方法論記事

ファージ表示ペプチドライブラリーを用いて線維芽細胞増殖因子受容体2を標的とする小ペプチドのスクリーニングと同定

DOI：

10.3791/60189

⸱

2019年9月30日

 ,  ,  , 
1Institute of Biomedicine & Department of Cell Biology, Jinan University, National Engineering Research Center of Genetic Medicine, Guangdong Provincial Key Laboratory of Bioengineering Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本明細書では、ファージ表示ペプチドライブラリーを用いてFGFR2に結合する小さなペプチドをスクリーニングするための詳細なプロトコルを提示する。さらに、インビトロのFGFR2に対する選択されたペプチドの親和性と細胞増殖を抑制する能力を分析した。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ヒト線維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)ファミリーは、細胞増殖、生存、移行および分化を含む様々な生物学的活動に関与する4つのメンバー、すなわち、FGFR1、FGFR2、FGFR3、およびFGFR4からなる。変異または遺伝子増幅イベントに起因するFGFRシグナル伝達経路におけるいくつかの収差は、様々なタイプの癌で同定されている。したがって、最近の研究は、FGFRの治療的ターゲティングを含む戦略の開発に焦点を当てています.モノクローナル抗体は、パイプライン内のいくつかのペプチドベースの阻害剤しか持ち合わせていません。ここでは、FGFR2のアンタゴニストとして小さなペプチドをスクリーニングするファージ表示技術を用いるプロトコルを提供する。簡単に言えば、ファージ表示ペプチドのライブラリーをFGFR2でコーティングしたプレートでインキュベートした。続いて、非結合ファージをTBST(TBS+0.1%[v/v]Tween-20)によって洗い流し、結合ファージを0.2Mグリシン-HClバッファー(pH2.2)でelate化した。elutedファージをさらに増幅し、バイオパンニングの次のラウンドの入力として使用した。3回のバイオパンニングの後、個々のファージクローンのペプチド配列をDNAシーケンシングにより同定した。最後に、スクリーニングされたペプチドを合成し、親和性および生物学的活性について分析した。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

線維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)は、生体内1における細胞増殖、創傷治癒、血管新生において重要な役割を果たす。様々な腫瘍2、3、4、5で観察されるFGFRシグナル伝達の異常な活性化は、遺伝子増幅、遺伝子変異、染色体収差、および過剰なリガンド分泌6を含む.FGFRを標的とする多くの阻害剤は、臨床試験において有望な治療効果を示しており、主に(1)FGFRの細胞内ドメインに結合する(1)低分子キナーゼ阻害剤、(2)アンタゴニストを標的とするアンタゴニスト細胞外セグメント、および (3) FGF リガンドトラップ6.いくつかの小分子キナーゼ阻害剤はインビトロとインビボ7の両方で良好な治療効果を有するが、それらのほとんどは標的特異性が悪く、高血圧8などの副作用を示す。アンタゴニストの大部分は、モノクローナル抗体9、10およびポリペプチド11である。ペプチドは、その特異性と低い副作用のために小分子よりも利点があります。.それらはまた細胞透過性を保持し、タンパク質薬12と比較して特定の器官に蓄積しない。したがって、標的化された小ペプチドは、有効かつ将来的な治療薬の両方である。

ファージ表示技術は、与えられた分子13、14、15に結合することができる小さなペプチドを識別するための簡単だが強力なツールである。標的分子に結合するために尾部に表示される10以上の9種類のペプチド配列を有する単純なM13ファージに基づくファージ表示ペプチドライブラリーを用いた(材料の表を参照)16。与えられた分子に対するファージの親和性が高いため、結合されていないファージを洗い流し、所望の短いペプチドと密接に結合したファージのみが保持されます。与えられた分子標的は、固定化タンパク質17、18、炭水化物、培養細胞、あるいは無機材料19、20であってもある。ファージ表示技術21を用いて生体内で臓器特異的ペプチドが選択されたエキサイティングな症例が報告された。ファージディスプレイ技術の利点は、高スループット、操作の容易さ、低コストとアプリケーションの広い範囲2を含みます。

