方法論記事

マイクロ流体チップを使用した決定論的方法で単一細胞ベースの共培養を確立する

DOI：

10.3791/60202

⸱

2019年9月27日

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1Institute of Biomedical Engineering and Nanomedicine, National Health Research Institutes, 2Ph.D. Program in Tissue Engineering and Regenerative Medicine, National Chung Hsing University, 3National Institute of Cancer Research, National Health Research Institutes

この記事について

サマリー

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本報告では、複数の単一細胞の高効率ペアリングと顕微鏡解析を実現する単一細胞培養実験を設定するマイクロ流体チップベースの方法について説明する。

要約

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細胞共培養アッセイは、がんを含む疾患の生物学をよりよく理解するために、異なる細胞タイプ間の細胞間相互作用を研究するために広く使用されてきました。しかし、細胞亜集団の不均一性が平均値によって不明瞭であるため、従来の共培養システムを用いた高度異種細胞集団における細胞間相互作用の複雑なメカニズムを明らかにすることは困難である。従来の共培養システムは、集団信号を記述するためにのみ使用できますが、個々の細胞の挙動を追跡することはできません。さらに、従来の単細胞実験法はポアソン分布により細胞操作の効率が低い。微細加工デバイスは、単一細胞研究のための新しい技術であり、高スループットで単一細胞を正確に操作でき、サンプルおよび試薬の消費量を削減できるためです。ここでは、複数の単細胞共培養に対するマイクロ流体チップの概念と応用について述べている。このチップは、培養室内の複数のタイプの単一細胞を効率的に捕捉できる(~46%)単一細胞レベルでの細胞相互作用下での細胞の挙動(例えば、移動、増殖など)を研究するのに有用な十分な培養空間を有する。リンパ内皮細胞と経口扁平上皮癌は、複数の単細胞相互作用研究のためのマイクロ流体プラットフォーム上で単一細胞共培養実験を行うために使用された。

概要

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異なるタイプの単一細胞の効率的な捕捉と十分な培養空間の提供は、複数のタイプの単一細胞1の単一細胞共培養実験に必要である。希釈を制限することは、必要な機器の低コストのために、このような実験のために単一細胞を調圧するために最も一般的に使用される方法です。しかし、ポアソン分布の制限により、最大単一細胞獲得確率はわずか37%であり、実験操作は手間と時間のかかる2を作る。これに対し、蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いることは、単一細胞3を高効率に調製するポアソン分布の限界を克服できる。ただし、高額な計装費やメンテナンスコストにより、一部のラボではFACSにアクセスできない場合があります。微細加工デバイスは、最近、単一細胞トラッピング4、単一細胞ペアリング5、および単一細胞培養用途用に開発された。これらの装置は、単一細胞6を正確に操作する能力、ハイスループット実験を行う、またはサンプルおよび試薬の消費量を減らす能力に基づいて有利である。しかし、現在のマイクロ流体デバイスを用いて複数の細胞型を用いて単一細胞共培養実験を行うことは、ポアソン分布1、7、8、または不能の制限のために依然として困難である。2種類以上の単一セル4、5、6、9、10をキャプチャするデバイス。

例えば、ユンらは細胞相互作用研究11のためのマイクロ流体装置を報告した。この装置は1つの部屋の細胞を対一にするために確率的な方法を使用する。ただし、デバイス構造の幾何学的制限により、2 つの異なるセル タイプのペアリングのみが実現できます。Leeらからの別の報告は、単一細胞12を捕捉し、対にする確定的方法を実証した。この装置は、確定的方法によってペアリング効率を高めるが、細胞のペアリングに必要な長時間の操作時間によって制限される。具体的には、第2の細胞捕捉は、24時間後に最初に捕捉された細胞が表面に取り付けられた後にのみ行うことができる。液滴系マイクロ流体装置は依然としてポアソン分布に限定されており、非接続細胞でのみ使用でき、栽培過程で培養液を変更することはできないことが分かります。

以前は、決定論的な流体力を利用して複数のタイプの単細胞を培養室に捕捉し、その後細胞共培養実験を行って分析できるマイクロ流体「流体力学シャトルチップ」を開発しました。細胞相互作用における個々の細胞移動行動14.流体力学シャトルチップは、それぞれが蛇行バイパスチャネル、キャプチャサイト、および培養室を含むユニットの配列セットで構成されています。蛇行バイパスチャネルと培養室との間の流れ抵抗の差を使用することにより、特別に設計された操作手順により、異なるタイプの単一細胞を培養室に繰り返し捕捉することができる。特に、培養室の十分なスペースは、細胞の捕捉中に細胞がフラッシュされるのを防ぐだけでなく、細胞が広がり、増殖し、移動するのに十分なスペースを提供し、生きている単一細胞相互作用を観察することを可能にする。この記事では、このデバイスの生産と詳細なプロトコル手順に焦点を当てます。

