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方法論記事

ショウジョウバエ男性アクセサリー腺の二次細胞からRNAを分離するFACSベースのプロトコル

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DOI:

10.3791/60218

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2019年9月5日

 ,  , 
1Department of Genetics and Evolution, University of Geneva

この記事について

サマリー

ここでは、RNAシーケンシングおよびRT-qPCRに対するショウジョウバエ男性アクセサリー腺(二次細胞)から特定の細胞集団を解離し、ソートするプロトコルを提示する。細胞分離は、解剖、プロテアーゼ消化および機械的分散を必要とする多段階解離プロセス後のGFP発現二次細胞のFACS精製によって達成される。

要約

臓器の機能を理解するために、多くの場合、その構成細胞集団の役割を理解することが有用である。残念ながら、個々の細胞集団の希少性は、多くの場合、分子研究のための十分な材料を得ることを困難にします。例えば、ショウジョウバエ男性生殖系の付属腺には、2つの異なる分泌細胞タイプが含まれています。主細胞は腺の分泌細胞の96%を占め、二次細胞(SC)は残りの4%の細胞(雄あたり約80細胞)を構成する。両方の細胞型は精液の重要な成分を産生するが、SCに特異的であることが知られている遺伝子はごくわずかである。SCの希少性は、これまでのところ、この重要な細胞型のトランスクリプトーミクス解析研究を妨げている。ここでは、RNA抽出及びシーケンシングのためのSCの精製を可能にする方法を提示する。プロトコルは、最初にSC特異的GFPレポーターを発現するハエから腺を解剖し、次にこれらの腺をプロテアーゼ消化と機械的解離にさらして個々の細胞を得ることで構成される。これらのステップに続いて、個体、生きている、GFPマーク付き細胞は、RNA精製のための蛍光活性化細胞選別機(FACS)を用いてソートされる。この手順では、1日の間に下流RT-qPCRおよび/またはRNAシーケンシングの条件ごとに約40人の男性からSC特異的RNAが得られます。手順の迅速性と簡易性は、異なる種型または環境条件から、多くの異なるハエのトランスクリプトームを短期間で決定することを可能にします。

概要

臓器は複数の細胞型で構成され、それぞれが個別の機能を持ち、時には非常に異なる遺伝子のセットを発現します。臓器がどのように機能するかを正確に理解するためには、この臓器を構成するそれぞれの異なる細胞型を研究することがしばしば重要です。可能な機能を探索するために使用される主な方法の 1 つは、トランスクリプトーム分析です。この強力な方法は、細胞内の遺伝子発現のスナップショットを提供し、活性プロセスおよび経路を明らかにする。しかし、この種の分析は、はるかに豊富な隣接細胞から精製しなければならない希少な細胞集団では、しばしば困難である。例えば、ショウジョウバエ男性アクセサリー腺は、主に2つの分泌細胞型からなる器官である。2つの細胞タイプの稀な部分は、この腺の細胞のわずか4%を含むので、細胞型特異的トランスクリプトーム分析の使用は、これらの細胞の機能を決定するのに役立たなかった。

アクセサリー腺(AG)は、昆虫の男性の生殖管の器官です。彼らは精液(精液タンパク質(SGP)および付属腺タンパク質(AAP)のほとんどのタンパク質の生産を担当しています。これらのSAFPのいくつかは、交尾雌における生理的および行動的応答を誘発することが知られており、一般に交尾後応答(PMR)と呼ばれる。一部のPMRには、排卵および卵子産卵率の増加、精子の貯蔵および放出、女性の食事療法の変化、および二次求動男性1、2に対する女性受容性の低下が含まれる。昆虫は人間の健康(致命的な病気のベクターとして)から農業(昆虫は害虫でありながら、受粉や土壌の質にとって重要である)に至る多くの主要な社会的問題に影響を与えるので、昆虫の繁殖を理解することは研究の重要な領域です。AGとAGPの研究は、モデル生物のショウジョウバエメラノガスターで大幅に進められている。これらの研究は、AGと彼らがPMRを作成する際に生成する個々のタンパク質の一部の役割を強調し、疾患ベクターAedes aegypti3、4、および他の昆虫1のような他の種の研究に影響を与えました1 、5.さらに、AGが精液1、6の成分を分泌するように、それらはしばしば哺乳動物前立腺および精液胞の機能的類似体と考えられている。この機能の類似性は、2つの組織型間の分子類似性と組み合わされ、AGをハエ7における前立腺のモデルにした。

