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方法論記事

化学的アプローチによるストラタム角質のインビボ共焦点ラマンスペクトルからの水、タンパク質、脂質の解明

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DOI:

10.3791/60186

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2019年9月26日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Procter and Gamble, Beijing Innovative center, 2Procter and Gamble, Mason Business Center, 3Department of Dermatology, Beijing Children's Hospital, 4Chinese Academy of Inspection and Quarantine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、スペクトル外れ値除去およびその後の主要特徴の抽出に対する化学的アプローチと組み合わせた臨床研究におけるヒト被験者からの共焦点ラマンスペクトルの収集のためのプロトコルを提示する。

要約

生体内共焦点ラマン分光法の開発により、ヒト被験者の深度分解能を持つ水、タンパク質、脂質の直接測定が可能になります。この情報は、皮膚関連疾患やスキンケア製品の性能を特徴付けるための非常に重要です。このプロトコルは、共焦点ラマンスペクトル収集の方法と、化学測定を利用したスペクトルデータセットのその後の分析を示す。この方法の目的は、データ収集の標準プロトコルを確立し、データ分析の一般的なガイダンスを提供することです。前処理(例えば、外れ値スペクトルの除去)は、臨床研究から大規模なデータセットを処理する際の重要なステップです。例として、データセットの事前知識に基づくガイダンスを提供し、外れ値の種類を特定し、それらを削除するための具体的な戦略を開発します。主成分解析が行われ、負荷スペクトルを参照材料からのスペクトルと比較し、最終的な多変量曲線分解能(MCR)解析で使用される成分の数を選択します。このアプローチは、大規模なスペクトル データセットから意味のある情報を抽出する場合に成功します。

概要

臨床研究では、生体内共焦点ラマン分光法において、角質層の厚さと水分含有量1、2、3、4を決定し、その浸透を追跡する独自の能力を示している。皮膚5、6にトフェックに適用される活性材料。非侵襲的なアプローチとして、共焦点ラマン分光法は振動モードに基づいて分子信号を検出する。したがって、ラベリングは7を必要としません。インビボ共焦点ラマン分光法は、技術の共焦点性質に基づく深度分解能を有する化学情報を提供する。この深度依存性情報は、スキンケア製品4、8、老化9、10、季節変化3、ならびに皮膚バリア機能疾患の影響を研究する上で非常に有用であり、アトピー性皮膚炎11、12など。高周波ラマン分光法(2,500~4,000cm-1)には多くの情報があり、水は3,250~3,550cm-1の間に異なるピークを生み出します。しかし、約2,800~3,000cm-1の間に集中するタンパク質と脂質のラマンピークは、主にメチレン(-CH2-)とメチル(-CH3)グループ13から生成されるので、互いに重なり合います。.この重複した情報は、個々の分子種の相対的な量を得る際の技術的な課題を提示します。ピークフィッティング14、15および選択的ピーク位置12、16のアプローチは、この課題を解決するために使用されてきた。しかし、これらの単一ピークベースの方法では、同じ成分から複数のラマンピークが同時に変化するため、純粋な成分情報を抽出することは困難です17.我々の最近の出版物18では、純粋な成分情報を解明するためにMCRアプローチが提案された。このアプローチを用いて、生体内共焦点ラマン分光データセットの大きな3つの成分(水、タンパク質、脂質)を抽出した。

大規模な臨床研究の実行は、生体内分光データを収集する個人に要求することができます。場合によっては、スペクトルの取得には1日に何時間も稼働する機器が必要であり、研究は数週間または数ヶ月まで延長することができます。このような条件下では、分光アーティファクトのすべてのソースを特定、除外、および修正するための技術的専門知識を持たない機器オペレータによって分光データが生成される場合があります。結果のデータセットには、分析前にデータから識別および除外する必要がある分光外れ値のごく一部が含まれている場合があります。本論文では、MCRでデータを分析する前に、臨床ラマンデータセットを「クリーンアップ」するための化学測定分析プロセスを詳細に示す。外れ値を正常に除去するには、外れ値の種類と外れ値スペクトルの生成の潜在的な原因を特定する必要があります。次に、特定のアプローチを開発して、ターゲット外れ値を除去できます。これには、データ生成プロセスとスタディ設計に関する詳細な理解を含む、データセットに関する事前の知識が必要です。このデータセットでは、外れ値の大部分は低信号対雑音スペクトルであり、主に1)皮膚表面の上に収集されたスペクトル(30,862のうち6,208)、および2)蛍光室光からのスペクトルへの強い寄与(30,862点中67個)に起因する。皮膚表面の上に集められたスペクトルは、レーザー焦点が皮膚表面に近づき、主に皮膚の下の器械の窓にあるように、弱いラマン応答を生じる。蛍光室光からの強い寄与を持つスペクトルは、計器オペレータのエラーまたは被写体の動きによって生成され、共焦点ラマンコレクションウィンドウが被験者の身体部位によって完全に覆われない状態を生じる。これらのタイプのスペクトルアーティファクトは、データ取得時に分光専門家によるスペクトル獲得時に同定され、修復される可能性がありますが、この研究で使用された訓練を受けた計測器オペレータは、致命的な障害が観察されました。外れ値を識別して除外するタスクは、データ分析プロトコルに組み込まれます。提示されたプロトコルは、この課題を解決するために開発されています。皮膚表面の上の低信号対雑音スペクトルに対処するために、皮膚表面の位置を最初に決定し、皮膚表面の上に収集されたスペクトルの除去を可能にする必要があります。皮膚表面の位置は、補足図1に示すように、ラマンレーザー焦点が皮膚の半分と皮膚の半分である深さとして定義される。低信号対雑音スペクトルを除去した後、主成分分析(PCA)を実施し、蛍光室光ピークが支配する因子を抽出する。これらの外れ値は、対応する因子のスコア値に基づいて削除されます。

