コラーゲン誘発性関節炎モデルにおける組織炎症の分子経路を評価するためのマウス足処理のためのクライオ粉砕プロトコル

Summary

液体窒素冷凍庫ミルを用いてマウス足を処理する極低温粉砕法を開発し、組織から抽出されたRNAまたはタンパク質の収率と品質を向上させ、炎症に関連する分子プロファイルの解析を可能にした。応答。

Abstract

局所組織における分子変化のプロファイリングは、生体内における治療候補の作用のメカニズムを理解するために重要である。関節炎の研究の分野では、多くの研究は、骨、軟骨、筋肉、間質細胞および免疫細胞の複雑な混合物で構成される炎症性関節に焦点を当てています。ここでは、炎症を起こしたマウスの足を極低温で制御された環境で均質な粉砕サンプルに破壊する信頼性と堅牢な機械的方法を確立しました。タンパク質およびRNAリサートは、局所組織におけるプロテオミクスおよび転写エンドポイントおよび関連する疾患経路の分子特性評価を可能にするために処理された。

Introduction

関節リウマチ(RA)は、関節に持続性対称性腺炎を有し、皮膚、心臓、肺、^眼1などの器官の余分な関節関与を有する慢性全身性炎症性疾患である。免疫応答の全身症状はヒト患者において明らかであるが、RA病理の特徴の1つは、静脈組織における免疫細胞の浸潤およびスイノビアル線維芽細胞^{の増殖である2}である。

ヒトRAと同様に、マウスコラーゲン誘発関節炎(CIA)モデルは、滑膜組織および全身コンパートメントにおける活性免疫応答を有する強い組織炎症を引き起こす。CIAモデルに対する異なるマウス株の感受性は、主要組織適合性複合体(MHC)ハプロタイプおよび抗原特異的T細胞およびB細胞^{相互作用3、4}にリンクする。さらに、自己抗体産生、免疫複合体沈着、骨髄細胞活性化、多関節状症状および眼窩免疫浸潤を伴うパンヌス形成を含むヒトRAにおける多くの病原性経路も、このモデルで明らかである。^5、6.研究者は、抗炎症サイトカイン治療の効果を調査するために、この確立されたCIAモデルを採用しています^7.抗TNFαおよび抗IL-6のような自己免疫または炎症性疾患に対して承認された多くの生物学的製剤は、CIA^{モデル8、9}において有効であることが見出される。

静脈組織における免疫系の相互作用をプロファイリングすることは、RAの病因に関連する分子機構を解明するために重要である。人間の臨床環境では、超音波画像診断の指導の下で針の静脈生検を行うことが一般的です。前臨床の設定では、マウス関節の小さなアーキテクチャは、不可能でない場合、生検手順がはるかに困難になります。最近、異なる終点に影響を与える薬物の組み合わせを評価し、組み合わせ^{アプローチ10}で疾患を解決するために、マウスCIAモデルの利用を実証した。炎症を起こしたマウスの足を均質な微粉末に処理し、RNAとタンパク質を抽出する下流プロセスを確立するために、極低温冷凍ミルベースの粉砕法が採用されました。この方法は、RNAとタンパク質を酵素的および化学的な分解プロセスから保護し、単一の均質化されたサンプルソースに複数の分析方法を適用することを可能にします。