ショウジョウバエの男性の中には、アクセサリー腺の2つの葉があります。各葉は、中央のルーメンを取り囲む分泌細胞の単層で構成され、平滑筋で包まれた嚢状の構造として見ることができます。前述のように、この腺を構成する形態学的、発達的および機能的に明確な分泌細胞タイプの2つがあります:多角形形の主細胞(細胞の約96%を構成する)と、より大きな円形の二次細胞(SC)(残りの4%の細胞、またはローブあたり約40細胞)。両方の細胞型がPMRを誘導および維持するためにAAPの異なるセットを作り出すことが示されている。現在までに得られたデータのほとんどは、PMRの特徴的な挙動のほとんどを引き起こす単一のタンパク質の役割を強調しています。このタンパク質は、性ペプチド、主細胞8、9、10によって分泌される小さい、36アミノ酸ペプチドである。性ペプチドはPMRに大きな役割を果たしているように見えるが、主細胞と二次細胞の両方によって産生される他のAPCは、PMR11、12、13、14の様々な側面に影響を与えることも示されている。 ,15,16,17.例えば、我々の現在の知識に基づいて、SCは、それらが産生するタンパク質を介して、最初の18日後のSPシグナル伝達の永続化のために必要とされる。

SCの希少性(男性1人につきわずか80細胞)を考えると、これらの細胞とそれらが産生するタンパク質に関するすべての知識は、遺伝学と候補アプローチから来ています。これまでのところ、比較的小さな遺伝子のリストのみがSC特異的であることが示されている。このリストには、ホメオドメインタンパク質欠陥証明(Dve)19、lncRNA MSA20、Rab6、7、11および1921、CG1656およびCG17575 11、および含まれる。 15,21およびホキオーボックス転写因子腹部 B (Abd-B)18.以前に、二次細胞におけるAbd-BおよびlncRNA MSAの発現に対する変異欠損(iab-6cocuD1変異体)は、PMRの長さを〜10日から1日12日に短縮することを示した。,18歳,20.この表現型は、女性の生殖管12、18、20におけるSPの不適切な貯蔵によって引き起こされるようです。細胞レベルでは、この変異体の二次細胞は異常な形態を示し、その特徴的な真空様構造18、20、21を失う。この変異線を用いて、以前に野生型または変異型アクセサリー腺12から全AGの転写プロファイルを比較することにより、SC機能に関与する遺伝子を同定しようと試みた。また、他の研究室は、SC番号、形態および真空含有量が男性の食事、交配状態および年齢21、25、26に依存することを示した。

これらのアプローチを用いて肯定的な進歩がなされたが、完全なSCトランスクリプトームは達成にはほど遠かった。この器官のこれらの細胞の希少性は、野生型細胞からさらに進歩することを困難にしました。遺伝子発現をテストするために、特定の環境刺激後のこれらの細胞の変化はさらに困難であろう。したがって、異なる遺伝的背景や環境条件下で実行するのに十分な速く、簡単なSC RNAを分離および精製する方法が必要でした。

Abd-BおよびMSA遺伝子の両方は、SC18、20における発現のために、ショウジョウバエビオラビホラックスコンプレックス(D1エンハンサーと呼ばれる)からの特定の1.1 kbエンハンサーを必要とする。このエンハンサーは、以前にUAS-GFPに関連付けられている場合、特にSCで強力なGFP式を駆動することができるGAL4ドライバを作成するために使用されてきました。したがって、この行を FACS プロトコルの基礎として使用して、これらの細胞を野生型とiab-6cocuD1 AG の両方から分離します。iab-6cocuD1変異型SCは異なる細胞形態を示すので、このプロトコルは、非常に異なる条件下でこの希少細胞型から転写物の決定のために細胞を単離するために使用できることを示す。