本研究では、ファージ表示ライブラリーを用いて固定化タンパク質(FGFR2)に結合する小さなペプチドをスクリーニングする詳細なプロトコルを提供する。この技術の有効性は、イソソーマル滴定カロリー(ITC)によるFGFR2に対する得られたペプチドの親和性、および細胞増殖アッセイによる生物活性を測定することによっても検討される。この方法は、炭水化物、培養細胞、あるいは無機材料に結合する小さなペプチドをスクリーニングするために拡張されてもよい。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 試薬の調製

  1. LB(リソジェニーブロス)培地:トリプトン1g、酵母エキス0.5g、NaCl 0.5gをH2O.オートクレーブの100mLで溶解し、4°Cに保存します。
  2. テトラサイクリンストック:1:1エタノールで20mg/mLを調製:H2O.ストア-20°Cで、使用する前に渦を調製する。
  3. IPTG/X-gal溶液:IPTGの0.5g(イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド)と0.4gのX-gal(5-ブロモ-4-クロロ-3-indolyl β-ガラクトシド)を10mLのDMF(ジメチルホルマミド)で混合する。溶液は、暗闇の中で1年間-20°Cで保存することができます。
  4. LB +テトラサイクリン(テト)プレート:バクトトリプトンの溶解1g、酵母エキス0.5g、NaClの0.5g、およびH2O.オートクレーブの100 mLで寒天の1.5gと<70°Cに冷却します。テトラサイクリンストックの100 μLを追加し、プレートを注ぎます。暗闇の中で4°Cでプレートを保存します。
  5. LB + IPTG/X-galプレート:バクトロトリプトン1g、酵母エキス0.5g、NaCl0.5g、寒天1.5gをH2O.オートクレーブの100mLで溶解し、<70°Cに冷やします。IPTG/X-gal溶液の100 μLを追加し、プレートを注ぎます。暗闇の中で4°Cでプレートを保存します。
  6. グリシン-HCIバッファー(0.2M):1.5014gのグリシンと100mgのBSA(ウシ血清アルブミン)をH2Oの100mLで溶解し、pHをHClで2.2に調整し、0.22 μmフィルターを使用して溶液を濾過し、4°Cで保存します。
  7. トリス-HClバッファー(1M):12.11gのトリス(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン)をH2Oの100mLで溶解し、HCl.オートクレーブでpHを9.1に調整し、4°Cで保存します。
  8. コーティングバッファー(0.1M):H2Oの200mLでNaHCO3の1.68gを溶解し、NaOHでpHを8.6に調整します。0.22 μm フィルターを使用して溶液をろ過し、4 °C に保存します。
  9. ブロッキングバッファ: 0.1 M NaHCO3 (pH 8.6) を 5 mg/mL BSA で準備します。0.22 μm フィルターを使用して溶液をろ過し、4 °C に保存します。
  10. TBS: 150 mM NaCl で 50 mM トリス-HCl (pH 7.5) を準備します。オートクレーブを使用し、室温で保管してください。
  11. 0.05%、0.1%、または0.5%TBST:0.05%、0.1%、または0.5%(v/v)Tween-20でTBSを準備します。0.22 μmフィルターを使用してフィルターを使用し、室温で保存します。
  12. PEG/NaCl: 2.5 M NaCl で 20% (w/v) ポリエチレン グリコール-8000 を準備します。オートクレーブを使用し、室温で保管してください。
  13. TE溶液:1 Mトリス-HCl(pH8.0)の1 mLと50 mM EDTA(pH 8.0)の2mLを混合し、H2O.オートクレーブで100 mLに容積を調整し、室温で保管します。
  14. ヨウ化物バッファー:TEの50 mLでNaIの30gを溶解し、pH 8.0。溶液を室温で暗く保管してください。
  15. トップ寒天:トリプトン1g、酵母エキス0.5g、NaCl0.5g、H2O.オートクレーブ100mLで0.7gのアガリンを溶解し、15mLのアリコに分配する。使用のために室温で保管してください。

