方法論記事

共通マーモセットにおけるマイクロ電極アレイの移植のための立体外科手術(カリスリックス・ジャカス)

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DOI：

10.3791/60240

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2019年9月29日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Edmond and Lily Safra International Institute of Neuroscience, Santos Dumont Institute, 2Neuroscience Program, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 3Department of Physiological Sciences, Health Sciences Center, Federal University of Espírito Santo

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

この研究は、一般的なマーモセットにおけるマイクロ電極アレイの立体的、神経外科的移植を行うプロトコルを提示する。この方法は、特に自由に振る舞う動物における電気生理学的記録を可能にするが、この種における他の同様の神経外科的介入(例えば、薬物投与のためのカニューレまたは脳刺激のための電極)に容易に適応することができる。

要約

マーモセット(カリスリックス・ジャカス)は、神経科学を含む生物医学および前臨床研究で人気を集めている小さな非ヒト霊長類です。系統的には、これらの動物はげっ歯類よりも人間にはるかに近い。彼らはまた、発声や社会的相互作用の広い範囲を含む複雑な行動を表示します。ここで、一般的なマーモセットに記録電極アレイを移植するための効果的な立体神経外科的処置が記載されている。このプロトコルはまた、このような手術を正常に行うために必要とされる動物ケアの術前および術後のステップについても詳述する。最後に、このプロトコルは、外科的処置の1週間後に自由に振る舞うマーモセットにおける局所場電位およびスパイク活性記録の例を示す。全体的に、この方法は、目覚め、自由にマーモセットを振る舞う脳機能を研究する機会を提供します。同じプロトコルは、他の小さな霊長類と協力する研究者によって容易に使用することができる。さらに、電極の刺激、マイクロインジェクション、オプトローデまたはガイドカニューレの移植、または離散組織領域のアブレーションなど、インプラントを必要とする他の研究を可能にするために簡単に変更することができます。

概要

一般的なマーモセット(カリスリックス・ジャカス)は、神経科学を含む多くの研究分野で重要なモデル生物として認知されています。これらの新世界の霊長類は、げっ歯類と他の非ヒト霊長類(HPS)(ケガサス・マカクなど)の両方に対する重要な補完動物モデルを表す。げっ歯類と同様に、これらの動物は小さく、操作が容易で、より大きなHGPと比較して、1、2、3、4を世話し、繁殖するために比較的経済的です。さらに、これらの動物は、他のPP1、2、3に対して双子と高いフェクティティの傾向を持っています。マーモセットが他の多くの霊長類よりも優れたもう一つの利点は、現代の分子生物学ツール3、4、5、6、7および配列ゲノム2,3,4,5,8は、それらを遺伝的に改変するために使用されている。レンチウイルス5を用いたノックイン動物と、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZFN)および転写活性化剤様エフェクターヌクレアーゼ(TALENS)7を用いたノックアウト動物は、いずれも生存可能な創始動物を生み出した。

げっ歯類に関する利点は、マーモセットは霊長類として、系統的にヒトに近い3、5、6、9、10、11である。人間と同様に、マーモセットは、彼らの行動の多くを導くために高度に発達した視覚システムに依存する日生動物です 10.さらに、マーモセットは、異なる発声3の使用などの広範な社会的行動を含む行動の複雑さを示し、研究者が他の種では不可能な質問に対処することを可能にする。神経科学的な観点から見ると、マーモセットは、より一般的に使用されるカゲスマカク9とは異なり、脳にリッサンスを持っています。さらに、マーモセットは、より高度に発達した前頭前皮質9を含む、ヒトに類似した中枢神経系を有する。これらすべての特性は、健康と病気における脳機能を研究するための貴重なモデルとしてマーモセットを位置づけます。

脳機能を研究するための一般的な方法は、立体神経外科を用いて解剖学的に特定の場所に電極を移植することを含む。これにより、目を覚まし、自由に行動する動物12、13の異なる標的領域における神経活動の慢性的な記録を可能にする。ステレオタキシック神経外科は、神経解剖学的領域の正確な標的化を可能にする研究の多くの行で使用される不可欠な技術です。マカク文献やげっ歯類の文献と比較して、マーモセットに特有の立体神経外科を記述する公開された研究は少なく、手術に関与するステップの詳細をまばらに提供する傾向があります。さらに、より詳細なものは、主に頭部拘束動物14、15、16、17における電気生理学記録の手順に焦点を当てている。

