本明細書では、ファージ表示ペプチドライブラリーを用いてFGFR2に結合する小さなペプチドをスクリーニングするための詳細なプロトコルを提示する。さらに、インビトロのFGFR2に対する選択されたペプチドの親和性と細胞増殖を抑制する能力を分析した。
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方法論記事
ファージ表示ペプチドライブラリーを用いて線維芽細胞増殖因子受容体2を標的とする小ペプチドのスクリーニングと同定
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
ヒト線維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)ファミリーは、細胞増殖、生存、移行および分化を含む様々な生物学的活動に関与する4つのメンバー、すなわち、FGFR1、FGFR2、FGFR3、およびFGFR4からなる。変異または遺伝子増幅イベントに起因するFGFRシグナル伝達経路におけるいくつかの収差は、様々なタイプの癌で同定されている。したがって、最近の研究は、FGFRの治療的ターゲティングを含む戦略の開発に焦点を当てています.モノクローナル抗体は、パイプライン内のいくつかのペプチドベースの阻害剤しか持ち合わせていません。ここでは、FGFR2のアンタゴニストとして小さなペプチドをスクリーニングするファージ表示技術を用いるプロトコルを提供する。簡単に言えば、ファージ表示ペプチドのライブラリーをFGFR2でコーティングしたプレートでインキュベートした。続いて、非結合ファージをTBST(TBS+0.1%[v/v]Tween-20)によって洗い流し、結合ファージを0.2Mグリシン-HClバッファー(pH2.2)でelate化した。elutedファージをさらに増幅し、バイオパンニングの次のラウンドの入力として使用した。3回のバイオパンニングの後、個々のファージクローンのペプチド配列をDNAシーケンシングにより同定した。最後に、スクリーニングされたペプチドを合成し、親和性および生物学的活性について分析した。
概要
線維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)は、生体内1における細胞増殖、創傷治癒、血管新生において重要な役割を果たす。様々な腫瘍2、3、4、5で観察されるFGFRシグナル伝達の異常な活性化は、遺伝子増幅、遺伝子変異、染色体収差、および過剰なリガンド分泌6を含む.FGFRを標的とする多くの阻害剤は、臨床試験において有望な治療効果を示しており、主に(1)FGFRの細胞内ドメインに結合する(1)低分子キナーゼ阻害剤、(2)アンタゴニストを標的とするアンタゴニスト細胞外セグメント、および (3) FGF リガンドトラップ6.いくつかの小分子キナーゼ阻害剤はインビトロとインビボ7の両方で良好な治療効果を有するが、それらのほとんどは標的特異性が悪く、高血圧8などの副作用を示す。アンタゴニストの大部分は、モノクローナル抗体9、10およびポリペプチ
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プロトコル
1. 試薬の調製
- LB(リソジェニーブロス)培地:トリプトン1g、酵母エキス0.5g、NaCl 0.5gをH2O.オートクレーブの100mLで溶解し、4°Cに保存します。
- テトラサイクリンストック:1:1エタノールで20mg/mLを調製:H2O.ストア-20°Cで、使用する前に渦を調製する。
- IPTG/X-gal溶液:IPTGの0.5g(イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド)と0.4gのX-gal(5-ブロモ-4-クロロ-3-indolyl β-ガラクトシド)を10mLのDMF(ジメチルホルマミド)で混合する。溶液は、暗闇の中で1年間-20°Cで保存することができます。
- LB +テトラサイクリン(テト)プレート:バクトトリプトンの溶解1g、酵母エキス0.5g、NaClの0.5g、およびH2O.オートクレーブの100 mLで寒天の1.5gと<70°Cに冷却します。テトラサイクリンストックの100 μLを追加し、プレートを注ぎます。暗闇の中で4°Cでプレートを保存します。
- LB + IPTG/X-galプレート:バクトロトリプトン1g、酵母エキス0.5g、NaCl0.5g、寒天1.5gをH2O.オートクレーブの100mLで溶解し、<70°Cに冷やします。IPTG/X-gal溶液の100 μLを追加し、プレートを注ぎます。暗闇の中で4°Cでプ....