2. バイオパンニングの第1ラウンド:FGFR2の細胞外ドメインに結合するファージクローンのスクリーニング

注:環境バクテリオファージによる汚染を最小限に抑えるために、エアロゾル耐性ピペットチップを使用し、すべてのプロトコルに手袋を着用してください。

  1. コーティングバッファーに10 μg/mL FGFR2(純度>97%;材料の表を参照)溶液を調調します。準備された溶液の1 mLを35cm2皿に加え、表面が完全に濡れるまで繰り返し旋回する。振りながら4°Cで一晩インキュベートします。
    注:おとり標的結合剤の選択を避けるために、標的タンパク質は高度に精製されなければならない。
  2. 大腸菌(大腸菌)ER2738を振りながら37°Cで5~10時間LB+テト培地の5mLを接種する。増幅されたER2738細胞は、ステップ3.3の滴定に使用されます。
  3. 皿からコーティング溶液を注ぎ(余分な溶液を除去する必要があります)、ブロッキング溶液を追加します。4 °Cで少なくとも1時間インキュベートする。
  4. ブロッキング溶液を廃棄し、TBST(TBS+ 0.05%(v/v)Tween-20)で6回素早く洗浄します。皿を乾かさないようにしてください。
  5. TBSTの1mLで元のファージライブラリーを再構成し[1011プラーク形成ユニット(PFU)の最終濃度)、コーティングされた皿に加え、室温でシェーカーで2時間静かに揺れる。
  6. 上清を捨て、ステップ2.4で行うように、TBST(TBS + 0.05%(v/v)Tween-20で皿10xを洗います。
    注:バインドされていないファージは、激しい洗浄によって完全に除去する必要があります。
  7. 0.2 Mグリシン-HClバッファー(pH 2.2)の1 mLを皿に加え、室温で10分間ゆっくりと揺さぶり、バインドしたファージを溶出させます。
  8. 溶出物を殺菌されたマイクロフュージチューブに移し、1Mトリス-HCl、pH 9.1の100 μLで中和します。
    注:ステップ2.6では、皿を10倍激しく洗って、バインドされていないファージをできるだけ取り除きます。これは重要なステップです。elutedファージは、1週間4°Cで保存することができます。ただし、できるだけ早く次のステップに進むのが最善です。

3. エリテッドファージのチター判定

  1. 使用前に37°Cで少なくとも1時間の予め暖かいLB + IPTG/X-gal版。
  2. LBのステップ2.8から溶出した溶出物の100 μLの100 μLを準備し、汚染を避けるためにフィルターカートリッジ付きの先端を使用します。
  3. ステップ 2.2 のカルチャを中間ログ フェーズ (OD600 ≥ 0.5) に到達します。殺菌されたマイクロフュージチューブに200 μLの培養物を分配し、溶出希釈ごとに1つ。
  4. 感染を開始するには、ステップ3.2からステップ3.3から大腸菌ER2738培養を含む個々のマイクロフュージチューブに各希釈の10 μLを追加します。渦は迅速に、5分間室温でインキュベートします。
  5. ステップ3.4からLB +IPTG/X-galプレートにコーティングスティックを付けて混合物の90 μLをコーティングします。
  6. 必要に応じて、電子レンジで上部寒天を溶かし、3 mLを無菌培養チューブに分配し、溶出希釈ごとに1つずつ、45°Cでチューブを維持する。ステップ3.4から45°Cの上寒天を含む培養チューブに混合物を移します。素早く混ぜ、すぐに予め温められたLB/IPTG/X-galプレートに培養を注ぎます。プレートをゆっくりと傾けて回転させ、上部の寒天を均等に広げます。
  7. 5分後、プレートを37°Cで一晩反転してインキュベートします。
  8. 約100枚のプラークを持つプレート上のプラークを数えます。各数値にそのプレートの希釈係数を掛けて、10 μL あたりの PFU でファージ力を得ます。
  9. ファージ増幅用の振盪で一晩37°Cで大腸菌ER2738でLB+テト培地の別の5 mLを接種します。
    注: ファージ・ティターには、中間ログ・フェーズ(OD600 ≥ 0.5)で ER2738 のカルチャを使用します。プラークのほとんどがX-gal/IPTGプレート上で白い場合、それはファージのプールが野生のバクテリオファージで汚染されていることを意味します。汚染が発生した場合は、汚染されていないファージストック溶液からのパンステップで再出発する必要があります。

