造血幹細胞(HSPC)は、血液形成中の代謝可塑性による静止状態から分化状態に移行します。ここでは、HSPCのミトコンドリア呼吸と糖状化を測定するための最適化された方法を提示する。
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この記事について
サマリー
要約
造血幹細胞(HSPC)は、異なる代謝可塑性を有し、血液形成の要求を維持するために静止状態から分化状態に移行することを可能にする。しかし、HSPCの代謝状態(ミトコンドリア呼吸と糖直症)の分析は、非付着性の脆弱なHSPCに対する最適化されたプロトコルの数が限られており、分析することは困難でした。ここでは、代謝呼吸(酸素消費量率)を測定するための明確な、ステップバイステップの指示のセットを提供します。OCR)および糖上昇(細胞外酸性化率;ECAR)のマウス骨髄系統性スカ1+cキット+(LSK)HSPC。このプロトコルは、マウス骨髄からより多くのLSK HSPCを提供し、インキュベーション中のHSPCの生存率を向上させ、非付着性HSPCの細胞外フラックス分析を促進し、酸化リン酸化および糖分解経路を標的とする薬物に最適化された注入プロトコル(濃度および時間)を提供します。この方法は、血液の発達および疾患の間にHSPCの代謝状態および健康の予測を可能にする。
概要
ほとんどの成熟した血液細胞の寿命は短いので、血液の恒常性は、造血幹細胞(HSPC)1の長寿命であるが稀な集団の自己再生と分化に依存する。HSPCは静止しているが、血液系の要求を維持するために刺激時に増殖し、分化を受けるのが速い。各HSPC細胞状態は、ユニークな生物エネルギー需要を必要とするので、代謝の変化は、HSPC運命の決定の主要な要因です。したがって、代謝可塑性の喪失は、静止、自己再生、およびHSPCの分化との間の平衡を変化させることによって、しばしば骨髄またはリンパ増殖性障害を引き起ぐ。HSPC開発の代謝調節の理解は、血液悪性腫瘍2、3、4、5の基礎となるメカニズムを明らかにするために重要である。
ミトコンドリア呼吸と糖状化は、細胞内反応を駆動し、高分子合成に必要なビルディングブロックを生成するためにATPを生成します。HSPCは分化細胞6に比べてミトコンドリア質量が低く、低酸素骨髄ニッチで静止を持続するため、HSPCは主に糖質に依存しています。HSPCの活性化は、静止の損失とその後の細胞周期への入り口につながるミトコンド....
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プロトコル
このプロトコルは、全国小児病院動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認されました。
注:プロトコルは、2 日間にわたる時系列で記述されます。以下のプロトコルに記載されているように、新鮮な試薬を使用してください。
1. アッセイ前日の試薬の調製
-
センサーカートリッジを水和します。
- 非CO2 37°Cのインキュベーターでキャリブラント(材料表)の5mLを一晩インキュベートする。
- フラックスアッセイキット(材料表)を開き、センサーカートリッジ(緑、上)をユーティリティプレート(透明、下)から分離します。次に、センサーカートリッジを上下逆さまにしてユーティリティプレートの横に置きます。
- 滅菌水を使用して、ユーティリティプレート(200°L)と井戸の周りのチャンバー(400°L)を充填します。
- センサーカートリッジをユーティリティプレートに下し、センサーが完全に水で覆われていることを確認します。気泡の形成を避けるために3xをタップします。
- 非CO2 37°Cのインキュベーターに水没したカートリッジを一晩入れます。水の蒸発....
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結果
私たちの抽出方法は、マウスあたり約80,000 LSK HSPCを収穫することができました。LSK細胞の生存率と数は、(1)上肢と下肢、股関節骨、胸骨、肋骨ケージ、脊椎の骨髄を組み合わせたもので、(2)細胞死と凝集を増加させる赤い細胞リシス緩衝液の使用を避けたため、我々の方法で改善された(3)単一有核細胞の密度勾配培地分離を用い、(4)塊の細胞の損失を引き起こすであろう事前冷却緩衝液を使用することを避けた。
細胞外フラックス分析は従来、接着細胞に用いられてきたが、ウェルのPLLコーティングを用い、続いて細胞の遠心分離を行い、LSK HSPCを井戸の表面に付着させることが容易になった。これにより、LSK HSPCの細胞外フラックスを測定することができ、したがってLSK HSPCの代謝の健全性を測定することができました。
細胞は、グリコライシスとミトコンドリア呼吸を使用してエネルギー要件を補充し、増殖および増殖に必要な中間体を生成する。.......