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プロトコル

1.ショウジョウバエライン使用と男性のコレクション

  1. このプロトコルでは、メインセルではなく、SC で GFP を発現するオスを使用します。ここで、AbdB-GAL4ドライバ(参照18に記載)を、UAS-GFP(染色体2上)と組み合わせて使用する。その他の適切なドライバも使用できます。異なる変異条件下でのSCの単離については、変異をSC特異的GFPラインを含むラインに交差させます。
  2. 各遺伝子型の約25の健康な、処女の男性の2つのバッチを収集し、新鮮なドロソフィラ食品とバイアルで3〜4日間25°Cでそれらを老化させる。
    注:年齢、交配状況、栄養、社会環境がそれぞれ生殖生物学に影響を与えるにつれて、これらのパラメータを制御するために厳格なプロトコルに従う必要があります。処女の男性は、標準的なトウモロコシの食事寒天酵母食品で、バイアル当たり20〜25人の男性のグループで、12 h/12 h光/暗いサイクルで25°Cでプパルエクロシオン後3〜4日間熟成されます。

2. ソリューションと材料の準備

  1. 次の解決策を準備します。
    1. 血清補充培地(SSM):シュナイダーのショウジョウバエ培地を10%熱不活性化胎児牛血清と1%ペニシリン-ストレプトマイシンで補体した。
    2. 1xトリプシン酵素(例えば、トリプルエクスプレス酵素)のアリコートを調製し、室温で保存します。
    3. パパイン[50 U/mL]のアリコートを準備します(-20°Cで保存し、解凍は1回のみ)。
    4. 1xリン酸バッファー生理食べ物(PBS、室温で保存)を調出します。
  2. アクセサリー腺の物理的な解離のための複数の炎丸いピペの先端を準備します。
    注:    未処理のプラスチックに付着する傾向があるため、アクセサリー腺を取り扱うには、保持率の低いヒントを使用してください。炎丸めのプロセスは先端の開始を減らし、先端の端を滑らかにする。これは細胞膜をせん断しないでペプチダーゼ消化後の有効な解離を保障する。
    1. 鋭い刃で200 μLの先端を1つ切り、火の上にそっと渡して先端を丸め、開口部が広いが、ステップ3.7の間に取り扱いのために滑らかになるようにします。
    2. 炎の近くで先端の開口部を1秒未満渡すことによって、複数の1,000 μLの先端の開口部を狭くする。先端を少し回転させて、過度の溶融や目詰まりを防ぐ。より狭い場所から広い方に作られたヒントを並べ替えます。これは、吸引の速度をタイミングすることによって行うことができます。AG の小さなスケール サンプルを解離して、最も狭いヒントの効率をテストします。
      注:これらのヒントは、機械的撹拌に不可欠です(手順 5.2 および 5.3)。質の炎丸いピペの先端は細胞の生存率を維持している間完全な解離を可能にする。したがって、これらの先端は、再利用のための手順の最後に水で完全に洗浄されます。これにより、日々の再現可能な解離が可能になります。

3. アクセサリー腺の解剖

  1. 20~25人の雄のショウジョウバエを氷の上のガラス皿に入れます。
  2. SSMで男性1人を解剖する。生殖管を取り外し、消化管から離れて他のすべての組織からアクセサリー腺ペアをクリアします。
    注:放出された精子は塊を作成し、解離プロセスを妨げる可能性があるため、精巣を削除します。目次電球を取り外すと、浮遊時の取り扱いが困難になります。
  3. 鉗子を使用して、室温でSSMで満たされたガラス板に付属品腺を移す。ステップ3.2-3.3を20回繰り返し、SSMで20組の腺のバッチを得る。
    注:これらのステップは15~20分で達成され、AGは健康に見えるべきであり、腺の周りの筋肉層の蠕動運動が見えるはずです。GFPは蛍光顕微鏡を用いて監視することができる。
  4. アクセサリー腺を1x PBSに移し、室温で1~2分の洗浄を行います。
    注:より良い解離のためには、PBSで腺をすすいですることが不可欠です。ただし、このステップの期間は、細胞が PBS でストレスの兆候を示すので制限する必要があります。PBSの解離二次細胞は急速に膨れ上がり、死ぬ。
  5. 20 μL パパイン [50 U/mL] を 1x トリプシン酵素の 180 μL に希釈し、解離溶液を得ます(スケールアップまたはスケールダウンするには、各オスに対して 9 μL のトリプシン酵素と 1 μL のパパインを保持します)。鉗子を使用して、この溶液に付属品腺を移す。
  6. 近位部分からアクセサリ腺(二次細胞を含む)の先端を分離する。細かい鉗子を使用して、腺ローブの真ん中をしっかりとつまみ、2番目の鉗子の鋭い先端で切断します。アクセサリー腺の近位部分と血行ダクトを取り除き、解離を改善し、細胞の選別時間を短縮します。
    注:20組の腺から遠位部分を解剖すると15~20分かかりますが、ペプチダーズによる消化は室温で開始されます。
  7. すべての腺先端を解剖した後、ステップ2.2.1で調製された特別な200 μLピペット先端を使用して1.5 mLチューブに移します。腺を処理する前に、広く、丸みを帯びて濡れるべきです。
    注:ピペ状アクセサリー腺組織には、ヒントは常に適切な溶液(トリプシン酵素またはSSM、この目的のために各チューブを1本ずつ保管)で事前に濡れるべきである。汚染を避けるためにサンプル間の先端を注意深くすすいでください。