4. ファージ増幅

  1. 希釈(1:100)250 mLエルレンマイヤーフラスコでLBの20 mLのステップ3.8から一晩培養。増幅されていない溶出物を加え、37°Cで4.5hの激しい振盪でインキュベートします。
  2. 4°Cで12,000 x gで10分間遠心管と遠心分離機に培養を移します。上清を新鮮なチューブに移し、遠心分離機を再度、ペレットを捨てます。
  3. 上清の上清の80%を新鮮なチューブに移し、20%PEG/2.5M NaClの1/6ボリュームを加えます。ファージが一晩4°Cで沈殿するようにします。
    注:PEG/2.5 M NaClでよく培養上清を混ぜます。
  4. 4°Cで15分間12,000 x gで沈殿したファージを遠心分離します。上清を捨て、遠心分離機を再び捨て、残留上清をピペットで取り除きます。
  5. TBSの1mLでペレットを再中断し、上清をマイクロフュージチューブに移します。4 °Cで5分間12,000 x gの遠心分離機。
  6. 上清を新鮮なマイクロフュージチューブに移し、20%PEG/2.5M NaClの1/6容積を加えて再び沈殿させます。氷の上で15~60分、12,000 x gで4°Cで10分間インキュベートします。上清を廃棄し、再スピンし、残留上清をピペットで取り除く。
  7. 不純物を除去するために、TBSと遠心分離機の200 μLでペレットを再中断します。上清を新鮮なマイクロフュージチューブに移し、増幅溶出剤を得る。
  8. セクション3に記載されているように増幅されたファージを電化する。
    注:増幅溶出物の希釈は、未増幅溶出物と比較して高くなります。108-1011のシリアル希釈が通常推奨されます。

5. バイオパンニングの第2ラウンド

  1. セクション 2 ~ 4 を繰り返します。
  2. セクション3に記載されているように、増幅溶出物の第2ラウンドをLB+IPTG/X-galプレート上にチターする。
    注: FGFR2 タンパク質のコーティング濃度を 5 μg/mL に低減します。ステップ4.7から増幅されたファージを入力として使用し、最初のラウンド(1011 PFU)と同じタチタを維持します。ファージとFGFR2コーティング皿のインキュベーション時間を1時間に短縮し、洗浄工程でのトウェン濃度を0.1%(v/v)に引き上げます。

6. バイオパンニングの3回戦

  1. 手順 2.1-2.6 を繰り返します。
  2. 20 μM bFGF溶液(FGFR2用リガンド)の1mLを皿に加え、室温で60分間ゆっくりと揺さぶって、結合したファージを溶出させます。
  3. 手順 3.1-3.7 を繰り返します。
    注: FGFR2 タンパク質のコーティング濃度を 2.5 μg/mL に低減します。セクション5から増幅されたファージの第2ラウンドを入力として使用し、最初のラウンド(1011 PFU)と同じタチラを維持します。ファージとFGFR2コーティング皿のインキュベーション時間を30分に短縮し、洗浄工程でのトウェン濃度を0.5%(v/v)に引き上げます。

