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方法論記事

造血幹細胞細胞代謝の解析

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DOI:

10.3791/60234

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2019年11月9日

 ,  ,  ,  , 
1Nationwide Children's Hospital, 2The Ohio State University College of Medicine, 3The Ohio State University Comprehensive Cancer Center

この記事について

サマリー

造血幹細胞(HSPC)は、血液形成中の代謝可塑性による静止状態から分化状態に移行します。ここでは、HSPCのミトコンドリア呼吸と糖状化を測定するための最適化された方法を提示する。

要約

造血幹細胞(HSPC)は、異なる代謝可塑性を有し、血液形成の要求を維持するために静止状態から分化状態に移行することを可能にする。しかし、HSPCの代謝状態(ミトコンドリア呼吸と糖直症)の分析は、非付着性の脆弱なHSPCに対する最適化されたプロトコルの数が限られており、分析することは困難でした。ここでは、代謝呼吸(酸素消費量率)を測定するための明確な、ステップバイステップの指示のセットを提供します。OCR)および糖上昇(細胞外酸性化率;ECAR)のマウス骨髄系統性スカ1+cキット+(LSK)HSPC。このプロトコルは、マウス骨髄からより多くのLSK HSPCを提供し、インキュベーション中のHSPCの生存率を向上させ、非付着性HSPCの細胞外フラックス分析を促進し、酸化リン酸化および糖分解経路を標的とする薬物に最適化された注入プロトコル(濃度および時間)を提供します。この方法は、血液の発達および疾患の間にHSPCの代謝状態および健康の予測を可能にする。

概要

ほとんどの成熟した血液細胞の寿命は短いので、血液の恒常性は、造血幹細胞(HSPC)1の長寿命であるが稀な集団の自己再生と分化に依存する。HSPCは静止しているが、血液系の要求を維持するために刺激時に増殖し、分化を受けるのが速い。各HSPC細胞状態は、ユニークな生物エネルギー需要を必要とするので、代謝の変化は、HSPC運命の決定の主要な要因です。したがって、代謝可塑性の喪失は、静止、自己再生、およびHSPCの分化との間の平衡を変化させることによって、しばしば骨髄またはリンパ増殖性障害を引き起ぐ。HSPC開発の代謝調節の理解は、血液悪性腫瘍2、3、4、5の基礎となるメカニズムを明らかにするために重要である。

ミトコンドリア呼吸と糖状化は、細胞内反応を駆動し、高分子合成に必要なビルディングブロックを生成するためにATPを生成します。HSPCは分化細胞6に比べてミトコンドリア質量が低く、低酸素骨髄ニッチで静止を持続するため、HSPCは主に糖質に依存しています。HSPCの活性化は、静止の損失とその後の細胞周期への入り口につながるミトコンドリア代謝を高めます.このようなHSPCの代謝可塑性は、成人生活6、7、8、9、10、11、12を通じてHSPCプールの維持を可能にする。したがって、酸素消費量(OCR、酸化リン酸化指数)や細胞外酸性化率(ECAR;糖系の指標)などの代謝活性を調べて、HSPC活性化と健康状態を分析することが重要です。OCRとECARの両方を、細胞外フラックスアナライザを使用して、リアルタイムで同時に測定できます。しかしながら、現在の方法は多数の細胞を必要とし、付着細胞13に最適化されている。HSPCはマウス14から大量に単離することができず、純粋な集団を得るためにソートを必要とし、非付着細胞15であり、かつ分化16を避けずに一晩培養することができないので、HSCのOCRおよびECARを測定することは困難であった。ここでは、数千のマウス骨髄-リネージュネグSca1+(LSK)HSPCの数千人のマウス骨髄-リネージネグの代謝呼吸と糖解症を測定する方法に関するビデオベースのチュートリアルに付随する明確な、ステップバイステップの手順のセットを提供します。

