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方法論記事

マウスにおけるイソカロリック2:1間欠的断食の代謝効果評価

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DOI：

10.3791/60174

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2019年11月27日

 ,  ,  ,  , 
1University of Ottawa Heart Institute, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Ottawa, 3Translational Medicine Program, The Hospital for Sick Children, 4Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 5Banting and Best Diabetes Centre, University of Toronto

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

現在の記事では、野生型およびob/obマウスにおける肥満および糖代謝障害を保護し、治療するためのアイソカロリック2:1断続的断食の詳細なプロトコルについて説明しています。

要約

断続的な断食(IF)は、周期的なエネルギー制限を伴う食事介入であり、多くの利点を提供し、代謝異常を打ち消すと考えられてきた。これまでのところ、断食期間と給餌期間が異なるさまざまなタイプのIFモデルが文書化されています。しかし、これらのモデルの多くは、時間制限戦略とカロリー制限戦略の両方からの多因子貢献を伴うため、結果を解釈することは困難です。例えば、げっ歯類IFレジメンとしてしばしば使用される代替日断食モデルは、栄養不足をもたらし、この介入による健康上の利益がカロリー制限と断食再供給サイクルの両方を介して媒介される可能性が高いことを示唆している。最近では、2:1 IFが1日間の断食とそれに続く摂食の2日間を含み、全体的なカロリー摂取量を減少させることなく、食事誘発性肥満および代謝改善に対する保護を提供できることが実証されています。ここで提示する、マウスにおけるこの等角2:1 IF介入のプロトコルである。また、高呼吸などの食行動を変化させたマウスモデルを調べるために必要なペアフィード(PF)プロトコルについても説明する。2:1 IFレジメンを使用して、イソカロリーIFは、体重増加の減少、グルコース恒常性の改善、およびエネルギー支出の上昇につながることが実証されています。したがって、このレジメンは、様々な疾患状態に対するIFの健康への影響を調べるのに有用であり得る。

概要

現代のライフスタイルは、より長い毎日の食物摂取時間と短い断食期間1に関連付けられています。これは、人間に見られる代謝の欠点と、現在の世界的な肥満の流行に貢献します。断食は人類の歴史を通じて実践されており、その多様な健康上の利点は、寿命の延長、酸化的損傷の減少、および最適化されたエネルギー恒常性2、3を含みます。断食を実践するいくつかの方法の中で、周期的なエネルギー剥奪は、断続的な断食(IF)と呼ばれ、その容易で単純なレジメンのために一般集団によって広く実践されている一般的な食事法である。前臨床および臨床モデルの最近の研究は、IFが長時間の断食およびカロリー制限に匹敵する健康上の利点を提供できることを実証し、IFが肥満および代謝性疾患2、3、4、5の潜在的な治療戦略となり得ることを示唆している。

IF レジメンは、断食時間と周波数の点で異なります。代替日断食(すなわち、1日の摂食/1日の断食;1:1 IF)は、肥満、心血管疾患、神経変性疾患などに対する有益な健康影響を研究するためにげっ歯類で最も一般的に使用されているIFレジメンである。しかし、以前の研究6、7に示すように、エネルギー摂取量分析でさらに機械的に確認された8、1:1IFは摂食不足をもたらす(〜80%)エネルギー損失を補うために十分な給餌時間の欠如のため。これは、1:1 IFによって与えられる健康上の利点がカロリー制限または摂食パターンの変更によって媒介されるかどうかは不明である。したがって、新しいIFレジメンが開発され、ここで示されている、食物摂取量を補うために十分な時間をマウスに提供する2日間の給餌/1日断食(2:1 IF)パターンで構成されています(〜99%)そして体重。これらのマウスは、次いでアドリビタム(AL)群と比較される。このレジメンは、野生型マウスのカロリー低下がない場合のイソカロリックIFの効果の検査を可能にする。

対照的に、変化した摂食行動を示すマウスモデルでは、AL供給は2:1 IFの効果を比較および調べるための適切な制御条件ではない場合があります。例えば、ob/obマウス(肥満に対して一般的に使用される遺伝モデル)は、食欲および満腹を調節するレプチンの欠如による過呼吸を示すので、2:1 IFを有するものはAL摂食を有するob/obマウスと比較して約20%減少したカロリー摂取量を示す。したがって、ob/obマウスにおけるIFの効果を適切に調べ、比較するためには、適切な対摂食群を適切な対照として用いる必要がある。