神経科学研究におけるモデル生物としてのマーモセットのより広い採用を容易にするために、本方法は、この種における立体神経外科手術の成功に必要な具体的なステップを定義する。記録アレイの移植に加えて、本方法で詳述したように、同じ技術は、疾患18の治療のための刺激電極の移植を含む他の多くの実験目的のために適応することができる18または因果的運転回路動作19;神経伝達物質20の抽出および定量のためのガイドカニューレの移植、試薬の注射、疾患モデル12または回路トレース研究15を誘発するためのものを含む;離散組織領域のアブレーション21;光遺伝学的研究のためのオプトローデの移植22;皮質顕微鏡分析のための光学窓の注入23;電気コルチコグラフィー(ECoG)アレイ24の移植.したがって、この手順の全体的な目標は、自由に振る舞うマーモセットにおける慢性電気生理学的記録のためのマイクロ電極アレイの移植に関与する外科的ステップを概説することです。

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プロトコル

動物実験は、実験動物のケアと使用のための国立衛生研究所ガイドに従って行われ、サントス・デュモン研究所倫理委員会(プロトコル02/2015AAS)によって承認されました。

1. 手術の準備

  1. 使用するステレオタックスフレームと互換性のある電極ホルダーに各電極アレイを取り付けます。
  2. 1つの電極ホルダーをステレオタックスマイクロマニピュレータに接続し、1つのマイクロワイヤをインターオーラル座標に設定します。必要に応じて、追加の電極アレイとホルダーに対してこの手順を繰り返します。
    注: マイクロワイヤ間の相対距離は一定であるため、任意のマイクロワイヤの間座標を使用して、アレイ全体の埋め込み座標を計算できます。アレイに異なる長さのバンドルがある場合、最も長いワイヤの間座標は、インターオーラルゼロを設定するために最も便利です。
  3. ステレオタックスマイクロマニピュレータから電極ホルダーを取り外し、紫外線(UV)キャビネットでアセンブリ(電極ホルダーに取り付けられた電極)を少なくとも2時間殺菌します。
  4. 24Gの針を立体プローブホルダーに取り付け、マイクロマニピュレータに接続し、針の先端の間座標を設定します。
    注:手術前に、すべての頭蓋の座標は、アレイの標的移植部位の前置詞(AP)および平面面(ML)位置よりも大きい周長200 μm 2として事前に定義する必要があります。24 G 針プローブ ホルダー アセンブリを使用して、ゼロインターオーラル座標に基づいて頭蓋骨の頭蓋骨の位置を決定します。
  5. マイクロマニピュレータからプローブホルダーを取り外し、UVキャビネット内のアセンブリを少なくとも2時間殺菌します。
  6. 6−8チタンまたはステンレススチールネジを集えます。アース線を半分にはんだ付けする
  7. 手術に必要な残りの器具、機器、使い捨てをすべて整理し、殺菌します。

2. 術前の手順

注:本研究では、320〜370gの重さの2つの成人男性マーモセット(カリトリックスジャグス)を用いた。麻酔を誘発する前に、動物が6時間食べていないことを確認してください。