7. シーケンシング用プラークDNAの取得

  1. プラーク増幅
    1. 希釈(1:100)LB.希釈培養1mLの希釈培養剤1mLを2mLチューブに分配し、各クローンに1回ずつ特徴付ける。
    2. ピペットチップを使用して、セクション6からティタープレートから1つのよく分離された青色のプラークを選び、希釈された培養物を含むチューブに移します。合計15個のプラークを選びます。
      注:プレートは<1〜3日前、4°Cで保存され、<100プラークを持っている必要があります。
    3. 37 °Cで4.5 hの激しい揺れでチューブをインキュベートします。
    4. 培養物を遠心管に移し、遠心分離機を12,000 x gで30s.上清を新鮮なチューブと遠心分離機に再度移します。
    5. ピペットを使用して、上清の上清の上80%を新鮮なチューブに移します。これを増幅ファージストックとしてラベル付けします。
      注:100%の無菌グリセロールの等しい容積で増幅されたファージを希釈し、後で使用するために-80 °Cで保存します。
  2. プラークDNAの抽出
    1. 増幅されたファージの500 μLを新鮮なマイクロフュージチューブに移し、20%PEG/2.5 M NaClの1/6体積を追加します。反転して混合し、室温で10-20分間放置します。
    2. 4 °Cで10分間12,000 x gで遠心分離機を注ぎ、上清を注ぎます。
      注:ファージペレットが表示されない場合があります。
    3. 再び遠心分離機。残りの上清は慎重に取り除きます。
    4. チューブを激しく叩いてヨウ化物バッファーの100μLでペレットを完全に再濁させる。
    5. 100%エタノールの250 μLを加え、室温で15分間インキュベートします。
    6. 4°Cで10分間12,000 x gで遠心分離機を除去し、上清を除去する。70%エタノールの0.5 mLでペレットを洗浄し、再び遠心分離機を再び、上清を取り除き、ペレットを短時間乾燥させます。
    7. TE バッファーの 30 μL でペレットを再ステージングし、シーケンシングに使用します。
      注:ステップ7.2.6の前に-20°Cで70%エタノールを事前に冷却します。ファージペレットは、エタノールを添加する前にヨウ化物バッファーに完全に再懸濁されなければならない。

8. ペプチド配列の同定

  1. シーケンシングには、-96 gIII シーケンシング プライマー (5 ́-CCC TCA タグ TTA GCG TAA CG -3 ́) を使用します。
  2. DNAシーケンシング結果に基づいてファージに表示されるペプチド配列を分析します。
  3. 小さなペプチドを合成し、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)と質量分析法で分析し、その純度(≥98%)を確認します。

9. ITCによるFGFR2の得られた小ペプチドおよび細胞外タンパク質の親和性の検出

  1. 超音波器具を使用して脱気滅水。小さなペプチドとFGFR2細胞外タンパク質を無菌水中に溶解する。これらのサンプルを遠心分離して残留沈殿物を除去する。
  2. 25°CでITC滴定実験を行う。シリンジから1.5μMのFGFR2タンパク質を用いて細胞内の小さなペプチドを40μMのツチングし、750rpmの撹拌速度を発する。FGFR2タンパク質を2μLアリコート(合計19個の注射)で5分間隔で添加します。
  3. 単一サイト バインディング モデルを使用して ITC データを分析します。
    注:滅菌水は脱気する必要があり、すべてのサンプルは気泡と残留不純物を除去するために遠心分離する必要があります。実験は25°Cの一定温度で行わなければならない。