全体として、ペア供給制御の使用を含む等角2:1 IFを実行するための包括的なプロトコルが提供される。さらに、アイソカロリック2:1 IFは、野生型およびob/obマウスの両方で高脂肪食誘発肥満および/または代謝機能障害からマウスを保護することが実証される。このプロトコルは、神経疾患、心血管疾患、および癌を含む様々な病理学的状態に対する2:1 IFの有益な健康影響を調べるために使用することができる。

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プロトコル

ここでのすべての方法とプロトコルは、オタワ大学の動物ケアと獣医サービス(ACVS)の動物ケア委員会とフェノゲノミクスセンター(TCP)によって承認され、カナダ動物ケア評議会の基準に準拠しています。ここで説明するすべての手順は、制度的および政府的な承認の下で、また技術的に熟練したスタッフによって行われるべきである。すべてのマウスは、12時間/12時間の光/暗いサイクル(通常のハウジングでは21~22°C、湿度は30%~60%)、水への自由なアクセスを備えた、温度と湿度に制御された部屋の標準的な通気ケージに収容されました。男性C57BL/6Jおよびob/obマウスは、ジャクソン研究所から得られた。

1. 2:1 アイソカロリックIFレジメン

  1. 無駄のない肥満マウスモデルの場合は、通常の食事(脂肪、ND17%)または高脂肪食(脂肪45%、HFD)のいずれかを準備します。
    注:60%HFDは、重度の食事誘発性肥満を誘発するために使用することができます。しかし、食品ペレットの柔らかさのために、毎日の食物摂取量を正確に測定することは比較的困難である。自動化された連続測定システムは食事の複数のタイプのための多様性を改善できる。
  2. スケールとEchoMRIを使用して、7週齢の各マウスのベースライン体重と体組成を測定します。
    注:体組成測定については、セクション3を参照してください。
  3. 体重と体組成の結果に基づいて、7週齢の男性C57BL/6Jマウスをアドリビタム(AL)と断続的な断食(IF)群の2つのグループにランダムかつ均等に分割します。
  4. ケージごとに2~3匹のマウスを置き、飲料水への無料アクセスを確保します。
    注:ケージあたりのマウスの数は食物摂取行動に影響を与える可能性があります。研究中にすべてのグループでケージあたり同じ数のマウスを維持することをお勧めします。
  5. IFレジメンを開始する前に、新しいケージ環境と食事に順応の1週間を提供します。
  6. 断食期間:午後12時に新鮮な寝具を持つきれいなケージにマウスを移動します。AL群に重量を量る食物を与えながら、IF群に食品を加えないでください。
    注:断食サイクルごとに、AL グループと IF グループの両方のケージを変更して、両方のグループが同じ処理時間にさらされるようにすることが重要です。
  7. 24時間後、ALケージ内のグループと残りの食べ物の両方でマウスの体重を測定する。
    注:特にHFDを使用する場合は、マウスがホッパーから小さなペレットや食べ物の断片を取り除き、巣の近くに保管することが多いため、食物ホッパーとケージの底に食品パン粉の重量を含めつしてください。各2:1サイクル(3日)の終わりにマウスあたりの平均エネルギー摂取量は約35キロカロリーで、通常の食事(3.3キロカロリー/g)の場合は〜10g、HFD(4.73 kcal/g)の場合は~7gに相当します。
  8. 給餌期間:AL群とIF群の両方に対して、午後12時に計量量の食物を提供する。
  9. 48時間後に食品を提供し、残った食品およびマウスの重量を測定する。
  10. スタディの期間中(例:16週間)に対して手順1.6~1.10を繰り返します。

2. ペアフィード(PF)制御グループ

注:マウスモデル(例えば、ob/obマウスにおける高熱障害)で変化した摂食行動が観察されるIF実験では、IFとの適切なカロリー非依存比較のためのコントロールとして対給餌群を有することが必要である。

  1. PF制御グループの場合、IFグループによって消費される同量の食物がPFグループに提供されるように実験スケジュールをずらす(図2)。
  2. 2日間の給餌期間におけるIF群の消費量を測定します。
  3. IFグループ内の消費食品のこの量を均等に3つの割合に分割し、午後12時にPFグループに毎日提供します。
    注:毎日同じ量の食料を提供することは非常に重要です。高熱痛を伴うマウスの場合、ペア供給マウスが自発的な消費よりも少ない量の食物を一度に提供された場合、それらはすべての提供された食物を消費し、効果的に絶食する可能性が高い。これは、IF処理されたマウスとの適切な比較を妨げ、結果を混乱させる可能性があります。
  4. スタディの実行中に手順 2.1 ~ 2.3 を繰り返します。