このプロトコルは、MCR プロセスで 6 つの主要コンポーネントを決定する方法の詳細情報を提供します。これは、PCA 解析の後に、異なる数の主成分で生成されたモデルの荷重間のスペクトル形状比較を行います。また、参考資料やヒト被験者のデータ収集の実験過程についても詳しく説明する。

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プロトコル

この研究は、1975年ヘルシンキ宣言の倫理ガイドラインに従って、北京小児病院の制度審査委員会によって承認されました。これは、良好な臨床実践のためのICHガイドラインに従って行われました。調査は2015年5月から7月にかけて行われた。

1. アトピー性皮膚炎を持つヒト被験者からの生体内共焦点ラマンスペクトルの採取

  1. 次の基準に従って被験者を含めます。
    1. 4~18歳の被験者を含める。
    2. 軽度から中等度のアトピー性皮膚炎(医師のグローバル評価に従って2または3のスコア)を有する被験者を含み、身体表面の5%〜30%の活動的な疾患症状を有し、腕に少なくとも2つの病変を有する。
    3. AD疾患に直接関連する症状を除き、健康な被験者を含める。
    4. 書面によるインフォームド・コンセントを提供するサブジェクトを含めます。
    5. 個々のトポロジ角度(ITA)値がテスト場所で40より高い被験者を含めます。
  2. 次のいずれかの条件を満たすサブジェクトを除外します。
    1. 現在参加している被験者、または過去4週間以内に任意の試験施設で臨床研究に参加した被験者を除外します。
    2. がんの被験者、または研究前の5年以内に癌の診断または治療を受けた被験者を除外する。
    3. 糖尿病の被験者を除外する。
    4. 被験者を危険にさらすか、または研究結果の正確性を妨げる可能性のある免疫学的または感染症を有する被験者(すなわち、肝炎、結核、HIV、エイズ、ループス、または関節リウマチ)を除外する。
    5. 器械の測定を妨げるか、またはアトピー性皮膚炎だけに皮膚の明確な評価を妨げる皮膚の状態を持つ被験者を除外する。例としては、極端に乾燥した皮膚、損傷した皮膚、切り傷、傷、日焼け、母斑、入れ墨、広範な瘢痕、発疹、過剰な毛の成長、またはにきびが含まれます。
    6. 軽度の精神安定剤を除き、過去1ヶ月以内に経口免疫抑制薬、抗生物質、またはその他の全身療法を使用する被験者を除外する。
    7. 研究者の意見では、研究参加を妨げる他の病状を持つ被験者を除外する。
    8. 試験区域の色素沈着が高い被験者を除外する。
  3. アトピー性皮膚炎研究参加者の病変領域にラベルを付け、図1Aに示すように、病変部位の上または近くに3cm x 4cmの面積を付けてマークする。
  4. 図 1Bに示すように、非病変領域に対して、対応するボディ サイト (左前腕と右前腕) に同じマーカーを付けます。
  5. 図2Aおよび図2Bに示すように、インビボ共焦点ラマン器具の窓に密着してマークされたボディサイトを配置します。ボディサイトに室内光の影響を避けるために、窓全体をカバーします。
  6. ラマン データ収集を実行します。
    注:器械に17 mWの力の671 nmレーザーを使用して2 cm-1および50x顕微鏡の目的(NA = 0.9オイル浸漬)のスペクトル決断を有する。波長は、内蔵のネオンアルゴンランプのスペクトルを使用して校正されます。強度の口径測定はNIST(国立標準研究所)ガラス校正標準のスペクトルを測定することによって行われます。
    1. 図2Cに示すようにスペクトルが観察されるまでフォーカスを移動し、次に焦点を皮膚表面から10μm離します。
    2. 2,510 cm-1 -4,000cm-1周波数領域の 2 μm ステップ サイズで 26 ステップのデータ収集を開始します。1 s の露出時間を使用し、合計で約 10 ~ 15 分続く各領域に対して 8 回の反復を測定します。

