血液脳関門の完全性は、神経系の機能のために重要です。ショウジョウバエメラノガスターでは、血液脳関門は後期胚形成時にグリア細胞によって形成される。このプロトコルは、D.メラノガスター胚および第3の恒星幼虫における血液脳関門形成および維持に関するアッセイ方法について説明する。
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この記事について
サマリー
要約
適切な神経系の発達は、血液脳関門の形成、神経系へのアクセスを厳密に調節し、毒素や病原体から神経組織を保護する拡散障壁を含む。この障壁の形成の欠陥は神経障害と相関しており、この障壁の内訳は多くの神経変性疾患で観察されている。したがって、潜在的な治療標的を同定するためには、血液脳関門の形成と維持を調節する遺伝子を同定することが重要である。これらの遺伝子が神経発達において果たす正確な役割を理解するためには、改変された遺伝子発現が血液脳関門の完全性に及ぼす影響をアッセイする必要がある。血液脳関門の確立に機能する分子の多くは、フルーツフライ、ショウジョウバエメラノガスターを含む真核生物種全体で保存されていることが判明している。フルーツハエは、神経系の発達と機能を調節する分子機構を調べる優れたモデルシステムであることが証明されています。このプロトコルは、D.メラノガスター発達の胚および幼虫期における血液脳関門の完全性をアッセイするための段階的な手順を説明する。
概要
発達中、細胞間のコミュニケーションと相互作用は、組織および臓器の構造と機能の確立に重要である。いくつかのケースでは、これらの細胞と細胞の相互作用は、適切な臓器機能を確保するために、周囲の環境から臓器を遮断します。これは、血液脳関門(BBB)によって絶縁される神経系の場合です。ヒトにおけるBBBの機能不全はてんかんを含む神経疾患と関連しており、多発性硬化症および筋萎縮性側索硬化症を含む神経変性疾患においてバリアの破壊が観察されている1。哺乳動物において、BBBは内皮細胞2、3との間の緊密な接合によって形成される。フルーツフライを含む他の動物、ショウジョウバエメラノガスターは、グリア細胞からなるBBBを持っています。これらのグリア細胞は、神経系4に出入りする栄養素、廃棄物、毒素、および大きな分子の移動を制御するための選択的に透過性の障壁を形成する。これにより、アクションポテンシャルを発射するために必要な電気化学勾配の維持が可能になり、モビリティとコーディネーション4が可能になります。D. メラノガスターでは、グリアはカリウムが豊富な血液のような血球体5から神経系を保護する。
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プロトコル
1. サンプルの収集
- 胚コレクション
- 各胚コレクションケージでは、コレクションに20-25オスの最低50人の処女女性を使用します。これらのハエをコーンミール寒天食品(材料の表)でボトルに入れ、コレクション23を始める前に1−2日間インキュベートする。
注:より多くのハエを使用することができますが、女性と男性の比率は2:1に保つ必要があります。 - 一晩25°Cで、あらかじめ温まったりんごジュース寒天プレート(表1)。
注:これは、胚の適切なステージングのために必要です。プレートがすぐに乾燥している場合は、室内温器に水を入れたボウルを追加して、チャンバーの湿度を高めます。 - ステップ1.1.1からCO2でハエを麻酔し、ハエを回収ケージに移します。あらかじめ温めたリンゴジュース寒天プレートを開いた端にイーストペーストの小さなスミアを置き、赤いスリーブ(材料の表)でケージに固定します。古い胚をクリアするために、ハエが25°Cで1時間リンゴジュース寒天プレートに胚/卵を置くことを許可します。
- インキュベーターからコレクションケージを取り外します。ケージメッシュ側....
- 各胚コレクションケージでは、コレクションに20-25オスの最低50人の処女女性を使用します。これらのハエをコーンミール寒天食品(材料の表)でボトルに入れ、コレクション23を始める前に1−2日間インキュベートする。
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結果
ここで説明する方法は、D.メラノガスター胚および幼虫におけるCNS全体のBBBの完全性の可視化を可能にする(図1)。後期胚発生におけるBBB形成の完了時に、BBBは脳およびVNC5から大きな分子を除外する機能を有する。このプロトコルは、この関数を利用してBBB形成をアッセイする。野生型(オレゴンR)後期17(20−21h齢)胚をスルフォルホダミン101酸塩化物蛍光色素に共役10kDaデキストランを注入した場合、大きなデキストラン分子をVNCから除外し、期待通り(図2A)。BBBの完全性に対する遺伝子変異の効果を実証するために、生遺伝子に変異を有する胚が利用された。以前は、生の遺伝子は胚発生時に胚バンドの引き込みを調節することが実証されており、さらに最近では、発達28の間にVNCの形態変化を調節するためにグリアで機能することが示されている。.......