3. 体組成分析

注:長期IFはマウスの体重に影響を与えるので、体組成分析装置を使用して適切なサイクル(例えば、3~4サイクル毎)で体組成を測定し、生きた非麻酔マウスの脂肪と無駄のない質量を定量することができます。

  1. ボディコンポジションアナライザをオンにします。
    注:プログラムを開始する前に、マシンのオンを少なくとも 2 ~ 3 時間残してウォームアップします。
  2. 体組成アナライザでシステムテストを実行し、測定精度をテストします。必要に応じて、キャノーラオイルと水サンプルを使用してシステムを校正します。
  3. 各マウスの体重を測定します。
  4. マウスを小動物のシリンドリックホルダーに入れ。
  5. 測定中にマウスの物理的な動きを制限する区切り文字を挿入し、ホルダーをボディコンポジションアナライザに配置します。
  6. スキャン プログラムを実行します。
    注:分析には約90~120sかかります。
  7. 測定後、装置からホルダーを取り外し、マウスをケージに戻します。
    注:より詳細なプロトコルは、前の出版物9で見つけることができます。

4. グルコースとインスリン耐性試験

  1. グルコース耐性試験(GTT)では、断食を受ける前に各マウスの体重と体重を測定し、尾部を永久マーカーでマークして簡単かつ迅速にインデックス作成します。
  2. 一晩の断食のために午後7時に食べ物なしで新しいケージにマウスを置きます。
    注:一晩の絶食は標準的なプロトコルであり、しかもマウス生理学(例えば、長時間絶食10、11後のグルコース使用率の増加)に起因して、より短い空腹(〜6時間)をITTに記載するように使用することができる。
  3. 14~16時間(翌朝午前9時)の絶食後、各マウスの体重と体組成を測定し、体重に基づいてグルコース投与量を算出します。
    注:肥満マウスにおけるグルコース不耐性の過大評価を避けるために、体組成分析から得られた無駄のない質量を用いて、グルコース投与量12、13を算出することができる。
  4. マウスごとに、きれいな手術用ハサミを使用して尾の先端(0.5~1.0 mm)を切ります。血液の最初の滴を拭き取った後、尾から血液の新鮮な滴を引き出し、グルコメーターでベースライン空腹時血糖値を測定します。
    注:GTTまたはITT中のすべての血糖値測定に追加のテール切断は必要ありません。傷は、血液の滴を引くためにガーゼでそれを磨くことによって新鮮にすることができます。
  5. 被験者マウスは、グルコースの腹腔内(すなわち)注射(体重1mg/g)を行う。
    注:実験の目的に基づいて(例えば、インクレチン効果を調べる)、グルコースの経口投与は、経口ガバゲージによって行うことができる。経口GTT(OGTT)のためのプロトコルは、別の研究14で見つけることができます。
  6. 0、5、15、30、60、および120分の後グルコース注射で尾から血糖値を測定します。
  7. GTTを終了した後、十分な量の食品を提供する。
  8. インスリン耐性試験(ITT)の場合は、午前9時に食品を取り除きます。
    注:GTTとITTはどちらも血糖値を上げ、生理学を変えることができるマウスのストレス誘発経験であるため、GTT実験後に少なくとも2~3日の回復を行うことをお勧めします。
  9. 6時間(午後3時)の絶食後、ステップ4.4に記載されているように尾からのベースライン血糖値を測定する。
  10. 被験者マウスをインスリンのi.p.注射(体重0.65mU/g)に投与した。
  11. 0、15、30、60、90、および120分のポストインスリン注射で尾から血糖値を測定します。
  12. ITTを終了した後、十分な量の食品を提供します。

5. 間接カロリメトリー

注:IF処理マウスのエネルギー代謝は、IFの単一サイクルにわたる間接熱量測定を通じてさらに評価することができる。これは酸素消費量(VO2)、二酸化炭素生産(VCO2)、呼吸交換比(RER)、および熱(kcal/h)を測定します。