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プロトコル

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1. 柔らかいリソグラフィーによるウエハ金型の製造

注: マスク パターン データは、以前のパブリケーション14で使用できます。

  1. 4インチのシリコンウェーハを120°Cのオーブンで15分間脱水します。
  2. SU-8 2陰性フォトレジストのスピンコート4gを1,000rpmの4インチシリコンウエハに30sで取り付け、5μmの厚い層(層#1)を作成します。
  3. 柔らかいベーク層は65°Cのホットプレートに1分間#1し、その後3分間95°Cのホットプレートに#1層を移します。
  4. 室温に#1する層を冷やし、半自動マスクアライナーのホルダーの上に置き、クロムメッキフォトマスク(キャプチャサイト層)#1層に合わせます。
  5. 150 mJ/cm2の用量で365 nmの紫外線が付いている#1の層を露出させる。
  6. アライナーから層#1を取り出し、65°Cのホットプレートで1分間焼く後焼き#1、95°Cのホットプレートに1分間移します。
  7. 室温に#1涼しい層。プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート溶液に浸漬し、架橋されていないフォトレジストを2分間洗い流し、窒素ガスで穏やかに乾燥し、アライメントマーク#1層を明らかにする。
  8. 粘着テープで層#1アライメントマークを覆い、SU-8 10陰性フォトレジストのスピンコート4gを30sの1,230 rpmで層#1上にスピンコートし、25μmの厚い層#2を作成する。
  9. 65°Cホットプレート上のテープ、ソフトベーク層#2を3分間取り出し、#2層を95°Cのホットプレートに7分間移します。
  10. 室温に#2層を冷却し、半自動マスクアライナーのホルダーに#2層を配置し、層#2クロムメッキフォトマスク(バイパスチャネルレイヤー)をアライメントマーク#1レイヤーに位置合わせします。
  11. 200 mJ/cm2の線量で365 nmの紫外線が付いている#2の層を露出させる。
  12. アライナーから層#2を取り出し、65°Cのホットプレートで1分間焼き、#2層を95°Cのホットプレートに3分間移します。
  13. 室温に#2層を冷却し、粘着テープで層#1アライメントマークを覆う。SU-8 2050陰性フォトレジストのスピンコート4gを30sの1,630 rpmで#2層上に#3。
  14. テープ、柔らかいベーク層を65°Cのホットプレートに5分間#3取り外し、#3層を95°Cのホットプレートに20分間移します。
  15. 室温に#3する層を冷却し、半自動マスクアライナーのホルダーに#3層を置き、層#3クロムメッキフォトマスク(培養室層)をアライメントマーク#1層に合わせます。
  16. 240 mJ/cm2の用量で365 nmの紫外線と#3層を露出させる。
  17. アライナーから#3層を取り出し、65°Cのホットプレートで5分間焼く後焼き#3、95°Cのホットプレートに10分間移します。
  18. 室温に#3層を冷やします。プロピレングリコールモノメチルエーテルエーテル酢酸溶液に浸漬し、架橋されていないフォトレジストを10分間洗い流し、窒素ガスで穏やかに乾燥させます。

2. 複数の単一セルキャプチャのためのPDMSデバイスの準備

  1. 100μLのトリクロロシランを含むウエハ金型と計量皿をデシケータ(サイラ化のみ)に入れ、真空(-85kPa)を15分間塗布します。
    注:ウェーハ表面をトリクロロシランでシラミ化し、PDMS鋳造の前に疎水性表面特性を作成し、ウエハPDMS金型から簡単に剥離できるようにします。
  2. 真空を停止し、少なくとも1時間37°Cでデシケータ内のウエハ金型をシラン化します(シラン化のみ)。
  3. PDMSベースとPDMS硬化剤を10:1の比率で混合します。15cmの皿でウエハ型に合計20gの混合PDMSを注ぎます。
  4. 15cmの皿をデシケータに入れ、真空(-85 kPa)を1.5分間塗布します。その後、デシケータから15センチの皿を取り出します。室温で20分間保管してください。最後に、窒素ガスでPDMSの残留気泡を除去します。
  5. 15 cmの皿を65°Cのオーブンに入れ、PDMSを治すために2-4時間。
  6. ウェーハ金型からPDMSレプリカを取り外し、内径1.5mmと内径0.5mmのパンチャーを使用して、PDMSに1.5mmの入口と0.5mmの出口をパンチします(図1C)。
  7. PDMSレプリカとスライド面を取り外し可能なテープで清掃し、表面を酸素プラズマ(14秒100W)で処理します。
  8. PDMS レプリカをスライドに手動で合わせて配置し、互いに接触させます。
  9. PDMSスライドを65°Cのオーブンに1日置きます。
    注: スライドと PDMS レプリカの間の永続的な結合が実現され、デバイスが形成されます。
  10. PDMSデバイスをリン酸緩衝生理食べ物で満たされた容器に浸し、デシケータに入れます。その後、気泡を除去するために15分間真空(-85 kPa)を適用します。
  11. PDMSデバイスを細胞培養フードに入れ、UV光(光波長:254nm)で30分間デバイスを殺菌します。
  12. PDMSデバイスバッファを媒体(1%の抗生物質および10%の胎児ウシ血清を含むDMEM-F12基底媒体)に置き換え、1日4°CでPDMS装置をインキュベートする。これにより、セルが PDMS サーフェスに付着するのを防ぐことができます。

