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方法論記事

ショウジョウバエメラノガスターにおける血液脳関門完全性に関するアッセイ

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DOI:

10.3791/60233

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2019年9月18日

 ,  , 
1Department of Biology, Loyola University Chicago

この記事について

サマリー

血液脳関門の完全性は、神経系の機能のために重要です。ショウジョウバエメラノガスターでは、血液脳関門は後期胚形成時にグリア細胞によって形成される。このプロトコルは、D.メラノガスター胚および第3の恒星幼虫における血液脳関門形成および維持に関するアッセイ方法について説明する。

要約

適切な神経系の発達は、血液脳関門の形成、神経系へのアクセスを厳密に調節し、毒素や病原体から神経組織を保護する拡散障壁を含む。この障壁の形成の欠陥は神経障害と相関しており、この障壁の内訳は多くの神経変性疾患で観察されている。したがって、潜在的な治療標的を同定するためには、血液脳関門の形成と維持を調節する遺伝子を同定することが重要である。これらの遺伝子が神経発達において果たす正確な役割を理解するためには、改変された遺伝子発現が血液脳関門の完全性に及ぼす影響をアッセイする必要がある。血液脳関門の確立に機能する分子の多くは、フルーツフライ、ショウジョウバエメラノガスターを含む真核生物種全体で保存されていることが判明している。フルーツハエは、神経系の発達と機能を調節する分子機構を調べる優れたモデルシステムであることが証明されています。このプロトコルは、D.メラノガスター発達の胚および幼虫期における血液脳関門の完全性をアッセイするための段階的な手順を説明する。

概要

発達中、細胞間のコミュニケーションと相互作用は、組織および臓器の構造と機能の確立に重要である。いくつかのケースでは、これらの細胞と細胞の相互作用は、適切な臓器機能を確保するために、周囲の環境から臓器を遮断します。これは、血液脳関門(BBB)によって絶縁される神経系の場合です。ヒトにおけるBBBの機能不全はてんかんを含む神経疾患と関連しており、多発性硬化症および筋萎縮性側索硬化症を含む神経変性疾患においてバリアの破壊が観察されている1。哺乳動物において、BBBは内皮細胞2、3との間の緊密な接合によって形成される。フルーツフライを含む他の動物、ショウジョウバエメラノガスターは、グリア細胞からなるBBBを持っています。これらのグリア細胞は、神経系4に出入りする栄養素、廃棄物、毒素、および大きな分子の移動を制御するための選択的に透過性の障壁を形成する。これにより、アクションポテンシャルを発射するために必要な電気化学勾配の維持が可能になり、モビリティとコーディネーション4が可能になります。D. メラノガスターでは、グリアはカリウムが豊富な血液のような血球体5から神経系を保護する。

D.メラノガスターの中枢神経系(CNS)および末梢神経系(PNS)において、2つの外グリア層、下グリアおよび陰グリア、ならびに細胞外マトリックスの外ネットワーク、神経ラメラ、を形成する。ヘモリンパ脳およびヘモリンパ神経関門6は、この記事全体を通してBBBと呼ばれる。発達中に陰皮グリアはポリプロイドになり、神経系を囲むように拡大する 5,6,7,8,9, 10,11.皮下グリアは、血友リンパと神経系5、6、12との間の主な拡散障壁を提供する分離接合部を形成する。これらの接合部は、脊椎動物の骨髄グリアのパラノードで見つかった閉体状接合部と分子的に類似しており、哺乳類13、14のBBBにおけるタイトジャンクションと同じ機能を果たします。15歳,16歳,17.陰腸グリア分裂、成長、および代謝産物および大分子の拡散を調節するために、皮下グリアの周りに包む6,10,18,19.BBB形成は、25 °C 5、8で卵を産んだ後 (AEL)18.5h で完了します。これまでの研究では、BBB形成20、21、22の重要な調節因子である遺伝子を同定した。これらの遺伝子の正確な役割をよりよく理解するためには、これらの潜在的な調節因子の変異がBBBの完全性に及ぼす影響を調べることが重要である。これまでの研究では、胚および幼虫におけるBBBの完全性をアッセイするアプローチを概説してきたが、このアッセイのための包括的なプロトコルは、まだ5、7を説明していない。このステップバイステッププロトコルは、D.メラノガスター胚および第3のスター幼虫期におけるBBB整合性をアッセイする方法について説明する。