4. 組織消化

  1. マイクロチューブを37°Cシェーカーに60分間置き、1,000rpmで揺れます。
    注:撹拌と消化時間の両方が解離を成功させるには重要です。短いまたは動かない消化は、おそらく外側の筋肉層と内側粘性精液がペプチダースからアクセサリー腺細胞を保護するため、解離性が悪くなります。
  2. 室温でSSMを1mL加えて消化を止め、すぐにステップ5に進みます。

5. 細胞の機械的解離

  1. 広い丸みを帯びた1,000 μLチップを使用して、SSMで事前に濡れ、サンプルを24ウェルプレートに移します。顕微鏡下でGFP蛍光を監視する:ほとんどの腺先端は無傷に見え、いくつかのSCは取り外す必要があります。
  2. ステップ2.2.2で生成された丸みを帯びた狭いピペットの先端を使用して、付属の腺組織を破壊するために上下3~5回ピペット。
    注:蛍光を監視して、大きな組織パッチが分解されていることを確認します。そうでない場合は、手順 5.2 を繰り返します。
  3. 非常に狭い丸みを帯びたピペットチップ(ステップ2.2.2で生成)を使用して、ピペットを上下に1~2回使用します。
    注:ステップ 5.3 の後に表示されるのは、個々のセルのみです。それらはプロセスの容易な監視を可能にするので24ウェル版を使用することを推薦する。いくつかのサンプルが処理され、満足のいく結果(健康に見える二次細胞が完全に解離された)を与えると、ピペッティングステップはマイクロチューブで実行されます。
  4. 細胞がウェルの底に落ち着き、余分なSSMを取り除いて選別時間を短縮するために、少なくとも15分待ちます。
    注:細胞を定着させることは遠心分離のような代替方法よりも優れていることが証明され、FACSの直前の細胞の最後の目視検査を可能にする。
  5. きれいな1.5 mLチューブに細胞をピペ状にし、同一のサンプル(各条件に対して20人の男性の2つのバッチ)をプールします。最後の細胞を回収するためにSSMで井戸をすすいで、チューブにピペを入れます(少量を使用)。
  6. 1.5 mLマイクロチューブで、300 μLの細胞溶解溶液と1 μLのプロテネーゼK[50 μg/μL]を加えます(RNA精製キットで提供される溶液は、ステップ7を参照)。各サンプルに 2 本のチューブを用意します (MC 用と SC 用に 1 つ)。