  1. アトロピン(0.05mg/kg)の筋肉内注射で動物を麻酔し、唾液分泌および気管支分泌を減らす。ペダル応答の欠如を確認します。
  2. 5分後にケタミン(10−20mg/kg)を筋肉内に塗布する。
  3. 電気床屋のバリカンを使用して動物の頭を剃ります。
  4. トラマドール (2 mg/kg) を一般的な鎮痛剤として筋肉内で投与する。
  5. 動物を挿管する。
    1. マスクを使用して、深い麻酔を誘発するために1-5 L/minの流量で1-2%酸素でイソファランにマーモセットを露出させる。動物が深く麻酔されるとき、1−3 L/minにイソファランを減らし、維持する。
    2. テープで外科テーブルに弾性バンドを取り付けます。
    3. マーモセットを技術者に向かって頭部を持つスピット位置に置き、マーモセットの口の中に弾性バンドをイヌの後ろに置きます。
      注:後部表面が床に向き、その顔が技術者に向かうように頭を配置することをおそれが最善です。
    4. 綿の先端のプローブを使用して、綿棒はマーモセットの舌を乾燥させ、口を開いたままにするために片手でそれをつかみます。
    5. 気管内管の先端に10%リドカインをスプレーします。
    6. 4.0 cmのマークが気管の入り口になるまで、カフのない2.0 mmの直径の気管チューブを気管に挿入します。
    7. 人工人工呼吸器を40呼吸/分に設定して麻酔アセンブリにチューブを取り付け、胸部の適切な膨張と収縮を確認します。
      注:このとき、イソファランと酸素はマスクではなく気管内チューブを介して送達されるべきです。
    8. 気管内チューブを顎にテープで留めることができるように、マーモセットの口から弾性バンドを取り外します。
  6. マーモセットをステレオタキスティックフレームに沿った位置に置き、動物の頭部をステレオタキスティックフレームに固定します。
    1. まず、右耳バーの先端を動物の右耳管に挿入します。
    2. 次に、左耳バーの先端を左耳管に挿入します。
    3. 動物の頭部をステレオタキスティックフレームの中央に中央に配置し、イヤーバーを所定の位置に固定します。
    4. マウスピースを動物の口に挿入し、動物の口蓋に触れるように高さを調整します。同時に、軌道バーを軌道ボーンの下面に配置します。
    5. 軌道ボーンの下面がイヤー バーの中心に水平に揃っていることを確認します。
  7. ポータブルパルスオキシメータをマーモセットの手に接続します。手術中の心拍数が154−180ビート/分(bpm)以内であることを確認します。多くの場合、200 bpmを超える心拍数は、動物が目を覚ましている意味します。酸素飽和度が 95% を超えていることを確認します。それは時折害なしで90%に落ちるかもしれません。
    注:心拍数が154 bpmを下回った場合は、イソファランを減少させる。
  8. 家庭温加熱パッドに接続された直腸温度プローブを、所望の温度を37°Cに設定して、麻酔に配置します。このセンサーを尾部にテープで固定して所定の位置に固定します。
  9. 目に滅菌眼用潤滑剤を塗布する。
  10. 外科場で動物を覆う前に、クロルヘキシジンとポビドネヨウ素で動物の頭部をきれいにし、消毒します。
    注:無菌状態下で以下のすべての外科的処置を行う。