3. 単細胞懸濁液の調製

注:細胞型は、ヒトリンパ内皮細胞(LEC)、WNT5B特異的shRNA(WNT5B sh4)およびベクターコントロール(pLKO-GFP)を発現するヒトOSCC TW2.6細胞を含む15。詳細な栽培手順については、前回の出版物をご覧ください。

  1. 細胞が70〜80%の合流を達成したときに培養培地を除去する。その後、無菌PBSの5 mLで細胞を3回静かに洗浄します。
  2. 1 μM蛍光色素を含むDMEM-F12培地をWNT5B sh4およびpLKO-GFP細胞(LECにMV2培地を使用)に加え、室温で30分間細胞をインキュベートします。
    注:LECは緑色クロロメチルフルオレセインジアルセイン(CMFDA)色素で染色し、WNT5B sh4細胞は青色7-アミノ-4-クロロメチルクマリン(CMAC)色素で染色し、pLKO-GFP細胞は赤色の黄斑色色で染色した。
  3. 無菌PBSの5 mLで細胞を3回ゆっくり洗います。
  4. PBSを取り外し、0.25%トリプシン-EDTA(0.05%トリプシン-EDTA)の2 mLを追加します。
  5. 室温で4分間細胞をインキュベートし、組織培養皿を軽くタップして細胞剥離を促進します。
  6. WNT5B sh4およびpLKO-GFP細胞を分散させるためにDMEM-F12培地を4mL添加する(LECの場合はMV2培地3mL、トリプシン中和液1mLを使用)。次いで細胞を15mLチューブに移し、遠心分離機を3分間300xgで遠心分離する。
  7. 上清を取り出し、DMEM-F12培地の1mLで細胞ペレットを静かに再不通する。標準的なトリパンブルー排除方法16を使用して、ヘモサイトメーター内の生細胞数をカウントする。DMEM-F12培地中に3 x 105細胞/mL濃度で1mLの細胞懸濁液を調製し、細胞凝集を防ぐために氷の上に細胞を保ちます。
    注:単一細胞捕捉効率を向上させるためには、十分に解離された単一細胞懸濁液の慎重な準備が必要です。

4. 複数の単一細胞捕捉とトリプルシングルセル培養

  1. デバイスの出口とシリンジポンプの間にポリテトラフルオロエチン(PTFE)チューブを接続します。培地を取り出し、3 x 105セル/mLの濃度で1 μLの細胞懸濁液をPDMS装置の入り江に加える。
  2. 0.3 μL/minの流量でシリンジポンプによって装置に細胞懸濁液をロードする(図2A)。流れ方向は、入口から出口までです。
    注:細胞の堆積を防ぐために、入り込みに細胞懸濁液を追加した直後にロードします。
  3. ステップ4.2の後にPDMSデバイスの入り江にDMEM-F12培地の1 μLを追加し、DMEM-F12培地を0.3 μL/minの流量でシリンジポンプでデバイスにロードします(図2B)。流れ方向は入口から出口に流れていた。
  4. DMEM-F12培地の0.3 μLを10 μL/minの流量でシリンジポンプで装置に積み込みます(図2C)。流れ方向は出口から入口に流れていた。
  5. 他のセルタイプをデバイスに読み込むには、手順 4.1 ~ 4.4 を繰り返します。
  6. 細胞捕捉を完了した後、4倍のレンズを持つ顕微鏡を使用して、各培養室を画像化します。
    注:細胞の蛍光放出は、各培養室内の個々の細胞数を同定し、カウントするために使用された。
  7. PTFEチューブを取り外し、入口と出口をポリオレフィンテープで密閉し、密閉培養システムを作成します。
  8. PDMS デバイスを 10 cm 培養皿に移動し、デバイスからの媒体の蒸発を避けるために、PDMS デバイスの周囲に 10 mL の滅菌 PBS を追加します。
  9. 培養皿をインキュベーター(37°C、5%CO2および95%湿度)に移し、3倍の単細胞培養を行います。
  10. 顕微鏡で細胞の成長を12時間ごとに観察し、写真を撮る。