Protocol

すべての動物実験は、ヤンセンR&Dの制度動物ケア利用委員会(IACUC)の方針に従って行われました。

1. 極低温冷凍ミルベースの粉砕法

1. CIAの研究の終了時に、1.5%のイソフルランでマウスを犠牲にし、続いて子宮頸部脱臼を行った。
2. 組織処理の日には、すべての器具(スパチュラ、粉砕バイアルなど)をドライアイスで10分間冷やし、凍結損傷を避けるためにサーマルグローブを着用してください。
3. 図 1Aに示すように、ファーラインでハサミで後足をカットします。
4. 各足を1本の1.5 mLマイクロ遠心管に移し、すぐに液体窒素で凍結し、冷凍足を-80°Cで保存します。サンプルを1週間以上凍結したままにしないでください。
5. 図1Bに示すように、冷凍庫ミルに液体窒素を充填し、少なくとも10分間平衡化させます。
6. 未処理のサンプルをドライアイスに保管し、凍結融解サイクルを避けてください。
7. ボトムスチールプラグで予冷した大型ポリカーボネート研削バイアルに1つのヒンドプを移し、予冷したスチールインパシエータを挿入し、予冷したトップスチールプラグでポリカーボネート研削バイアルを閉じます(図1C)。
8. サンプルと一緒に大きなポリカーボネート粉砕バイアルを液体で事前に充填された冷凍庫に移し、器具の前面にあるゴム留め金で蓋を閉じます。
9. 液体窒素中で1分間冷やします。
10. 1秒あたり10サイクルで1分のプログラムに冷凍ミルを設定し、スタートボタンを押します。冷凍工場がサイクルを完了するのを待ちます。
    注:スチールインモークターが前後に移動すると、機械は太鼓の音を出します。耳栓を使用して難聴を避けてください。
11. 冷凍ミルの蓋を開き、大きなポリカーボネート粉砕バイアルを取り出し、図1Dに示すように抽出器に入れる。上部のスチールプラグを取り外し、スチールプラグがポリカーボネートチューブから滑り出すまで、黒いハンドルに下向きの圧力をかけて取り外します。
12. 開いた大きなポリカーボネート粉砕バイアルをドライアイスに移します。あらかじめ冷やした鉗子でスチールインプレッシエーターを取り外します。
13. 冷凍粉末を予冷50mL円錐管に移します。
14. 重量30〜50mgの凍結粉末を、RNA抽出用のタール状凍結1.5mLマイクロ遠心管、タンパク質抽出用の冷凍粉末100〜200mgに含む。
    注:凍結された粉末は、図 1Eに示すように白または薄いピンクの細かい砂のように見える必要があります。
15. 粉砕されたサンプルを-80°Cで保存し、24時間以内にRNAおよびタンパク質分離に進みます。

2. RNA抽出

1. RLT緩衝液1mLあたり10μLのβ-メルカプトエタノール(β-ME)を加えます。
2. 組織の23.3 mL/mgの比率に対応するRLTバッファーの体積を計算し、凍結粉末でチューブにβ-MEを使用したRLTバッファの適切なボリュームを追加します。この比率は、マウスの足に最適であると経験的に決定した。
3. 10sのための3,000 RPMでサンプルをボルテックス。
4. 1 mLピペットで上下を10回精力的にピペットでよく混ぜます。
5. 20sの3,000 RPMで再びサンプルをボルテックス。
6. チューブを13,000 x gで2分間遠心分離します。
7. 上清の700μLを新鮮なチューブに移し、700°Lの700°Lのエタノールを加えます。
   注:<700 μL がチューブ内にある場合は、70% エタノールの同等の体積を追加しても続行できます。
8. サンプルの700 μLをRNA精製カラムにロードします。
9. 30 s の ≥10,000 x gでチューブを遠心分離します。
10. フロースルーを破棄し、サンプルの残りの部分を RNeasy 列にロードします。
11. 30 s の ≥10,000 x gでチューブを遠心分離します。
12. 流れを捨て、30sの遠心分離で700 μLのRW1バッファを追加してカラムを洗浄します。オプションDNASE消化を行う場合は、DNASE治療の前に350μLのRW1が添加される。 そして、DNASE処理の後にRW1の350 μLを追加します。
13. オプション) DNase 消化ステップを実行し、製造元の指示に従います。
14. 500 μL の RPE バッファーを追加し、その後に 30 s の ≥10,000 x gで遠心分離を加えてチューブを 2 回洗浄します。
15. 2分間≥10,000 x gで遠心分離してカラムを乾燥させます。
16. エルテRNAは、2分間≥10,000 x gで遠心分離50μLの水を加えて、流れを回収し、新しい1.5 mLチューブに移します。
17. さらに分析する前に、研究者の選択方法を使用してRNAの量を決定し、-80°Cで保存します。

3. タンパク質抽出

1. 細胞培養グレードの水を用いて1x細胞溶解原液に10x細胞溶解原液を希釈する。
2. プロテアーゼ阻害剤カクテルセットIを1mLの水で再構成し、100xプロテアーゼ阻害剤ストックを作ります。
3. 1x細胞溶解の9.9 mLにプロテアーゼ阻害剤の100 μLを追加し、1x最終原液を作ります。
4. 4 μL の氷冷 1x 細胞リシス バッファー/mg 組織粉末 (例えば、800 μL のリシス バッファーを 200 mg の組織粉末に) を加えます。
5. チューブに5mmステンレスビーズを1つ追加します。
6. 60sの3,000 RPMでチューブをボルテックスし、チューブを濡れた氷に移し、次のサンプルに進みます。
7. すべてのサンプルチューブを箱に入れ、1,000 RPM、1時間4°Cでロッカーの遠心分離機ボックスを振ります。
   注:研究者は、ボックスを垂直に置くことは、ビーズとのより良い混合を容易にすることができることを見つけることができます。
8. 10,000 x gと 4 °C でチューブを 15 分間遠心分離します。
9. 新鮮なチューブに上清を転送し、上部の脂肪層を避けます。
10. 総タンパク質濃度を決定します。タンパク質リサートの10~30倍の希釈は、BCA試験に最適です。
11. 試料を1.5mLマイクロ遠心管にアリコートし、-80°Cで保存してからさらに分析してください。