3. 手術手順

  1. 局所鎮痛薬を皮下に塗布する(例えば、リドカイン20mg/mL、0.1mL)を目的の切開部位に塗布する。頭皮の中線に切開を行います。
  2. 頭蓋骨の表面を露出して準備します。
    1. 頭蓋から側頭筋を慎重に取り外します。まず、頭蓋骨への挿入時にメスを使用して筋膜を切断します。次に、心膜を使って頭蓋から経頭筋をそっと分離する。
    2. 骨膜のラスパトリーを使用して、すべての露出した頭蓋骨から骨膜を取り除く。
    3. 必要に応じて、無菌綿棒で出血を制御します。
    4. 過酸化水素で骨表面をきれいにします。
  3. 骨表面に浅いバリ穴でコーナーをマークすることにより、開頭術の位置を示します。次に、歯科ドリルを使用して開頭術の周囲を最高速度(すなわち350,000rpm)でドリルアウトします。過熱を防ぐために掘削中に頭蓋骨の上に無菌生理生理を数滴追加します。開頭術の位置と、間耳座標に対する電極インプラントの座標を測定します。
  4. 頭蓋骨にネジを入れて
    1. 6−8ネジ穴を頭蓋骨にドリルします。
    2. 各アース線融合ねじが、未変性ネジの近くに隣接するようにネジを埋め込みます(すなわち、アース線が取り付けられていない場合)。
    3. 隣接する未変更のネジの周りに各アース線を巻きます。
    4. アース線と各ネジの間に銀色の塗料を1滴加えます。
  5. 曲がった先端(例えば、マクファーソン鉗子)で鉗子を使用して頭蓋の中心にある骨を取り除く。無菌生理生理で水和したデュラ母母を保ちます。
  6. デュラの母を取り除く。約90°で曲げたベベルを持つ滅菌皮下注射針(25または26G)を使用して穿刺し、脳表面から離れてデュラ母体の表面を持ち上げます。その後、マイクロシサーでデュラマターをカットします。露出した脳を生理食生で水分補給してください。
    注:著しい硬膜出血が観察される場合は、血栓25に浸漬した焼灼または滅菌性ゼラチンスポンジを使用する。
  7. インプラントマイクロ電極アレイ。
    1. 殺菌された電極ホルダーと電極アレイをステレオタックスマイクロマニピュレータに取り付けます。
    2. マイクロマニピュレータを配置して、電極が所望の前質後部および平面座標に配置します。
    3. 最も長い束の先端が脳の表面に触れるまで電極配列を下げる。
    4. ゆっくりと脳組織に配列を挿入し、背筋の座標に達します。
    5. 露出した皮質を無菌の吸収性ゼラチンスポンジで覆います。
    6. 露出した頭蓋骨、1本のネジ、電極に歯科用アクリルを塗布して、頭蓋骨に電極を固定します。
    7. 電極ホルダーを取り外し、マイクロマニピュレータから取り外します。
  8. 必要に応じて、ステップ 3.7 から追加の配列を使用して、移植手順を繰り返します。
  9. 一緒に風と別々のアレイとネジのアース線を溶接します。銀の塗料を使用して溶接の周りにブリッジを形成し、電気的な接続が達成されていることを確認します。
  10. 歯科用アクリルを使用して、アレイの横の範囲の周りに頑丈なヘッドキャップを作り、アース線と露出した頭蓋骨とネジを完全に包みます。
  11. 必要に応じて、サポート バーをヘッドキャップに挿入します。これは綿棒のような丈夫なプラスチックシリンダーでありうまいである。歯のアクリルで所定の位置にそれを密封します。
    注: これは、電気生理学ケーブルコネクタを所定の位置に固定するのに役立ちますが、使用する機器によっては不要な場合があります。本方法では、同様の支持ロッドがヘッドステージに貼付されており、弾性バンドがコネクタ上にヘッドステージをしっかりと保持することができる。
  12. ヘッドキャップの周りに皮膚を縫合します。

4. 術後の回復

  1. 創傷の周りに消毒液(例えば、クロルヘキシジン)を塗布する。
  2. イソフランの供給をオフにするが、酸素をオフにし、立体フレームから動物を取り除きます。
  3. 気管内チューブを通して維持酸素と加熱パッドに動物を置きます。
  4. 喉頭痙攣などの神経原性反射の最初の兆候が観察されるとき、気管内管を取り除きます。
  5. 動物が保護反射、姿勢のトーン、およびアンブレートを試みるような麻酔回復の明確な兆候を提示するまで、マスクで酸素を供給し続けます。
  6. 動物を自宅のケージに移動する前に、24~48時間の回復室にきれいなケージの中に動物を入れなさい。各移植動物を個別に収容する。
    注:マーモセットはケージの壁を登る傾向があるので、滑らかな壁を持つケージを使用するか、動物が落ちないように滑らかな表面でケージの壁を覆います。
  7. 手術後の最初の1時間で、動物を観察して、ケージの側面に対する苦痛または調整されていない頭部接触の兆候を観察する。
  8. 抗生物質(例えば、エンロフロキサシン5mg/kg、皮下、5−7日間1日1回)、鎮痛薬(例えば、経口トラマドール1mg/kg、3-5日間毎8h)および抗炎症薬(例えば、デキサメタゾン0.5−1.5mg/kg、1日1日)を投与する。.
    注:手術が成功した後、動物は3−5日以内に完全に回復します。