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ディスカッション
このプロトコルは、D.メラノガスター発達の後期胚および第3の星幼虫期におけるBBB完全性のアッセイに必要なステップの包括的な説明を提供する。同様のアプローチは、開発中のBBBの完全性をアッセイするために他の場所で説明されているだけでなく、成人段階5、7、29、30.しかし、材料や方法のセクションの手順の説明は、多くの場合、本質的に広く、簡単な実装のための十分な詳細を欠いているため、研究者に代わって重要なトラブルシューティングを必要としています。このプロトコルは、胚および幼虫期のBBB完全性をアッセイするために必要なステップの包括的な説明を提供する。各段階では、開発の正しい段階が検討され、組織アーキテクチャが中断されていないことを確認するために従う重要なステップがあり、BBBを危険にさらす可能性があります。これらのアプローチで成功を収めるためには、正確な結果を得るため.......
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開示事項
著者は何も開示していない。
謝辞
著者らは、注射用機器の使用に関して、F.ブライアン・ピケット博士とロドニー・デール博士に感謝しています。この研究は、ロヨラ大学シカゴからM.D.、D.T.、およびJ.J.への研究資金によって資金提供されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 10 kDaのスルホダミン101酸性塩化物(テキサスレッド)デキストラン | ThermoFisher Scientific | D1863 | デキストランは、オートクレーブ処理したddH2Oで25 mg/mLの濃度に希釈する必要があります。 |
| 20 μL ゲルローディングピペットチップ | エッペンドルフ | 22351656 | |
| 100% エタノール (200 プルーフ) | Pharmco-Aaper | 11000200 | |
| アクティブドライイースト | レッドスター | ||
| 寒天 | ッシャーサイエンティフィック | BP1423 | |
| アガロー | フィッシャーサイエンティフィ | BP160-500 | |
| エアコンプレッサー | デウォルト | D55140 | |
| アップルジュース | モットの天然リンゴジュース | ||
| 漂白剤 | 家庭用漂白剤 | 1-5%次亜塩素酸 | |
| ホウケイ酸ガラス毛細血管 | 世界精密機器 | 1B100F-4 | |
| ボトルプラグフィ | ッシャーサイエンティフィック | AS-277 | |
| セルス | トレーナーBDファルコン | 352350 | |
| 共焦点顕微鏡 | オリンパス | FV1000 | サンプルは、20倍対物レンズ(UPlanSApo 20x / 0.75) |
| コットンチップアプリケーター | ピューリタン | 19-062614 | |
| 両面テープ1/2 " | スコッチ | ||
| デュモンピンセットを使用してイメージング。パターン #5; .05 x .01 mm Tip | Roboz | RS-5015 | |
| Fly Food Bottles | Fisher Scientific | AS-355 | |
| Fly Food Vials | Fisher Scientific | AS-515 | |
| フットペダル | トレッドライト II | T-91-S | |
| Gel Caster | Bio-Rad | 1704422 | |
| Gel Tray | Bio-Rad | 1704436 | |
| Glassピペット | VWR | 14673-010 | |
| グリセロール | フィッシャー サイエンティフィック | BP229-1 | |
| グラニュー糖 | 食料品店から購入。 | ||
| ハロカーボンオイル | ラボサイエンティフィック株式会社 | FLY-7000 | |
| 光源 | ショット | エース I | |
| マニピュレータースタンド | ワールド精密機器 | M10 | |
| マイクロマニピュレーター | ワールド精密機器 | KITE-R | |
| マイクロピペットプーラー | サッター機器 | P-97 | |
| ニードルホルダー | ワールド精密機器 | MPH310 | |
| ナイトシーフィルターセット | 電子顕微鏡 科学 | SFA-LFS-CY | YFP |
| ナイトシーフルアダプターシステム W/ロイヤルブルーカラー ライトヘッド | 電子顕微鏡 科学 | SFA-RB | GFP |
| 絵筆 | シンプリー | モンズチゼルブレンダー #6 | |
| ピペッター | フィッシャーサイエンティフィック | 13-683C | |
| 空気圧ポンプ | ワールド精密機器 | PV830 | これは、マイクロインジェクターまたは圧力レギュレータとも呼ばれます。私たちの研究で使用されたモデルはもはや利用できないため、これは1つの代替手段です。 |
| 塩化カリウム | フィッシャー・サイエンティフィ | BP366-500 | |
| リン酸カリウム二塩基性 | フィッシャー・サイエンティフィック | BP363-500 | |
| 小型胚コレクションケージ | ジェネシー・サイエンティフィック | 59-100 | |
| 塩化ナトリウム | フィッシャー・サイエンティフィック | BP358-212 | |
| リン酸ナトリウム二塩基性無水 | フィッシャー・サイエンティフィック | BP332-500 | |
| スチールベースプレート | ワールド精密機器 | 5052 | |
| 実体顕微鏡 | カールツァイス | ステミ 2000 | 組織解剖に使用されます。 |
| 透過光源付き実体顕微鏡 | Baytronix | 注射に使用されます。 | |
| テゴセプト(p-ヒドロキシ安息香酸、メチルエステル) | ジェネシーサイエンティフィック | 20-258 | |
| トリトン X-100 | フィッシャーサイエンティフィック | BP151-500 | 非イオン性界面活性剤 |
| バイアルプラグ | フィッシャーサイエンティフィック | AS-273 |
参考文献
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate br....
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