Results

ここで、図2AにCIAマウスの前足から抽出したRNAの代表的なゲル画像可視化を示す。28S rRNAおよび18S rRNAバンドは、すべてのサンプルが十分な量の無傷のRNAを有しっていることを示す。次に、図2Bにタンパク質BCA分析に基づく総タンパク質濃度の代表的な散乱プロットを示す。ナイーブマウス、CIAマウスまたはCIAマウスからの総タンパク質濃度は、グループ間で同等である。タンパク質抽出物中の炎症性サイトカインおよびケモカインの濃度を決定するために、ルミネックス分析を行った。図2Cに、正規化サイトカインおよびケモカイン(pg/mg総タンパク質)の濃度の代表的な散布図を示す。ナイーブマウスと比較して、CIAマウスではいくつかのサイトカインが上昇し、抗IL17A抗体による治療は、いくつかのサイ...

Discussion

経卵組織の分子経路を評価する科学的根拠は強いが、マウスCIAモデルの免疫プロファイリングに関する多くの報告は末梢血に焦点を当て、炎症を起こした足のタンパク質およびRNA分析データはかなり限られている。このバイアスのいくつかの考えられる理由があります: マウス足首関節は〜2 cm以下です。患部は、組織グラインダー、害虫やモルタル、シリカビーズ破壊、トリチュレーションまたは酵素消化のような伝統的な方法を使用して均質化することがしばしば困難である皮膚、骨および結合組織で構成されています。これらの方法は、典型的には、不完全な均質化、低タンパク質またはRNA収率、またはタンパク質分解および核酸分解による一貫性のない品質をもたらす。本明細書に記載される堅牢な方法は、単一の均一なサンプルから疾患の分子シグネチャを確立するための下流のプロテオミクスおよび転写プロファイリングの努力を可能にするために均質な粉砕された凍結粉末を生成するための詳細な手順を提供するソース。

このメソッドを実行する場合は、いくつかの重要な手順を考慮する必要があります。まず、マウスの足は、組織の収穫中に毛皮のラインで切断する必...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mmのステンレス鋼のビーズ	Qiagen	69989
ベータ メルカプトエタノール	Σ	M6250	RNASEの酵素を禁じるサンプル還元剤
生物分析装置のキット	Agilent	5067-1511	RNAの修飾のキット
b-mercaptoethanol	Σ	M6250
細胞培養の等級水	Corning	25-055-CI	水
細胞溶解原液	細胞シグナル伝達	9803
エッペンドルフチューブ	ッペンドルフ	22363204	マイクロチューブ
エッペンドルフチューブ遠心分離ボックス	ナルゲン	5055	エッペンドルフチューブを水平チューブ配置で保持するためのボックス
エバーラスト 247 可変速ロッカー	ベンチマークサイエンティフィック	BR5000
フリーザーミル	Spex Sample Prep	6875	足を粉砕粉末に加工するための冷凍庫/ミル
グラインドバイアル	Spex サンプル調製	6801	足を粉砕粉末に加工するためのポリカーボネートバイアル
ピアスBCAキット	ピアス	23225	キット 総タンパク質定量用
キット プロテアーゼ阻害剤 カクテルセット 1	カルビオケム	539131	プロテアーゼ阻害剤
プロテインBCAキット	Pierce	23225
Quantigeneキット	サーモフィッシャー	QP1013	bDNA分析キット
冷蔵微量遠心分離機	Eppendorf	5417R	遠心分離
RLTバッファー	Qiagen	79216	RNA抽出バッファー
RNeasyミニキット	Qiagen	74104	(RNeasyカラム、RLTバッファー、RW1バッファーを含む)
シェーカー	ベンチマーク サイエンティフィック	BR5000	ロッカー/シェーカー
スパチュラ	VWR	10806-412	粉末移送用スパチュラ
ステンレス鋼ビーズ	Qiagen	69989	タンパク質抽出中の混合用ビーズ
チューブ抽出器	Spex サンプル調製	6884	粉砕バイアルの上部を除去するための抽出器
ボルテクサー	VWR	10153-838	サンプルミキシング