6. FACS(蛍光活性化細胞選別)

  1. 並べ替えの数分前に並べ替える各サンプルに生存率マーカーを追加します (0.3 mM Draq7)。
    注意:Draq7 は注意して取り扱う必要があります。
  2. 生きた二次細胞(GFP陽性、Draq7陰性細胞)の均質な集団をソートする。別のマイクロチューブでは、主細胞の集団(より小さい、GFP陰性、Draq7陰性細胞)をソートする。次の FACS ゲーティング戦略を使用します。
    注:    セルソータの圧力を25 PSIに設定し、100 μmのノズルを通して細胞を通過します。並べ替え速度は約 2,000 セル/s です。
    1. デブリを除外し、FSC-SSC(図2E)に基づいて総セルを選択して、デブリを除外します。
    2. 死んだセルを除外します。640 nmレーザーでDraq7を励起し、795/70バンドパスフィルタで発光蛍光を収集します。ゲートDraq7陽性細胞アウト(図2F)。
    3. SSC-H 対 SSC-W および FSC-A 対 FSC-H (図 2H)のダブルゲーティングを使用してダレットを削除します。
      注:二重ゲーティングを使用して厳密に細胞を二重に除外し、主細胞汚染を低減します。
    4. 約550 GFP陽性細胞を、ライシスバッファーとプロテナセKを用いて1.5mLマイクロチューブにソートします。この集団は二次細胞と見なされる(SC,図2G)。488 nmでGFPを励起し、526/52バンドパスフィルタで発光蛍光を収集します。
    5. 約1,000 GFP陰性細胞を、均質で小さいサイズで、LysisバッファーとプロテナセKを用いた1.5mLマイクロチューブにソートする。この集団は主細胞と考えられている(MC,図2G)。
    6. 渦はすべてのサンプル。
      注:40人の雄(〜40 x 80 SC=3,200の二次細胞)から、600〜800の生きた単一個体二次細胞が得られる(約20〜25%の検索)。サンプルを正規化するために、約 550 SC と 1,000 MC の並べ替えを停止します。

7. RNA抽出

注:我々は、次の適応とRNA抽出のためのエピセンターマスターピュアRNA精製キットを使用しました。他のキットは、収率が~500セルからシーケンスするためのライブラリを準備するのに十分な高さである限り使用できます(ここでは2 ng RNAが使用されました)。

  1. 65°Cでサンプルを15分間加熱し、5分ごとに渦を加熱し、細胞のライシスを完了します。
  2. 5分間氷の上にサンプルを置く核酸沈殿物(部品「全核酸の沈殿」および「全核酸製剤からの汚染DNAの除去」)に従ってください。
  3. RNaseフリーTEバッファの10 μLでRNAペレットを中断します。
  4. RNase阻害剤を添加する(オプション)。
  5. サンプルを-80 °C.で保存します。

8. RNA量、品質、特異性の品質管理

  1. RNAの品質と濃度を推定します。少量と濃度が小さいため、ここでRNA 6000ピコチップを使用してください。良好な品質のRNAは非分解として定義され、rRNAに対応する鋭いピークを持つ低ベースラインとして可視である。
  2. ソートされたセルのアイデンティティを制御する RT-qPCR
    1. プライマーとしてランダムヘキサを使用して、合計RNAの2ngで逆転転写を行います。二次細胞RNAおよび主細胞RNAに対してRTを実行する。
      注: cDN は、希釈、引用符で囲まれ、後で使用するために凍結することができます。
    2. 適切なプライマーペアを用いてリアルタイム定量PCRを行い、ハウスキーピング遺伝子(α-Tubulin,18S rRNA)、二次細胞特異的遺伝子(MSA、Rab19、Abd-B)および主細胞特異的遺伝子(性ペプチド)を定量する。

9. シーケンシング(cDNAライブラリの準備、シーケンス、データ分析)

  1. 合計 RNA の 2 ng を使用して、ポリdT プライマーを使用して cDN を合成します。SMARTer技術を使用して増幅を行います。
  2. Nextera XT キットを使用してライブラリを準備します。
  3. 多重化を用いた配列は、100ヌクレオチド単一読み取りシーケンス(たとえ50ヌクレオチド読み取りがほとんどの目的に適している場合でも)を用いて、各サンプルに対して約3,000万回の読み取りを得る。

10. データ分析

  1. FastQC を実行します。
  2. STAR アライナーを使用して、UCSC dm6 ショウジョウバエ参照ゲノム上の読み取り値をマップし、.bam ファイルを生成します。統合ゲノムビューア(IGV)を使用して、ゲノムブラウザ上の読み取りを視覚化します。
  3. HTSeq を使用して遺伝子数を実行します。
  4. M値のトリム平均(TMM)法を使用して、遺伝子数22を正規化する。edgeR を使用して、微分式、MA プロット、および PCA の統計分析を実行します。
  5. 遺伝子発現解析および統計には、一般線形モデル、偽検出率(FDR)による準尤度F検定、ベンジャメニ&ホッホバーグ補正(BH)を使用します。