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プロトコル

1. サンプルの収集

  1. 胚コレクション
    1. 各胚コレクションケージでは、コレクションに20-25オスの最低50人の処女女性を使用します。これらのハエをコーンミール寒天食品(材料の表)でボトルに入れ、コレクション23を始める前に1−2日間インキュベートする。
      注:より多くのハエを使用することができますが、女性と男性の比率は2:1に保つ必要があります。
    2. 一晩25°Cで、あらかじめ温まったりんごジュース寒天プレート(表1)。
      注:これは、胚の適切なステージングのために必要です。プレートがすぐに乾燥している場合は、室内温器に水を入れたボウルを追加して、チャンバーの湿度を高めます。
    3. ステップ1.1.1からCO2でハエを麻酔し、ハエを回収ケージに移します。あらかじめ温めたリンゴジュース寒天プレートを開いた端にイーストペーストの小さなスミアを置き、赤いスリーブ(材料の表)でケージに固定します。古い胚をクリアするために、ハエが25°Cで1時間リンゴジュース寒天プレートに胚/卵を置くことを許可します。
    4. インキュベーターからコレクションケージを取り外します。ケージメッシュ側を下に反転し、タップするとケージの下部まで飛びます。リンゴジュース寒天を、新しい温めたリンゴジュース寒天プレートを酵母ペーストの小さなスミアに置き換えます。最初のプレートを破棄します。
    5. ハエが新しいリンゴジュース寒天プレートに胚/卵を25°Cで1時間置くことを許可します。1時間のコレクションに続いてこのプレートを廃棄し、注射のための胚を収集するために次のステップに進みます。
    6. 後期段階17胚(20−21 h AEL)を収集するには、ステップ1.1.1−1.1.5から所望の遺伝子型のハエを、25°Cのインキュバーで19時間の年齢プレートを25°Cで25°Cで酵母ペーストの小さなスミアで新しい予温めのリンゴジュース寒天プレートに置くことを可能にします。したがって、胚はイメージング時の年齢の20−21hになります。
      注:このステップは、サンプル収集、注入、およびイメージングの複数のラウンドで必要に応じて繰り返すことができます。
    7. 0.1%のニオニオン界面活性剤(PBTx)でリン酸緩衝生理食べ物(PBS)を加えることによって、70 μmナイロンメッシュを持つ細胞ストレーナーにプレートから胚を集集める。表 1)プレートの表面を覆い、ペイントブラシを使用して表面から胚を緩めます。
    8. 細胞ストレーナーに集めた胚を50%漂白液(表1)で100mmペトリ皿に入れ、室温で時折攪拌して5分間採取する。胚を3倍のリンス化し、毎回PBTxの新鮮な皿を用いてPBTxでセルストレーナーをペトリ皿に旋回させる。
    9. すべての胚が正しい遺伝子型である場合は、ステップ1.1.10に直接進みます。正しい遺伝子型の胚の生成がハエと十字を必要とする場合は、蛍光色のバランサー染色体の有無を使用して正しい遺伝子型の胚を選択する。遺伝子型選択には蛍光機能を備えた立体顕微鏡を使用します。
      注:変形-黄色蛍光タンパク質でマークされたバランサー染色体;クルッペル-Gal4, UAS-緑色蛍光タンパク質 (GFP);とねじれ-Gal4, UAS-GFP は後期胚形成における遺伝子型の選択に適しています (表 2)24,25,26.
    10. ガラスピペットを用いて、PBTxの胚を2%のアガロースゲルスラブに移す(表1)。フィルターペーパーで余分な液体を取り除きます。2%のアガロースゲルスラブに~6−8の胚を右後部、背面を上向きに整列させる(図1B)。
      注:精子が卵に入る小さな穴である微細パイルは、胚の前端に位置する。後端はより丸みを帯びています。気管は白く見え、胚の背部に位置し、胚の背側と腹部側の区別を可能にする(図1B)。
    11. 両面テープ1枚でスライドを準備します。胚の上のスライドをしっかりと押して両面テープに移します。
    12. 室温でインキュベーションして胚を25分間乾燥させる(乾燥剤は使用しない)。乾燥後、胚をハロカーボンオイルで覆う。
      注:乾燥期間は、部屋の温度、湿度、換気によって異なる場合があります。インキュベーション期間は、このプロトコルのセクション2および3に記載されているように、注射用の装置およびイメージング用共焦点顕微鏡をセットアップするために使用されるべきである。
  2. 幼虫コレクション
    1. 所望の遺伝子型の5−10処女雌のハエと、コーンミール寒天食品を含むバイアルで所望の遺伝子型の半分の男性と十字架を設定し、25 °C23でインキュベートします。
    2. 5−7日後、遺伝子型に応じて、鉗子で軽くバイアルから第3の星幼虫をさまよう。幼虫に付き詰まった食物を取り除くために1x PBSで幼虫をすすいでくる。必要に応じて、手順 1.1.9 に記載されているジェノタイピング用のリンゴジュース寒天プレートに幼虫を移します。
    3. 幼虫をペイントブラシで組織に転がし、乾かします。鉗子を使用して両面テープで準備されたスライドに6−8幼虫を移す。