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プロトコル

このプロトコルは、全国小児病院動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認されました。

注:プロトコルは、2 日間にわたる時系列で記述されます。以下のプロトコルに記載されているように、新鮮な試薬を使用してください。

1. アッセイ前日の試薬の調製

  1. センサーカートリッジを水和します。
    1. 非CO2 37°Cのインキュベーターでキャリブラント(材料表)の5mLを一晩インキュベートする。
    2. フラックスアッセイキット(材料表)を開き、センサーカートリッジ(緑、上)をユーティリティプレート(透明、下)から分離します。次に、センサーカートリッジを上下逆さまにしてユーティリティプレートの横に置きます。
    3. 滅菌水を使用して、ユーティリティプレート(200°L)と井戸の周りのチャンバー(400°L)を充填します。
    4. センサーカートリッジをユーティリティプレートに下し、センサーが完全に水で覆われていることを確認します。気泡の形成を避けるために3xをタップします。
    5. 非CO2 37°Cのインキュベーターに水没したカートリッジを一晩入れます。水の蒸発を防ぐために、インキュベーターが適切に加湿されていることを確認してください。特に通常のオーブンを使用する場合は、カートリッジユーティリティプレートの横にH2Oを含むオープンビーカーを配置します。
  2. アッセイプレートを準備します。
    1. 70%エタノールを使用してバイオセーフティキャビネットクラス2の表面を殺菌します。ボンネットの下のアッセイプレートを開きます。
    2. 40 μL の市販の 0.01% (w/v) ポリ L-リジン (PLL) 溶液をボンネットの下のアッセイプレートの各ウェルに追加します。
    3. アッセイプレートをキットに用意した蓋で覆います。フードの下の室温(RT)で閉じたアッセイプレートを1時間インキュベートします。
      注:インキュベーションの目的は、アッセイプレートの表面に対して懸濁細胞の接着を容易にするために、PLLがアッセイプレートの表面を被覆できるようにすることです。
    4. アッセイプレートを1時間インキュベートした後、滅菌真空ベースの吸引器で余分な溶液を除去し、フードの下で井戸を空気乾燥させます。
      注:アスピレーターを使用した過剰なPLL除去に続いてアッセイプレートのウェルを空気乾燥するのに〜30−60分かかります。