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結果

ここで提示されるプロトコルは、1人の実験者がショウジョウバエの男性アクセサリー腺から二次細胞を分離し、1日の間にRNAを抽出することを可能にする(図1)。

Abd-B-GAL4コンストラクト18を使用して二次細胞 (SC) に標識を付けますが、主細胞 (MC) は GFP (図 2A)で標識しません。この手順の目的の1つは、Scの野生型トランスクリプトームを得ることです(野生型はGFPおよびGAL4を発現するトランスジェニックハエから得られるので逆コンマで書かれています)。もう一つの目的は、異なる条件で遺伝子発現を研究することを可能にする迅速かつ容易な手順を通じてSC RNAを得ることである。そこで、この手順は、SC発...

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ディスカッション

虚円盤のようなショウジョウバエ組織からの細胞解離の方法については、既に23について説明されている。単にアクセサリー腺でこれらの手順を使用する試みは失敗し、この新しいプロトコルを開発することを奨励しました。プロテアーゼ消化と機械的トリチュアーションは、手順の成功に向けてトラブルショットを打つ重要なステップであり、実験者が満足のいく結果を得るのを助けるためにセクション2から5に多くの注意事項を配置しました。解離を成功させるためには、ペプチダーズは、内膜の粘性精液および腺の周りの筋肉層によって保護される付属腺細胞に到達する必要があります。腺の遠位部分を解剖することが非常に重要でした(ステップ3.6)。また、少なくとも激しい揺れ(ステップ4.1)で60分間消化する必要があった。トリプシン溶液(例えば、TrypLE)との穏やかな解離は、機械的解離まで腺の完全性および細胞生存率を維持した。トリプシン溶液に関連してパパインまたはコラゲナーゼのいずれかを添加すると、解離が改善されました(完全な解離は、より少ないピペッティングで得られ、より良い細胞生存をもたらす)。しかし、これらの酵素のい...

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開示事項

著者は開示を持っていません。

謝辞

私たちは、カルチ研究室のメンバー、iGE3ゲノミクスプレートフォーム、ジュネーブ大学のフローサイトメトリーコア施設、およびFACSのプロトコルを設定したジャン=ピエール・オーブリー・ラチャナエ博士に感謝しています。私たちは、IGV上の読み取りを視覚化する彼の助けのためにルカスティックリーに感謝します。フィギュアを再利用する優しい許可を与えてくださったことに感謝し、編集者の皆さんから、書き込みをクリエイティブにするよう促してくれました。

この研究は、ジュネーブ州(CI、RKM、FK)、スイス国立研究基金(www.snf.ch)(FKとRKM)、クララズ財団(FK)からの寄付によって資金提供されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
24ウェル 組織培養プレートVWR734-2325
解剖
光源付き双眼鏡
Bunsen
Draq7 0.3 mMBioStatusDR71000
プラスチックマイクロチューブ 1.5 mLエッペンドルフ
FACSベックマン・コールターMoFlo Astrios
微細解剖鉗子
胎児ウシ血清Gibco10270-106熱不活性化
前に ガラス皿 解剖
アイスバケツ
ImProm-II 逆転写システムプロメガA3800
MasterPure RNA精製キットEpicentreMCR85102
Nextera XTキットilluminahttps://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html
>P1000Gilson
P20ギルソン
P200ギルソン
パパイン50U/mL ストック
PBS自家製
ペニシリン-ストレプトマイシンギブコ15070-063
ポリッドTプライマー
ランダムヘキサマープライマー
RNA 6000 ピコキットアジレント
・シュナイダーs Drosophila mediumGibco21720-001
SMARTer cDNA synthesis kitTakarahttps://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits
>SYBR selected Master mix for CFXappliedバイオシステム4472942
サーモシェーカー杭州AllshengインストゥルメンツMS-100
ポネ1250 μL目盛りチップスターラボS1161-1820
ポネ200 μL面取りチップStarlabS1161-1800
TrypLE Express EnzymeGibco12604013
Vortex
用双眼顕微鏡GFP用 使用用ティティ

参考文献

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