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コラーゲン誘発性関節炎モデルにおける組織炎症の分子経路を評価するためのマウス足処理のためのクライオ粉砕プロトコル

DOI:

10.3791/60229

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October 30th, 2019

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1Immunology, Janssen Research & Development, Inc.

In This Article

Summary

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液体窒素冷凍庫ミルを用いてマウス足を処理する極低温粉砕法を開発し、組織から抽出されたRNAまたはタンパク質の収率と品質を向上させ、炎症に関連する分子プロファイルの解析を可能にした。応答。

Abstract

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局所組織における分子変化のプロファイリングは、生体内における治療候補の作用のメカニズムを理解するために重要である。関節炎の研究の分野では、多くの研究は、骨、軟骨、筋肉、間質細胞および免疫細胞の複雑な混合物で構成される炎症性関節に焦点を当てています。ここでは、炎症を起こしたマウスの足を極低温で制御された環境で均質な粉砕サンプルに破壊する信頼性と堅牢な機械的方法を確立しました。タンパク質およびRNAリサートは、局所組織におけるプロテオミクスおよび転写エンドポイントおよび関連する疾患経路の分子特性評価を可能にするために処理された。

Introduction

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関節リウマチ(RA)は、関節に持続性対称性腺炎を有し、皮膚、心臓、肺、眼1などの器官の余分な関節関与を有する慢性全身性炎症性疾患である。免疫応答の全身症状はヒト患者において明らかであるが、RA病理の特徴の1つは、静脈組織における免疫細胞の浸潤およびスイノビアル線維芽細胞の増殖である2である。

ヒトRAと同様に、マウスコラーゲン誘発関節炎(CIA)モデルは、滑膜組織および全身コンパートメントにおける活性免疫応答を有する強い組織炎症を引き起こす。CIAモデルに対する異なるマウス株の感受性は、主要組織適合性複合体(MHC)ハプロタイプおよび抗原特異的T細胞およびB細胞相互作用3、4にリンクする。さらに、自己抗体産生、免疫複合体沈着、骨髄細胞活性化、多関節状症状および眼窩免疫浸潤を伴うパンヌス形成を含むヒトRAにおける多くの病原性経路も、このモデルで明らかである。5、6.研究者は、抗炎症サイトカイン治療の効果を調査するために、この確立されたCIAモデルを採用しています7.抗TNFαおよび抗IL-6のような自己免....

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Protocol

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すべての動物実験は、ヤンセンR&Dの制度動物ケア利用委員会(IACUC)の方針に従って行われました。

1. 極低温冷凍ミルベースの粉砕法

  1. CIAの研究の終了時に、1.5%のイソフルランでマウスを犠牲にし、続いて子宮頸部脱臼を行った。
  2. 組織処理の日には、すべての器具(スパチュラ、粉砕バイアルなど)をドライアイスで10分間冷やし、凍結損傷を避けるためにサーマルグローブを着用してください。
  3. 図 1Aに示すように、ファーラインでハサミで後足をカットします。
  4. 各足を1本の1.5 mLマイクロ遠心管に移し、すぐに液体窒素で凍結し、冷凍足を-80°Cで保存します。サンプルを1週間以上凍結したままにしないでください。
  5. 図1Bに示すように、冷凍庫ミルに液体窒素を充填し、少なくとも10分間平衡化させます。
  6. 未処理のサンプルをドライアイスに保管し、凍結融解サイクルを避けてください。
  7. ボトムスチールプラグで予冷した大型ポリカーボネート研削バイアルに1つのヒンドプを移し、予冷したスチールインパシエータを挿入し、予冷したトップスチールプラグでポリカーボネート研削バイアルを閉じます(....

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Results

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ここで、図2AにCIAマウスの前足から抽出したRNAの代表的なゲル画像可視化を示す。28S rRNAおよび18S rRNAバンドは、すべてのサンプルが十分な量の無傷のRNAを有しっていることを示す。次に、図2Bにタンパク質BCA分析に基づく総タンパク質濃度の代表的な散乱プロットを示す。ナイーブマウス、CIAマウスまたはCIAマウスからの総タンパク質濃度は、グループ間で同等である。タンパク質抽出物中の炎症性サイトカインおよびケモカインの濃度を決定するために、ルミネックス分析を行った。図2Cに、正規化サイトカインおよびケモカイン(pg/mg総タンパク質)の濃度の代表的な散布図を示す。ナイーブマウスと比較して、CIAマウスではいくつかのサイトカインが上昇し、抗IL17A抗体による治療は、いくつかのサイ.......

