脳切片の切断
恒温振とうベッド太倉実験装置工場THZ-C脳切片を均一に、かつ恒温に保つため
デジタルカメラキヤノン700D撮影用TTC染色
電気シェーバーShanghaiYuyan Scientific Instruments Co.、Ltd.の写真3000#ネズミの首の脱毛
鉗子ハモスタット上海医療機器有限公司14cm脳の除去に使用
Image Pro Plus SoftwareMedia Cybernetics Inc.6.0梗塞量の
分析 イソフルランRWD ライフサイエンス217170702麻酔ガス
マイクロ鉗子Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd.10 cm血管マイクロマニピュレーション
マイクロせん断上海Jinzhong Medical Devices Co.、Ltd.10 cm血管マイクロマニピュレーション
眼科用鉗子ShanghaiJinzhong Medical Devices Co., Ltd.10 cm補助皮膚および筋肉解剖学
PphthalmicはさみShanghai Jinzhong Medical Devices Co.、Ltd.首の皮膚を切るために使用して
ラットブレインスライスモールド上海Yuyan Scientific Instruments Co., Ltd.400 g脳組織の標準的な、均一な切断のために
回転バー疲労装置安徽省Zhenghua生物器械および装置Co.、株式会社。ZH-300B感覚運動機能をテストするために
小動物麻酔器Yuyan科学機器有限公司。ABM3000ガス麻酔器
小動物用サーモスタット北京大曹田科技有限公司DM.7-YLS-20A手術中に動物の体温を一定に保つために
手術用ハサミ上海医療機器有限公司16 cm斬首および脳除去用
縫合Shanghai Jinhuan Medical Devices Co., Ltd.4-0 / 5-0皮膚・筋肉縫合糸用 / 血管結紮用
ボルト北京シノンテック株式会社2636/2838/3040/3043-A4ラットの中大脳動脈の閉塞
-トリフェニル-2H-テトラゾリウムクロリド(TTC)SigmaLOT#BCBP3272V脳切片染色試薬
ラット上海糸 スレッド5

参考文献

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