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結果

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このデバイスは、切断されたPDMS装置の断面写真に示すように3層構造を有する(図1A)。最初の層には、培養室とバイパスチャネルを接続するキャプチャサイト(幅6.0 μm、高さ4.6μm)が含まれています。培養室とバイパスチャネルの間の流れ抵抗の違いにより、細胞は捕捉位置に流れ込み、小さな経路の入り口を埋めます。セルがキャプチャ位置でキャプチャされると、小さなパスの流れ抵抗が増加し、次の着信セルが次のダウンストリーム キャプチャ サイトに向かってバイパス チャネルに向かって移動します。第2層のバイパスチャネル(幅25.0μm、高さ26.4μm)の蛇行設計は、その流れ抵抗を高めるために使用されます。第3層(直径500.3μm、高さ111.3μm)の培養室の寸法は、細胞培養実験に十分なスペースを提供し、細胞がチャンバから洗い流されないようにチャンバ内の流量を減らすように設計されています。

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ディスカッション

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腫瘍微小環境における様々な細胞間相互作用は、腫瘍17の進行において重要な役割を果たす。細胞相互作用のメカニズムを理解するために、共培養システムは一般的な分析方法として使用される。しかし、複数の細胞型と細胞自体の不均一性は、実験的な複雑さと分析上の困難を引き起こしています。

流体力学シャトルチップは、希釈法およびマイクロウェルプラットフォームにおけるポアソン分布制限に制限されることなく、確定的な方法によって培養室内の複数の単一細胞負荷を可能にする。高い三重単細胞捕捉効率(45%を超える、ポアソン分布法は5%)培養室では、細胞増殖と増殖に十分な空間があることを実証する(図4)。簡単なセットアップとプロトコルで複数の単一細胞捕捉とライブ細胞培養観察を効率的に実行する能力により、これらのマイクロ流体デバイスは、セルセルを含む幅広いアプリケーションに役立つツールとして考えています。複数の細胞間の相互作用18, 薬物スクリーニング

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開示事項

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著者らは、彼らが競合する金銭的利益を持っていないと宣言します。

謝辞

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この研究は、科学技術省(105-2628-E-400-001-MY2)の助成金と、組織工学・再生医療の博士課程、国立中成大学、国立衛生研究所の助成を受けて行われました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
3M 高度なポリオレフィン診断マイクロ流体医療テープ3M 会社9795R
抗生物質BiowestL0014-100グルタミン - ペニシリン - ストレプトマイシン
AutoCAD ソフトウェアAutodeskAutoCAD LT 2011部品番号 057C1-74A111-1001
CellTracke Blue CMAC 染料InvitrogenC2110
CellTracker Green CMFDA 染料InvitrogenC7025
コンベンショナルオーブンYEONG-SHIN companyovp45
デシケーターBel-Art ProductsF42020-0000省スペース 真空デシケーター 190 mm ホワイトベース
DiIC12(3) 細胞膜色素BD Biosciences354218細胞トラッカーとして使用
DMEM-F12 培地Gibco11320-082
内皮細胞増殖培地 MV 2PromoCellC-22022
ウシ胎児血清 HycloneThermoSH30071.03HI
Hamilton 700 シリーズ ガラスシリンジ ( 0.1 ml )Hamilton80630100 µL、モデル710 RN SYR、小型リムーバブルNDL、22s ga、2インチ、ポイントスタイル2
スユニコアパンチャーテッドペラ株式会社15075内径1.5mmハリ
スユニコアパンチャーテッドペラ社15071内径0.5mmホット
プレートYOTEC社YS-300S
MsakアライナーDeya Optronic CO.A1K-5-MDA
酸素血漿ノードソン マーチAP-300
プラズマクリーナーノードソンAP-300ベンチトップ プラズマ処理システム
ポリジメチルシロキサン (PDMS) キットダウ コーニングシルガード 184
ポリテトラフルオロエテン (フッ素樹脂)エバーシャープテクノロジー株式会社TFT-23T内径0.51mm、外径0.82mm
リムーバブルテープ3M社スコッチリムーバブルテープ 811
シリコンウェーハエルテック社SPE0039
スピンコーターシンレックス(株)SC-HMI 2インチ ~ 6インチ
実体顕微鏡ライカ マイクロシステムズライカ E24
SU-8 10 ネガ型フォトレジストMicroChemY131259
SU-8 2 ネガ型フォトレジストMicroChemY131240
SU-8 2050 ネガ型フォトレジストMicroChemY111072
SU-8 開発元グランドケミカルカンパニーズGP5002-000000-72GCプロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート
シリンジポンプハーバード703007
装置トリクロロシランGelest、IncSIT8174.0トリデカフルオロ-1,1,2,2-テトラヒドロオクチル。危険な。気道を腐食し、水と激しく反応します。
トリプシン中和剤溶液GibcoR-002-100
ハリ製

参考文献

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PDMS

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