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Discussion

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経卵組織の分子経路を評価する科学的根拠は強いが、マウスCIAモデルの免疫プロファイリングに関する多くの報告は末梢血に焦点を当て、炎症を起こした足のタンパク質およびRNA分析データはかなり限られている。このバイアスのいくつかの考えられる理由があります: マウス足首関節は〜2 cm以下です。患部は、組織グラインダー、害虫やモルタル、シリカビーズ破壊、トリチュレーションまたは酵素消化のような伝統的な方法を使用して均質化することがしばしば困難である皮膚、骨および結合組織で構成されています。これらの方法は、典型的には、不完全な均質化、低タンパク質またはRNA収率、またはタンパク質分解および核酸分解による一貫性のない品質をもたらす。本明細書に記載される堅牢な方法は、単一の均一なサンプルから疾患の分子シグネチャを確立するための下流のプロテオミクスおよび転写プロファイリングの努力を可能にするために均質な粉砕された凍結粉末を生成するための詳細な手順を提供するソース。

このメソッドを実行する場合は、いくつかの重要な手順を考慮する必要があります。まず、マウスの足は、組織の収穫中に毛皮のラインで切断する必.......

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Disclosures

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著者BJ、SH、ML、RM、ML、TOおよびFSはヤンセン・リサーチ・アンド・デベロップメント社の従業員であり、親会社であるジョンソン・エンド・ジョンソン社の株主です。

Acknowledgements

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著者たちは、原稿とナヴィン・ラオとジェニファー・タウンの批判的なレビューに対するエディス・ヤンセンの評価を賜ります。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
5 mmのステンレス鋼のビーズQiagen69989
ベータ メルカプトエタノールΣM6250RNASEの酵素を禁じるサンプル還元剤
生物分析装置のキットAgilent5067-1511RNAの修飾のキット
b-mercaptoethanolΣM6250
細胞培養の等級水Corning25-055-CI水
細胞溶解原液細胞シグナル伝達9803
エッペンドルフチューブッペンドルフ22363204マイクロチューブ
エッペンドルフチューブ遠心分離ボックスナルゲン5055エッペンドルフチューブを水平チューブ配置で保持するためのボックス
エバーラスト 247 可変速ロッカーベンチマークサイエンティフィックBR5000
フリーザーミルSpex Sample Prep6875足を粉砕粉末に加工するための冷凍庫/ミル
グラインドバイアルSpex サンプル調製6801足を粉砕粉末に加工するためのポリカーボネートバイアル
ピアスBCAキットピアス23225キット 総タンパク質定量用
キット プロテアーゼ阻害剤 カクテルセット 1カルビオケム539131プロテアーゼ阻害剤
プロテインBCAキットPierce23225
QuantigeneキットサーモフィッシャーQP1013bDNA分析キット
冷蔵微量遠心分離機Eppendorf5417R遠心分離
RLTバッファーQiagen79216RNA抽出バッファー
RNeasyミニキットQiagen74104(RNeasyカラム、RLTバッファー、RW1バッファーを含む)
シェーカーベンチマーク サイエンティフィックBR5000ロッカー/シェーカー
スパチュラVWR10806-412粉末移送用スパチュラ
ステンレス鋼ビーズQiagen69989タンパク質抽出中の混合用ビーズ
チューブ抽出器Spex サンプル調製6884粉砕バイアルの上部を除去するための抽出器
ボルテクサーVWR10153-838サンプルミキシング
エ

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Firestein, G. S. Immunologic mechanisms in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Journal of Clinical Rheumatology. 11, S39-S44 (2005).
  2. McInnes, I. B., Schett, G. The pathogenesis of rheumatoid arthritis. New England Journal of Medicine. 365

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