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結果
FGFR2を標的とする高親和性の小ペプチドを得る。
FGFR2を標的とするファージをスクリーニングするために、本研究では博士号-7ライブラリを用いて使用した。ワークフローの概略図を図 1 に示します。この過程で、ファージ入力数(PFU)は変化しないまま、FGFR2タンパク質のコーティング濃度は徐々に減少した。ファージ・ティターの結果は、回収されたファージの数が徐々に増加し、3ラウンド後に第1ラウンドと比較して65倍の増加があったことを示唆した(表1)。
次に、第3ラウンドの後にファージクローンをランダムに採取し、シーケンシングのためにファージDNAを抽出した。スクリーニングにより得られた代表的なペプチド(WRARVPL)を1つSP1と命名した。その後合成され、その分子量を質量分析によって測定した。
SP1ペプチドは、FGFR2に対.......
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ディスカッション
組み合わせファージライブラリーは、標的分子を結合し、その機能13を調節することができる新規ペプチドのハイスループットスクリーニングのための強力かつ効果的なツールです。現在、ファージディスプレイペプチドライブラリーは、幅広い用途を持っている。例えば、それらは、受容体タンパク質23に結合した生理活性ペプチド23、非タンパク質標的24、25、疾患特異的抗原模倣13、細胞特異的ペプチド26、および、27、または組織/臓器特異的ペプチド21、28、29およびペプチド媒介薬物送達
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開示事項
著者らは金銭的利益の対立を宣言しない。
謝辞
この研究は広州科学技術プログラム(No.201604030039)によって支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.22 以上 μ;m フィルター | メルク ミリポア | MPGP002A1 | |
| 35 cm2 小皿 | サーモ | 150460 | |
| 70% エタノール | 広州化学試薬工場 | 64-17-5-96 | |
| gIII シーケンシング プライマー | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. からの合成 | ||
| 96ウェルプレート | Nest | 701001-2 | |
| 寒天 | Beyotime | ST004D | |
| バクトトリプトン | オキソイド | L0037 | |
| BALB/c 3T3 細胞 | ATCC | CRL-6587 | |
| BSA | Biodragon | BD-M10110 | |
| CCK-8 kit | DOJINDO | CK04 | |
| DMEM | Hyclone | sh30243.01 | |
| DMF | Newprobe | PB10247 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576028 | |
| FGF2 Protein | Sino Biological Inc. | 10014-HNAE | 純度 >95% |
| グリシン | Sigma | G8898-1KG | |
| IPTG | Beyotime | ST097 | |
| ITC200 システム | MicroCal Omega | ||
| NaCl | Sigma | S6191 | |
| NaHCO3 | 広州化学試薬工場 | 144-55-8 | |
| NaI | Bidepharm | ||
| NaOH | 広州化学試薬工場 | 1310-73-2 | |
| PEG–8000 | Sigma | P2139-250 | |
| Ph.D.-7 ファージディスプレイペプチドライブラリキット | New England BioLabs | E8100S | Ph.D.-7 ファージライブラリ、E. coli ER2738 host strain and M13KE control phage |
| Recombinant FGFR2 extracellular domain proteins | Sino Biological Inc. | 10824-H08H | 純度 > 97% |
| GL Biochem Ltd. (上海、中国) からの | 小さなペプチド | ||
| トラサイクリン | シグマ | S-SHS-5 | |
| トリス | シグマ | SLF-T1503 | |
| Tween-20 | Beyotime | ST825 | |
| X-gal | Beyotime | ST912 | |
| 酵母抽出 | 物 Oxoid | LP0021 |
参考文献
- Eswarakumar, V. P., Lax, I., Schlessinger, J. Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors. Cytokine & Growth Factor Reviews. 16 (2), 139-149 (2005).
- Turner, N., Grose, R. Fibroblast growth factor signaling: from development to cancer. Nature Rev....
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再版と許可