2. アッセイの日

  1. カートリッジを準備します。
    1. センサーカートリッジを持ち上げます。組織培養フードに逆さまに置き、ユーティリティプレートから水を捨てます。
    2. ユーティリティプレートウェルに、事前に温めたキャリブラントの200°Lを充填します。
    3. キャリブラントの400°Lで井戸の周りのチャンバーを埋めます。
    4. センサーカートリッジをユーティリティプレートに下し、センサーがキャリブラントで完全に覆われていることを確認します。気泡の形成を避けるために3xをタップします。
    5. 非CO2 37°Cのインキュベーターで45−60分間水中に沈んだセンサーカートリッジを平衡化します。
  2. マウス骨髄由来LSPCを収穫する。
    1. 十分な生物学的複製に対応するために、アッセイプレートのウェルごとに1つのマウスに由来するHSPCを使用することを計画する。
      注:この骨髄収穫方法は、各マウスから約50,000−80,000 LSK HSPCを提供する。細胞外フラックスを測定するこのプロトコルは、96ウェルプレートのウェルあたり約70,000 LSK HSPC用に最適化されています。
    2. CO2過剰摂取および子宮頸部脱臼を用いてマウスを安楽死させ、局所IACUC承認方法に従う。
    3. 70%エタノールを使用して、解剖ツールとベンチの表面を殺菌します。
    4. 各マウスについて、RTで2%の熱不活化胎児ウシ血清(FBS)を含む1xリン酸緩衝生理食塩分(PBS)を1つのペトリ皿に事前に充填します。
      注:次の手順で不一括を作成するので、事前に冷却された PBS を使用しないでください。
    5. 安楽死マウス全体に70%エタノール(v/v)をスプレーします。上下の四肢、股関節骨、胸骨、肋骨ケージ、脊椎を含むすべての骨をマウス17、18から隔離する。LSK細胞を汚染する可能性があるので、マウスの脊髄から白い物質を引き出します。すべての骨を1x PBS(+2%FBS)に入れ、さらに使用するまでペトリ皿に入れます。
    6. 50 mL円錐形チューブ(毎回新しい)を反転し、ペトリ皿に1x PBS(+2%FBS)に沈んだ骨を三つ取りします。
    7. 10 mLの血清学的ピペットを使用して、ピペットを上下(〜10x)し、骨を粉砕した後、骨から細胞を均一に洗い流します。
    8. 50 mL円錐形チューブに40μmのセルストレーナーを置きます。1x PBS(+2%FBS)の1 mLを通過してストレーナーの表面を事前に濡らします。
    9. ステップ2.2.7から骨髄由来細胞懸濁液を収穫し、細胞ストレーナーの湿潤前表面を通過して骨残骸を除去する。
    10. すべての骨材料が50 mL円錐管に集められたマーカーとして白くなるまで、手順2.2.6~2.2.9を繰り返します。
      注:すべての骨髄由来細胞を収集するには、マウスごとに2つの50 mL円錐形チューブが必要になることが多い。
    11. 500 x gおよびRTで5分間骨髄由来細胞を含む50mL円錐形チューブを遠心分離する。
    12. 上清を取り除く。骨髄由来細胞(両方の50 mLチューブの内容物を結合)を1x PBS(+2%FBS)の5mLで最終体積として再サスペンドし、細胞をRTに保ちます。
  3. 単核化されたマウス骨髄細胞を収穫する。
    1. 密度勾配媒体(フィコル)を15mL円錐管に5mL加えます。その後、骨髄細胞懸濁液を5mLゆっくりと加える。セルが密度グラデーション メディアの上のレイヤーとして残っていることを確認します。
    2. 500 x gと RT で 30 分間遠心分離します。遠心分離機にブレーキを使用しないでください。遠心分離機が可能な限り低い加速度(例えば、1つの加速度および0減速)であることを確認します。
    3. 単核細胞(白色)の中間界面を、遠心分離後の新鮮な15mL円錐管に収穫する。
    4. 洗浄細胞を、密度勾配培地から採取し、5mLの1x PBS(+2%FBS)で行う。500 x gおよび 4 °C で 5 分間の遠心分離機。上清を取り除く。