  1. 実験を実行する前に、間接熱量計システムの電源を少なくとも2時間オンにしてください。
    注:このシステムのウォームアップは正確な測定のために重要である。
  2. 清潔な寝具でケージを準備し、水のボトルを充填し、食品ホッパーにチョウの事前計量量を追加します。
  3. ドリエライトとライムソーダの状態を確認してください。ドリライトのカラーインジケータがピンク色で表示される場合は、ドリライトが大量の水分を吸収したことを示します。
  4. 特定の組成(0.5%CO2、20.5%O2)を使用してシステムをキャリブレーションします。
  5. VO2および VCO2データの正規化に使用される各マウスの体重と体組成を測定します。
  6. ケージごとにマウスを 1 つそっと置きます。
  7. 代謝ケージを組み立て、温度管理された環境室に置き、ガスラインと活動センサーケーブルに接続します。
  8. ソフトウェアを使用して適切な実験パラメータを追加して実験プロファイルを設定した後、測定用のプログラムを実行します。最初の日の測定の目的は、順応の期間を提供し、ベースラインエネルギー代謝を測定することです。
  9. 翌日の午後12時に、マウスをホッパーと底部から食べ物とパン粉を取り除いて24時間の絶食を行う。必要に応じて、清潔な寝具に交換してください。
  10. 24時間後、再供給期間のフードホッパーに予め計量したチョウ量を加える。
  11. 次の 48 時間の測定を続けます。
  12. 測定が完了したら、プログラムを終了し、マウスを元のケージに戻します。食べ物の摂取量を調べるために残りの食べ物の量を測定します。
  13. 間接熱量測定のための詳細なプロトコルは、以前の研究9で見つけることができます。

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結果

図1は、24時間断食後の摂食解析と1:1と2:1の断続的な断食の比較を示しています。24時間の絶食期間は体重を約10%減少させ、2日間の再摂食後に完全に回復した(図1A)。24時間の絶食期間は、その後の2日間の再供給の間に過剰呼吸を誘発した(図1B)。それにもかかわらず、1:1代替日断食と2:1断続的断食の間のエネルギー摂取量の比較は、1:1 IFの再供給期間の1日が十分でないことを明らかにした(〜80%)AL条件と比較して、断食によるカロリー損失を補償するために(図1C)。一方、エネルギー摂取量の99%は、2:1 IFで2日間の給餌中に完全に補償されました。このレジメンは、カロリー摂取量の差に依存しない等カロリーIFの効果の検査を可能にする。

...

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ディスカッション

IFは、ヒトおよび動物の両方の様々な疾患に有益な健康影響を提供することが十分に文書化されている8,15, 16,17,18,19.オートファジーや腸内微生物叢などのその根底にあるメカニズムが最近解明されている。提示されたプロトコルは、食事誘発性肥満および関連する代謝機能障害に対するIFのカロリー非依存性代謝利益を調査するためのマウスにおけるアイソカロリック2:1 IFレジメンを記述する。全体的なカロリー摂取量6、7の減少をもたらす代替日断食(1:1 IF)プロトコルとは異なり、2:1 IFレジメンでさらに1日間の再供給を提供するこ...

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開示事項

著者たちは何も開示する必要はない。

謝辞

K.H.Kはカナダグラント・イン・エイド心臓・脳卒中財団(G-18-0022213)、J.P.ビッケル財団、オタワ大学ハートインスティテュートスタートアップファンドの支援を受けています。H.-K.S.は、カナダ保健研究所(PJT-162083)、ルーベンとヘレン・デニス・スカラーとサンライフ・ファイナンシャル・ファイナンシャル・ニュー・リサーチ・アワード(バンティング&ベスト糖尿病センター(BBDC)と自然科学の糖尿病研究に対する助成金を受けています。カナダのエンジニアリング研究評議会(NSERC)(RGPIN-2016-06610)。R.Y.K.は、オタワ大学心臓病研究基金のフェローシップによって支援されました。J.H.L.はNSERC博士奨学金とオンタリオ大学大学院奨学金の支援を受けました。Y.O.は、UOHI寄付大学院賞、エリザベス2世大学院科学技術大学院奨学金の支援を受けています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
包括的な実験動物モニタリングシステム(CLAMS)コロンバスインスツルメンツ間接熱量計
D-(+)-グルコース溶液Sigma-AldrichG8769GTT用
EchoMRI 3-in-1EchoMRIEchoMRI 3-in-1体組成分析
グルコメーターとストリップベイヤーコンター NEXTこれらはGTTおよびITT実験
用です高脂肪ダイエット(Kcal45%脂肪)Research Diets Inc.#D124513.3Kcal/g
高脂肪食(脂質60%)Research Diets Inc.#D124524.73 Kcal/g
インスリンエル リリーHumulin RITT
マウス株用: B6.CG-Lepob/Jジャクソン研究所#000632Ob/Ob マウス
マウス系統:C57BL/6Jジャクソン研究所#000664
ノーマルチャウ (17% Kcal% 脂肪)Harlan#2918
Scaleメトラー・トレド体重と食物摂取量測定

参考文献

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