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ディスカッション
ここでは、純粋で生存可能なマウスLSK HSPC集団の最大量の単離と、細胞外フラックス分析装置による糖質およびミトコンドリア呼吸の測定を示す。具体的には、このプロトコルは、LSK HSPCの使用に関する以下の技術的課題を克服する: i) マウス骨髄におけるLSK HSPCの低周波14, ii) LSK HSPCの低基底代謝活性26, iii) LSK HSPCの脆弱さ27,およびiv) LSK HSPCの培養容器15への非付着性.さらに、細胞外フラックスアッセイの最適な性能を得るために、薬物濃度と媒体組成を最適化しました。
骨髄由来のHSPCは、低酸素ニッチに存在し、それらは、彼らの茎の維持のために重要である糖分解表現型を表示する28。逆に、HSPC分化6には呼吸が不可欠である。HSPCの代謝機能障.......
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開示事項
著者たちは何も開示する必要はない。
謝辞
この作品は、国立衛生研究所(HL131645、CA016058)、セントボールドリック財団、ペロトニア財団からの資金援助の一部で支えています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.01% (w/v) ポリ-L-リジン溶液 | Sigma | P8920 | LSK アタッチメント |
| 40 & マイクロに使用;mの細胞のこし器 | フィッシャー科学 | 22-363-547 | 骨をつぶす反 |
| ビオチンMicroBeads | Miltenyi | 130-090-485 | Lin-分離 |
| のBiotinラットの反マウスCD45R/B220クローンRA3-6B2 | BDのBiosciences | 553086 | Lin-の分離 |
| のために使用される Biotin ラット 反マウスCD5クローン53-7.3 | BDのBiosciences | の553019 | Lin-のために使用される分離 |
| ビオチンラット抗マウスCD8aクローン53-6.7 | BDバイオサイエンス | 553029 | リン分離 |
| バイオチンラット抗マウスLy-6GおよびLy-6CクローンRB6-8C5 | BDバイオサイエンス | 553125 | リン分離 |
| バイオチンラット抗マウスTER-119/赤血球細胞クローンTER-119 | BDバイオサイエンス | 553672 | リン分離 |
| CD117(c-Kit)モノクローナル抗体(2B8)、APC | eBioscience | 17-1171-83 | LSK選別に使用 |
| ファルコン 15 mL コニカル遠心チューブ | ファルコンフィッシャーサイエンティフィック | 14-959-53A | 細胞単離に使用 |
| ファルコン 50 mL コニカル遠心チューブ | ファルコンフィッシャーサイエンティフィ | 14-432-22 | 細胞単離に使用 |
| ファルコン丸底ポリプロピレンチューブ | ファルコンフィッシャーサイエンティフィック | 14-959-11A | に使用LSK選別 |
| ウシ胎児血清 | ニューロミクス | FBS001-HI | FACSバッファーに使用 |
| Histopaque-1083 | シグマ | 10831 | フィコール勾配分離に使用 |
| L-グルタミン100x | フィッシャーサイエンティフィック | 25-030-081 | アッセイ培地に使用 |
| LSカラム | Miltenyi | 130-042-401 | リン分離に使用 |
| Ly-6A/E (Sca-1) モノクローナル抗体 (D7)、PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-5981-82 | LSK選別に使用 |
| マウス幹細胞因子(SCF) | PeproTech | 250-03-100UG | アッセイ培地に使用 |
| マウストロンボポエチン(TPO) | PeproTech | 315-14-100UG | アッセイ培地 |
| PBS 1% | Fisher Scientific | SH3002802 | FACS緩衝液に使用 |
| ペニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U/mL) | Fisher Scientific | 15140122 | アッセイ培地に使用 |
| ヨウ化プロピジウム | フィッシャーサイエンティフィック | P1304MP | LSK選別に使用 |
| タツノオトシゴXFp細胞培養ミニプレート | Agilent Technologies | 103025-100 | LSK播種に使用 |
| ピルビン酸ナトリウム(100 mM) | モフィッシャー | 11360070 | アッセイ培地 |
| Streptavidin eFluor 450に使用コンジュゲート | eBioscience | 48-4317-82 | LSK選別に使用 |
| XFキャリブラント | Agilent Technologies | 100840-000 | カートリッジ平衡化に使用 |
| XF培地 | Agilent Technologies | 103575-100 | アッセイ培地 |
| XFp解糖ストレステストキット | Agilent Technologies | 103017100 | 解糖ストレス試験用薬剤 |
| XFpミトコンドリアストレステストキット | アジレント・テクノロジー | 103010100 | ミトコンドリア負荷試験用薬剤 |
| XFp センサーカートリッジ | アジレント・テクノロジー | 103022-100 | 解糖系およびミトコンドリア負荷試験に使用 |
参考文献
- Dharampuriya, P. R., et al. Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).
- Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. The hematopoietic stem cell diet. Internationa....
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再版と許可