    5. ステップ 2.3.4 を繰り返します。
    6. チューブの細胞内容を1x PBS(+2%FBS)の300°Lで再サスペンドします。FACSチューブ内の未染色または単色制御のための細胞懸濁液のアリコート10°L。
  4. 単核性マウス骨髄細胞からLSK HSPCを収穫する。
    1. 以下の抗体のサンプルあたり3μLを混合してビオチン抗体のカクテルを作る:Gr1、Cd8a、Cd5、B220、Ter119。ビオチン抗体カクテルの15°Lを300μLの単核骨髄細胞に加えます。
      注:各抗体は1:100希釈で使用されます。
    2. ビオチン抗体カクテルで細胞を攪拌で4分間30分間インキュベートし、チューブの底部に細胞が凝集するのを防ぐ。
    3. ビオチン抗体カクテルと混合した細胞に10mLの予冷1x PBS(+2%FBS)を加えます。
    4. 500 x gと 4 °C で 5 分間チューブを遠心分離します。上清を廃棄し、細胞ペレットを1x PBS(+2%FBS)の400°Lで再サスペンドします。ストレプトアビジン単一カラーコントロール用アリコート10°L。
    5. 使用前に簡単にボルテックス抗ビオチンマイクロビーズ(材料表)。各細胞サンプルに80μLのマイクロビーズを加えます(400μL)。よく混ぜ、攪拌で4°Cでさらに20分間インキュベートします。
    6. セルに 10 mL のあらかじめ冷やした 1x PBS (+ 2% FBS) を追加します。500 x gと 4 °C で 5 分間チューブを遠心分離します。
    7. 上清を廃棄し、1x PBS(+ 2%FBS)の1 mLで細胞ペレットを再サスペンドします。磁気分離ユニットのセットアップ中は4°Cで保管してください。
    8. 磁気アシストセル選別(MACS)セパレータの磁場にカラム(材料表)を4°Cに置きます。重力流の下で3mLの1x PBS(+2%FBS)ですすいで磁気分離用のカラムを準備します。
    9. ステップ2.4.7のセル懸濁液を4°Cのプリウェットカラムに追加します。細胞が4°Cでカラムを通過し、15 mL円錐管内の排水を収集できるようにします。
      注:このような排水中の標識されていない細胞を有する画分は、濃縮系統陰性細胞を表す。
    10. 4 °Cで3 mLの1x PBS(+ 2%FBS)でカラムを洗浄します。3x を繰り返します。フロースルーを収集し、4°Cに保ちます。血球計を用いたトリパンブルーの除外により、溶出した生存細胞を数える。
    11. 500 x gおよび 4 °C で 5 分間のフロースルーを含む 15 mL 円錐形チューブを遠心分離します。上清を捨てる。1x PBS(+ 2% FBS)の0.5 mLで細胞を再サスペンドし、内容物をFACSチューブに移します。
    12. LSK抗体カクテルの24°Lを各107細胞に加えます。抗体カクテルには、450-ストレプトアビジン抗体、PE-CY7-Sca1抗体、およびAPC-c-Kit抗体の等濃度が含まれています。
    13. 暗い下で攪拌(スズ箔で覆われた)で4°Cで1時間インキュベートします。
    14. FACS チューブに 1x PBS (+ 2% FBS) の 3 mL を追加します。500 x gおよび 4 °C で 5 分間の遠心分離機。上清を捨てる。
    15. 抗体標識細胞を1x PBSの1mL(+2%FBS)で再サスペンドする。選別直前に1mg/mLのヨウ化プロピジウムを細胞懸濁液に1μL加えます。
    16. LSKセルを選別する直前に、40μmのストレーナーを使用してFACSチューブの内容物をフィルタリングします。
    17. LsK細胞を収集し、FACSの選別を介して、2 mMグルタミン、3 mg/mLグルコース、1 mMピルビン酸、1xトロンボポエチン(TPO)、1x幹細胞因子(SCF)、0.5xペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)、pHを補った完全な媒体の0.5 mLを含む1.5 mLチューブに入ります。