2. 参考資料からの共焦点ラマンスペクトルの収集

  1. 参考資料を置き、人間の皮膚層角質体19の主要成分を、共焦点ラマン器具の窓に置く(資料表:牛血清アルブミン(BSA)、脱イオン水(DI水)、セラミド、コレステロール、無料)。脂肪酸、およびスクアレン)。
  2. 上記と同じ収集パラメータを使用して、材料の外側から材料中心に連続して参照材料のラマンスペクトルを収集します。
  3. 2,510~4,000 cm-1の範囲の間に各ラマンスペクトルの下の領域を統合し、これらの26の測定でトップ3の最大値ポイントを特定します。これらの3点からラマンスペクトルを平均して、最終的な基準材料スペクトルを得る。

3. 化学測定解析による外れ値スペクトルの除去

  1. スキンサーフェスを決定し、皮膚外スペクトルを除去します。
    1. ファイル拡張子を '.ric' から '.mat' に変更し、.mat ファイルを MATLAB ソフトウェア プラットフォームにロードします。
    2. [分析] の下にあるインポートされたデータセットを右クリックして、ベースライン (自動加重最小二乗)を使用してベースラインを修正する|その他のツール |デフォルト設定の PLS_Toolbox ソフトウェアでの前処理。
    3. 2,910~2,965 cm-1の値を合計すると、MATLABの合計関数を介して図3Aに示すように、26の連続したステップ測定から各ラマンスペクトルの下の強度値を得ます。
    4. MATLAB のリンスペース関数を使用して、計測器オフセット値(図 3Bの X 軸の値)を 26 ~ 260 から補間します。
    5. MATLAB のスプライン法を使用して強度値を 26 ~ 260 に補間し、新しく生成された 260 の位置値を活用します。
    6. MATLAB のポリフィット関数とポリヴァル関数を使用して、260 ポイントの新しい強度値のセットを取得します。まず、ポリフィット関数の X 入力と Y 入力として 260 の位置と強度の値をそれぞれ使用します。度の値を 20 に設定します。次に、出力係数と 260 の拡張位置値をポリバルの入力として使用して、最終的な 260 強度値を取得します。
    7. MATLAB の最大関数と最小関数を使用して、新しく補間された 260 強度の値から最大ポイントと最小ポイントを識別します。
    8. 最大強度と最小強度値の合計を 2 で割って、平均強度値を計算します。
    9. 平均強度値に最も近い 260 強度値(ステップ 3.1.6 から計算)の強度値を識別し、対応する位置値をスキン サーフェスとして設定します。図 3Bに示すように、この位置値を X 軸のゼロ点として設定します。
    10. ゼロ点と既知の 2 μm ステップ サイズに従って、他のすべての位置値を変更します。
    11. 位置値に従って、皮膚表面の上に収集されたすべてのスペクトルを取り除きます。
    12. 残りのデータを PLS_Toolbox にインポートしてデータセットを作成し、"RamanData.mat" の名前を変更します。
  2. 部屋のライト効果で外れ値スペクトルを削除します。
    1. 皮膚外スペクトルを除去した後、ラマンスペクトルデータセット(RamanData.mat)をロードし、PCA解析を実装します。
    2. MATLAB プラットフォームの下で PLS_Toolbox ソフトウェアにデータセットをロードし、データセットを右クリックして[分析] を選択します。PCA.
    3. 前処理アプローチとして[正規化]を選択し、クロス検証に [なし]を選択します。
    4. 補足図 2に示すように、PCA 分解分析には 3 つのコンポーネントを使用します。
    5. インビボラマン計器のコレクションウィンドウのカバーを取り外し、参照材料データ収集に使用されるのと同じパラメータを使用して、高周波領域の部屋の光スペクトルを収集します。
    6. 補足図 3に示すように、ルーム ライトの背景スペクトルとの比較を通じて、ルーム ライト効果係数を識別します。
    7. 通常よりも有意に高い対応するスコア値を持つスペクトルを削除します(この調査では、データセット全体のスコア値の99.8%以上、この調査では0.16です)。