10. 細胞増殖アッセイを用いて得られた小ペプチドの生物活性の検証

  1. 種子BALB/c 3T3細胞(3.0×103細胞/ウェル、100μL)を、10%の胎児ウシ血清(FBS)を37°Cおよび5%CO2で一晩10%の胎児牛血清(DMEM)と共に96ウェルプレートに入れた。
  2. 上清を0.5%のFBSで新鮮なDMEMに置き換え、12時間細胞を飢えさせます。
  3. 小さなペプチド(0,0.0064,0.032,0.16,0.8,4,20,100 μM)を0.5%FBS(6重複ウェル/濃度)で補充した新鮮なDMEMを含むシリアル希釈を行います。96ウェルプレートから上清を取り出し、1ウェルあたり100μLの小さなペプチド溶液を加えます。37 °C および 5% CO2で 48 h のインキュベートします。
  4. 上清を10%セルカウントキット(CCK)-8溶液を含む新鮮なDMEMに置き換え、2時間インキュベートします。
  5. マイクロプレートリーダーで450nmで各ウェルの吸光度を測定し、細胞の生存率を分析します。

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結果

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FGFR2を標的とする高親和性の小ペプチドを得る。

FGFR2を標的とするファージをスクリーニングするために、本研究では博士号-7ライブラリを用いて使用した。ワークフローの概略図を図 1 に示します。この過程で、ファージ入力数(PFU)は変化しないまま、FGFR2タンパク質のコーティング濃度は徐々に減少した。ファージ・ティターの結果は、回収されたファージの数が徐々に増加し、3ラウンド後に第1ラウンドと比較して65倍の増加があったことを示唆した(表1)。

次に、第3ラウンドの後にファージクローンをランダムに採取し、シーケンシングのためにファージDNAを抽出した。スクリーニングにより得られた代表的なペプチド(WRARVPL)を1つSP1と命名した。その後合成され、その分子量を質量分析によって測定した。

SP1ペプチドは、FGFR2に対...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

組み合わせファージライブラリーは、標的分子を結合し、その機能13を調節することができる新規ペプチドのハイスループットスクリーニングのための強力かつ効果的なツールです。現在、ファージディスプレイペプチドライブラリーは、幅広い用途を持っている。例えば、それらは、受容体タンパク質23に結合した生理活性ペプチド23、非タンパク質標的24、25、疾患特異的抗原模倣13、細胞特異的ペプチド26、および、27、または組織/臓器特異的ペプチド21、28、29およびペプチド媒介薬物送達

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは金銭的利益の対立を宣言しない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は広州科学技術プログラム(No.201604030039)によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.22 以上 μ;m フィルターメルク ミリポアMPGP002A1
35 cm2 小皿サーモ150460
70% エタノール広州化学試薬工場64-17-5-96
gIII シーケンシング プライマーSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. からの合成
96ウェルプレートNest701001-2
寒天BeyotimeST004D
バクトトリプトンオキソイドL0037
BALB/c 3T3 細胞ATCCCRL-­6587
BSABiodragonBD-M10110
CCK-8 kitDOJINDOCK04
DMEMHyclonesh30243.01
DMFNewprobePB10247
EDTAInvitrogen15576028
FGF2 ProteinSino Biological Inc.10014-HNAE純度 >95%
グリシンSigmaG8898-1KG
IPTGBeyotimeST097
ITC200 システムMicroCal Omega
NaClSigmaS6191
NaHCO3広州化学試薬工場144-55-8
NaIBidepharm
NaOH広州化学試薬工場1310-73-2
PEG–8000SigmaP2139-250
Ph.D.-7 ファージディスプレイペプチドライブラリキットNew England BioLabsE8100SPh.D.-7 ファージライブラリ、E. coli ER2738 host strain and M13KE control phage
Recombinant FGFR2 extracellular domain proteinsSino Biological Inc.10824-H08H純度 > 97%
GL Biochem Ltd. (上海、中国) からの小さなペプチド
トラサイクリンシグマS-SHS-5
トリスシグマSLF-T1503
Tween-20BeyotimeST825
X-galBeyotimeST912
酵母抽出物 OxoidLP0021
BD40879合成テ

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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