3. LSK HSPCのミトコンドリア呼吸と糖状アセイション

  1. アッセイプレート内のLSKシード
    1. ステップ2.4.17からLSK細胞を500 x gで5分間遠心分離し、上清を廃棄する。
    2. 完全な媒体の細胞を少なくとも70,000細胞/40°Lの最終濃度に再中断する。
    3. ステップ1.2.4からPLLコーティングされた8ウェルプレートに40μL媒体(70,000細胞を含む)の種子内容物。すべてのコーナー井戸を空のままにします。
    4. 450 x gおよび RT で 1 分間の遠心分離。ブレーキをかけないでください。反転顕微鏡を使用して、細胞が井戸底に取り付けられていることを確認します。
    5. 175°Lの最終体積の各ウェルのセルに135 μLの完全なメディアを追加します。
    6. 非CO2インキュベーター内の細胞を37°Cで2時間インキュベートする。
    7. 表2(ミトコンドリアストレステスト)および表3(糖分症ストレステスト)に記載のメトリックを用いて、分析装置のウェルプレートの各ウェルに薬剤を添加するプログラムを設定する。
      メモ:細胞がインキュベートしている間、楽器の電源を入れ、37°Cであることを確認してください。
  2. ミトコンドリアストレステスト
    1. オリゴマイシンの45μMストック溶液、50μMカルボニルシアン化物4-(トリフルロメトキシ)フェニルヒドラゾン(FCCP)およびロテノン/アンチマイシンAの25μMストック溶液を調製します。45μMオリゴマイシン原液を調製するために、市販のパウチの内容物を完全な媒体の280μLに溶解する。50μM FCCP原液を調製するには、市販のパウチの内容物を完全な媒体の288μLに溶解する。25μMロテノネ/アンチマイシンA原液を調製するために、市販のパウチの内容物を完全な媒体の216μLに溶解する。
    2. ユーティリティプレートのセンサーカートリッジをインキュベーターから取り出し、各ウェルが必要に応じて2μMオリゴマイシン、1.5μM FCCP、および0.5 μMのロテニン/アンチマイシンAの最終濃度を持つよう、そのポート(A、B、C)をロードします。
    3. ユーティリティプレートに組み立てられたセンサーカートリッジから蓋を取り外し、計器トレイに置きます。20分かかるキャリブレーションを開始します。
    4. キャリブレーション後、ユーティリティプレートを取り外し、LSK細胞を含むアッセイプレートに置き換え、井戸の底部に付着させます。
    5. 表2に示すプログラムを開始するには、[続行]をクリックします。プログラムが完了したら、Wave Desktop ソフトウェアを使用してデータを取得し、分析します。
      注:細胞外フラックスアッセイから生成されたデータは、Wave Desktopソフトウェアのドットプロットを使用してプロットするか、Webベースの統計プログラムにエクスポートすることができます。
  3. 糖質ストレステスト
    1. 300μL(100mM)でグルコースを再構成し、オリゴマイシンを288μL(50μM)、2次元グルコース(2-DG)を300μL(500mM)で市販のパウチから完全な媒体に再構成する。
    2. 軽く上下(〜10倍)にピペットを設置し、化合物を可溶化する。2-DGを約1分間ボルテックスし、メディアへの適切な溶解を保証します。
    3. センサーカートリッジをインキュベーターから取り外します。負荷ポートA~Cは、表5に記載の希釈基準に続いて、10mMグルコース、2μMオリゴマイシン、および50mM 2-DGの最終濃度を得た。
    4. 手順 3.2.3 と 3.2.4 を繰り返します。
    5. [続行] をクリックして、表 3に示すプログラムを起動します。プログラムが完了したら、Wave Desktop ソフトウェアを使用してデータを取得し、分析します。

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結果

私たちの抽出方法は、マウスあたり約80,000 LSK HSPCを収穫することができました。LSK細胞の生存率と数は、(1)上肢と下肢、股関節骨、胸骨、肋骨ケージ、脊椎の骨髄を組み合わせたもので、(2)細胞死と凝集を増加させる赤い細胞リシス緩衝液の使用を避けたため、我々の方法で改善された(3)単一有核細胞の密度勾配培地分離を用い、(4)塊の細胞の損失を引き起こすであろう事前冷却緩衝液を使用することを避けた。

細胞外フラックス分析は従来、接着細胞に用いられてきたが、ウェルのPLLコーティングを用い、続いて細胞の遠心分離を行い、LSK HSPCを井戸の表面に付着させることが容易になった。これにより、LSK HSPCの細胞外フラックスを測定することができ、したがってLSK HSPCの代謝の健全性を測定することができました。

細胞は、グリコライシスとミトコンドリア呼吸を使用してエネルギー要件を補充し、増殖および増殖に必要な中間体を生成する。...