4. MCR分解解析における成分数の選択

  1. 上記と同じ方法(セクション3.1.2)を使用して、ラマンスペクトルベースラインを修正します。
  2. 前述の前処理データセット (セクション 3.2) に対して PCA 分析を実行しますが、"正規化" ではなく "PQN" – "平均中心" を選択し、固有値を対数スケールでプロットし、コンポーネントの数 (20) を既定の数値としてプロットします。[コンポーネントの選択]ボタンをクリックし、Y 値としてlog (固有値)を選択して分解解析を行います。MCR 解析に使用するコンポーネントの数として、3 ~ 8 個を選択します。
  3. MCR 解析を実行します。
    1. データ選択ボタンを使用して、MCR_main ソフトウェア20にデータセットをロードします。
    2. [コンポーネント数の決定] ボタンをクリックして、コンポーネントの数(3 ~ 8) を選択します。
    3. [初期推定]タブの下にあるピュアボタンをクリックし、変数選択タブの [方向]の下にある[集中]を選択し、[操作]ボタンをクリックします。
    4. [OK]ボタンをクリックし、次のページに[続行] ボタンをクリックします。
    5. 次のページで[続行]をクリックし、それぞれ否定的でないプロファイルタブを持つ種の実装とNr.の下にfnnlsと6を選択します。 [続行]ボタンをクリックします。
    6. このページのセクション 4.3.5 と同じパラメータを選択し、[続行]をクリックします。

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結果

本臨床研究では、生体内共焦点ラマンスペクトルを4~18歳の28人の被験者から採取した。上記のデータ収集プロトコルで合計30,862のラマンスペクトルが収集されました。この大きなスペクトル データセットには、図 4Aに示すように、20% のスペクトル外れ値が含まれています。低信号対ノイズ外れ光線スペクトルは、皮膚表面を決定した後に除去され、続いてPCAがルームライト機能を備えたスペクトルを識別した。このPCAモデルの第3の要因は、ルームライトピークを同定する。これは、同じ共焦点ラマン器具を用いて研究部位で別々に集められた蛍光室光のスペクトルと因子3の負荷スペクトルを比較することによって確認される(補足図3参照)。図 4Bは、このプロセスの後に外れ値スペクトルのほとんどが除去されたことを示します。

PCAは、前処理された共焦点ラマンデ...

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ディスカッション

プロトコルのセクション2および3で説明するように、データ収集中に、各深度プロファイルは、赤い円で強調表示された顕微鏡画像から暗い領域を見つけることによって、計器の窓と皮膚の間に接触する領域で収集されました。図 2C.これらの領域が見つかったら、データ解析手順のスキン サーフェスの位置を正確に決定するために、皮膚表面の上の深度プロファイルを開始することが重要でした。その後、皮膚表面の位置を用いて、対応する深さプロファイルにおける各スペクトルの相対的な深さを決定した。プロトコルのセクション1で述べたように、皮膚表面の上に深さプロファイル10 μmを開始すると、皮膚の外側に5つのデータポイントが生成されます。これにより、皮膚表面の両側の最大信号強度と最小信号強度の位置を正常に決定することができます。また、これらの領域は高い蛍光バックグラウンド信号を生成するため、ペンマークやそばかすなどの高い色素領域を含む場所を測定しないようにすることも重要です。露光時間の選択は、スペクトル品質と測定時間のバランスです。露光時間が長いほど、信号対雑音が改善され、全体的...

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開示事項

著者は何も開示していない。

謝辞

著者らは、企業機能分析およびパーソナルクレンジングケア部門からの財政的支援を大いに認めています。分析アソシエイト・ディレクターのジャスミン・ワン氏とロブ・ガードナー博士の指導と支援、そしてデータ収集に関する彼女の支援に対するLi Yang氏に感謝の意を表したいと思います。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ウシ血清アルブミンSigma-Aldrich
コレステロールSigma-Aldrich
コレステロール 3-硫酸ナトリウムSigma-Aldrich
D-エリスロ-ジヒドロスフィンゴシンSigma-Aldrich
DI水ミリポア(18.2MΩ)
Gen2-SCA skin analyzerRiver Diagnostics, ロッテルダム, オランダGen2
Matlab 2018bMathwork2018b
N-behenoyl-D-erythro-sphingosineAvanti Polar Lipids, Inc.
N-リグノセロイル-D-エリスロ-スフィンガニン(セラミド)Avanti Polar Lipids, Inc.
オレイン酸Sigma-Aldrich
パルミチン酸Sigma-Aldrich
パルミトレイン酸Sigma-Aldrich
PLS_Toolbox version 8.2Eigenvector Research Inc.8.2
RiverIConRiver Diagnostics、ロッテルダム、オランダバージョン3.2
スクワレンシグマ-アルドリッチ
ステアリン酸シグマ-アルドリッチ

参考文献

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