2. 針および試料注入の調製

  1. このプロトコルの開始前にマイクロピペットプーラーに針を引っ張ります。針の引き出しに毛細管を固定し、D.メラノガスター注射のための標準的な針の形および変数に従って引く(表3)27。注射に使用するまで粘土に固定することにより、ペトリ皿に針を格納します。
  2. 胚の25分間の乾燥期間中に20μLゲルローディングピペットチップを使用して、スルフォルホダミン101酸塩化物(材料の表)に結合した10 kDaデキストランの5 μLを持つ針をロードします(ステップ1.1.12)、または転送直後スライドに幼虫を付ける(ステップ1.2.3)。
  3. 針を針ホルダーにロードし、スチールベース(材料の表)に固定されたマイクロマニピュレータの位置。
    注:針は胚注射の顕微鏡段階とほぼ平行で、幼虫注射ではわずかに下方に角度を付ける必要があります。
  4. 射出装置(材料の表)を50 psi、5−10ミリ秒の範囲で10に設定します。
    注:使用する特定の注入装置に対してこれらの設定を変更する必要がある場合があります。
  5. 針のステージとブラシの端にスライドを45°の角度で両面テープの端に対して置き、斜めの壊れた先端を作成します。
    注:胚の場合は、10 kDaデキストランの流れを可能にするのに十分な先端を壊す必要があります。完璧な針は、わずかに角度の先端を持っており、染料の小さな滴は、各注射で出てくるでしょう。幼虫の場合は、先端をもっと壊す必要がありますが、幼虫の体壁を貫通するために斜めの先端を持つ必要があります。より大きな染料が出てくるでしょう。
  6. 染料が針の先端になるまで、フットペダルをポンプします。
  7. 針を胚と平行にするか、幼虫に向かってわずかに下方に傾けるように針を合わせます。
  8. 針を動かして標本の後端を穿刺し、フットペダルをポンピングして試料を注入する。胚に染料を~2nL、幼虫に約220nLの染料を注入する。
    注:注射が成功した場合、胚または幼虫は色素であふれるべきです。
  9. インキュベーションの目的での注射時間に注意してください。胚を室温で10分間インキュベートする。室温で幼虫を30分間インキュベートする。
  10. スライドを下に進み、各標本の注入時間に注意して、追加の標本を注入します。
    注:その後の解剖およびイメージングステップを実行できる速度に応じて、4-8の標本を一度に注入することができる。

3. イメージング用サンプルの調製

  1. 胚のイメージング
    1. 注射後、イメージング用の胚を調記する。カバースリップの配置時に胚の損傷を防ぐためにスペーサーとしてスライド上のサンプルの左右に綿の先端のアプリケーターで石油ゼリーを適用します。
    2. 20倍の目的を持つ胚の深部全体の共焦点顕微鏡を使用して画像サンプル。次の式を使用して、心室神経コード(VNC)で観察された色素を持つ総サンプルの割合を計算します: BBB = VNC/総サンプル数に色素が蓄積されたサンプルの数。
  2. 幼虫の解剖とイメージング
    1. 幼虫サンプルのスライドを事前に準備します。2つのカバースリップを取り付け、マニキュアでスライドに約0.5cm離れた間隔をあけます。
      注:カバースリップは脳のスペーサーとして機能するので、取り付けプロセス中に損傷を受けません。
    2. 30分のインキュベーションに続いて、イメージングに使用されるスライド上で1x PBSで幼虫を直接解剖する。まず、1組の鉗子を使用して幼虫の体の途中で幼虫をつかみ、2組の鉗子を使用して幼虫の前半分と後部半分を分離する。
    3. 次に、1組の鉗子を使用して口のフックで前の領域をつかみ、2組の鉗子を使用して、口のフックをつかむ鉗子の先端の上にボディウォールを反転させる。脳とVNCが暴露される
    4. 神経を切断して脳とVNCを体壁から分離し、スライドから体壁を取り除く(図1C,D)。必要に応じて、想像ディスクを削除します。
    5. 80%グリセロールの10 μLでサンプルをカバーし、イメージングのためにサンプルの上にカバースリップを置きます。
    6. 20倍の目的を用いた神経系組織の深部を通した画像。VNCで観察された色素を持つサンプル全体の割合を計算します。

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結果

ここで説明する方法は、D.メラノガスター胚および幼虫におけるCNS全体のBBBの完全性の可視化を可能にする(図1)。後期胚発生におけるBBB形成の完了時に、BBBは脳およびVNC5から大きな分子を除外する機能を有する。このプロトコルは、この関数を利用してBBB形成をアッセイする。野生型(オレゴンR)後期17(20−21h齢)胚をスルフォルホダミン101酸塩化物蛍光色素に共役10kDaデキストランを注入した場合、大きなデキストラン分子をVNCから除外し、期待通り(図2A)。BBBの完全性に対する遺伝子変異の効果を実証するために、生遺伝子に変異を有する胚が利用された。以前は、生の遺伝子は胚発生時に胚バンドの引き込みを調節することが実証されており、さらに最近では、発達28の間にVNCの形態変化を調節するためにグリアで機能することが示されている。...