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ディスカッション

ここでは、純粋で生存可能なマウスLSK HSPC集団の最大量の単離と、細胞外フラックス分析装置による糖質およびミトコンドリア呼吸の測定を示す。具体的には、このプロトコルは、LSK HSPCの使用に関する以下の技術的課題を克服する: i) マウス骨髄におけるLSK HSPCの低周波14, ii) LSK HSPCの低基底代謝活性26, iii) LSK HSPCの脆弱さ27,およびiv) LSK HSPCの培養容器15への非付着性.さらに、細胞外フラックスアッセイの最適な性能を得るために、薬物濃度と媒体組成を最適化しました。

骨髄由来のHSPCは、低酸素ニッチに存在し、それらは、彼らの茎の維持のために重要である糖分解表現型を表示する28。逆に、HSPC分化6には呼吸が不可欠である。HSPCの代謝機能障...

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開示事項

著者たちは何も開示する必要はない。

謝辞

この作品は、国立衛生研究所(HL131645、CA016058)、セントボールドリック財団、ペロトニア財団からの資金援助の一部で支えています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.01% (w/v) ポリ-L-リジン溶液SigmaP8920LSK アタッチメント
40 & マイクロに使用;mの細胞のこし器フィッシャー科学22-363-547骨をつぶす反
ビオチンMicroBeadsMiltenyi130-090-485Lin-分離
のBiotinラットの反マウスCD45R/B220クローンRA3-6B2BDのBiosciences553086Lin-の分離
のために使用される Biotin ラット 反マウスCD5クローン53-7.3BDのBiosciencesの553019Lin-のために使用される分離
ビオチンラット抗マウスCD8aクローン53-6.7BDバイオサイエンス553029リン分離
バイオチンラット抗マウスLy-6GおよびLy-6CクローンRB6-8C5BDバイオサイエンス553125リン分離
バイオチンラット抗マウスTER-119/赤血球細胞クローンTER-119BDバイオサイエンス553672リン分離
CD117(c-Kit)モノクローナル抗体(2B8)、APCeBioscience17-1171-83LSK選別に使用
ファルコン 15 mL コニカル遠心チューブファルコンフィッシャーサイエンティフィック14-959-53A細胞単離に使用
ファルコン 50 mL コニカル遠心チューブファルコンフィッシャーサイエンティフィ14-432-22細胞単離に使用
ファルコン丸底ポリプロピレンチューブファルコンフィッシャーサイエンティフィック14-959-11Aに使用LSK選別
ウシ胎児血清ニューロミクスFBS001-HIFACSバッファーに使用
Histopaque-1083シグマ10831フィコール勾配分離に使用
L-グルタミン100xフィッシャーサイエンティフィック25-030-081アッセイ培地に使用
LSカラムMiltenyi130-042-401リン分離に使用
Ly-6A/E (Sca-1) モノクローナル抗体 (D7)、PE-Cyanine7eBioscience25-5981-82LSK選別に使用
マウス幹細胞因子(SCF)PeproTech250-03-100UGアッセイ培地に使用
マウストロンボポエチン(TPO)PeproTech315-14-100UGアッセイ培地
PBS 1%Fisher ScientificSH3002802FACS緩衝液に使用
ペニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U/mL)Fisher Scientific15140122アッセイ培地に使用
ヨウ化プロピジウムフィッシャーサイエンティフィックP1304MPLSK選別に使用
タツノオトシゴXFp細胞培養ミニプレートAgilent Technologies103025-100LSK播種に使用
ピルビン酸ナトリウム(100 mM)モフィッシャー11360070アッセイ培地
Streptavidin eFluor 450に使用コンジュゲートeBioscience48-4317-82LSK選別に使用
XFキャリブラントAgilent Technologies100840-000カートリッジ平衡化に使用
XF培地Agilent Technologies103575-100アッセイ培地
XFp解糖ストレステストキットAgilent Technologies103017100解糖ストレス試験用薬剤
XFpミトコンドリアストレステストキットアジレント・テクノロジー103010100ミトコンドリア負荷試験用薬剤
XFp センサーカートリッジアジレント・テクノロジー103022-100解糖系およびミトコンドリア負荷試験に使用
的なの後の細胞ろ過のために使用される のに使用されるに使用されるック サーに使用 ズ ズ

参考文献

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