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ディスカッション

このプロトコルは、D.メラノガスター発達の後期胚および第3の星幼虫期におけるBBB完全性のアッセイに必要なステップの包括的な説明を提供する。同様のアプローチは、開発中のBBBの完全性をアッセイするために他の場所で説明されているだけでなく、成人段階5、7、29、30.しかし、材料や方法のセクションの手順の説明は、多くの場合、本質的に広く、簡単な実装のための十分な詳細を欠いているため、研究者に代わって重要なトラブルシューティングを必要としています。このプロトコルは、胚および幼虫期のBBB完全性をアッセイするために必要なステップの包括的な説明を提供する。各段階では、開発の正しい段階が検討され、組織アーキテクチャが中断されていないことを確認するために従う重要なステップがあり、BBBを危険にさらす可能性があります。これらのアプローチで成功を収めるためには、正確な結果を得るため...

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開示事項

著者は何も開示していない。

謝辞

著者らは、注射用機器の使用に関して、F.ブライアン・ピケット博士とロドニー・デール博士に感謝しています。この研究は、ロヨラ大学シカゴからM.D.、D.T.、およびJ.J.への研究資金によって資金提供されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10 kDaのスルホダミン101酸性塩化物(テキサスレッド)デキストランThermoFisher ScientificD1863デキストランは、オートクレーブ処理したddH2Oで25 mg/mLの濃度に希釈する必要があります。
20 μL ゲルローディングピペットチップエッペンドルフ22351656
100% エタノール (200 プルーフ)Pharmco-Aaper11000200
アクティブドライイーストレッドスター
寒天ッシャーサイエンティフィックBP1423
アガローフィッシャーサイエンティフィBP160-500
エアコンプレッサーデウォルトD55140
アップルジュースモットの天然リンゴジュース
漂白剤家庭用漂白剤1-5%次亜塩素酸
ホウケイ酸ガラス毛細血管世界精密機器1B100F-4
ボトルプラグフィッシャーサイエンティフィックAS-277
セルストレーナーBDファルコン352350
共焦点顕微鏡オリンパスFV1000サンプルは、20倍対物レンズ(UPlanSApo 20x / 0.75)
コットンチップアプリケーターピューリタン19-062614
両面テープ1/2 "スコッチ
デュモンピンセットを使用してイメージング。パターン #5; .05 x .01 mm TipRobozRS-5015
Fly Food BottlesFisher ScientificAS-355
Fly Food VialsFisher ScientificAS-515
フットペダルトレッドライト IIT-91-S
Gel CasterBio-Rad1704422
Gel TrayBio-Rad1704436
GlassピペットVWR14673-010
グリセロールフィッシャー サイエンティフィックBP229-1
グラニュー糖食料品店から購入。
ハロカーボンオイルラボサイエンティフィック株式会社FLY-7000
光源ショットエース I
マニピュレータースタンドワールド精密機器M10
マイクロマニピュレーターワールド精密機器KITE-R
マイクロピペットプーラーサッター機器P-97
ニードルホルダーワールド精密機器MPH310
ナイトシーフィルターセット電子顕微鏡 科学SFA-LFS-CYYFP
ナイトシーフルアダプターシステム W/ロイヤルブルーカラー ライトヘッド電子顕微鏡 科学SFA-RBGFP
絵筆シンプリーモンズチゼルブレンダー #6
ピペッターフィッシャーサイエンティフィック13-683C
空気圧ポンプワールド精密機器PV830これは、マイクロインジェクターまたは圧力レギュレータとも呼ばれます。私たちの研究で使用されたモデルはもはや利用できないため、これは1つの代替手段です。
塩化カリウムフィッシャー・サイエンティフィBP366-500
リン酸カリウム二塩基性フィッシャー・サイエンティフィックBP363-500
小型胚コレクションケージジェネシー・サイエンティフィック59-100
塩化ナトリウムフィッシャー・サイエンティフィックBP358-212
リン酸ナトリウム二塩基性無水フィッシャー・サイエンティフィックBP332-500
スチールベースプレートワールド精密機器5052
実体顕微鏡カールツァイスステミ 2000組織解剖に使用されます。
透過光源付き実体顕微鏡Baytronix注射に使用されます。
テゴセプト(p-ヒドロキシ安息香酸、メチルエステル)ジェネシーサイエンティフィック20-258
トリトン X-100フィッシャーサイエンティフィックBP151-500非イオン性界面活性剤
バイアルプラグフィッシャーサイエンティフィックAS-273
フィス ック の可視化用 シック

参考文献

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