5. 自由に振る舞うマーモセットにおける慢性電気生理学的記録

  1. 手術後少なくとも1週間後に電気生理学的記録セッションを開始する。
    注:少なくとも1ヶ月間すべての実験手順を開始する前に、研究者や実験環境に動物を習慣化します。
  2. 各セッションの開始時に、イソムラン(1−5L/min、1%O2)を用いて動物を軽く麻酔する。
    注:小さな霊長類の受け入れに関する関連機関のガイドラインに従ってください。記録セッションが非常に頻繁である場合は、麻酔なしでケーブルを接続できるように、取り扱う動物を習慣化します。
  3. 電極アレイを市販のニューラル記録システムに接続します。
  4. 実験室内に動物を配置します。
    注:ここで使用される実験室は、自発的運動活動26、27の量およびパターンを評価するように設計された立方体アクリル箱(0.45 m x 0.45 m x 0.45 m)である。
  5. 動物が麻酔から完全に回復していることを確認するために、記録を開始する前に30分待ちます。
    注:イソファランは、急速な沈降と覚醒28を可能にする急速な発症とオフセットアクションを有する。イソファランの供給がオフになると、動物は目を覚ますのを開始します。動物は直立した位置にとどまるとき目を覚まし、落下することなく実験室で自由にambuaminすることができます。所要時間は15分未満です。鎮静効果がないことを確実にするために、イソファルランが中止された後30分後に録音を開始する。
  6. 組織29を固定および断面した後のNISSL染色による死後のマイクロ電極アレイインプラントの位置を確認する。

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結果

本研究の目的は、一般的なマーモセットにおける電気生理学的記録のためのマイクロ電極アレイの移植のための立体神経外科的処置を記述することにあった。典型的な手術(麻酔誘導から麻酔回復まで)は、移植された配列の数に応じて、約5-7時間続きます。ここで、2つの配列を対称的に埋め込み、各脳半球に1つずつ移植した。各アレイには、基底神経節-コルチコカラミック回路のいくつかの構造を標的とする7つのバンドルに配置された32本のステンレス鋼マイクロワイヤーが含まれていました(図1)が、電極の設計と標的脳領域は、実験。手術と術後の処置が成功した後、動物は3−5日以内に完全に回復する必要があります。アレイが接地され、適切に埋め込まれた場合、成熟した神経膠チック瘢痕が確立される前に、数週間または数ヶ月にわたって自由に振る舞う動物のスパイク(図2A)と局所視野電位(図2B)を記録することが可能になります。13、

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ディスカッション

この研究はマーモセット脳のマイクロ電極記録配列の注入に関わる手順の詳細な説明を提供する。この同じプロトコルは、他の小さな霊長類で、自家製か市販かにかかわらず、電極を埋め込む際に容易に使用することができる。さらに、それは容易に脳構造の精密なターゲティングを要求する他の実験端のために合わせることができる。したがって、このプロトコルは、ステレオタックス座標と頭蓋掘削技術に関して意図的にあいまいです。例えば、この手術で使用される配列を移植するために、頭蓋は、各半球で2つの適切なサイズの窓を開くために行われた。しかし、頑丈な移植の場合、ガイドカニューレなどの個々の構造は、これもデュレクトミーも必要ではない。むしろ、デュラのレベルに簡単なバリ穴で十分です。同様に、非電気的なインプラントが関与する場合、ネジを接地する必要はありません。従って、外科プロトコルにおけるステップ3.9は省略することができる。代わりに、歯科アクリルは、単に露出頭蓋骨、インプラント、およびネジをカバーするために使用することができます。

立体神経外科の特定の実験目標にかかわらず、与えられた処置の成功した実施は、主に良好な外科...

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開示事項

著者は何も開示していない。

謝辞

著者は、撮影と編集の技術的な支援のためにベルナルド・ルイスに感謝したいと思います。この研究は、サントス・デュモン研究所(ISD)、ブラジル教育省(MEC)、コデナサオ・デ・アペルフェイソアメント・デ・ペソアル・デ・ニヴェル・スーペリア(CAPES)によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Equipments
683 小動物用人工呼吸器Harvard Apparatus, Inc.55-0000
アセンブリBRASMEDCOLIBRI
理髪クリッパーMundialHC-SERIES
歯科用ドリルNorgenB07-201-M1KG
ホメオサーミックヒーティングパッドとモニターハーバード装置株式会社50-7212
マーモセット脳定位固定装置フレーム成重科学機器研究所SR-6C-HT
生体情報モニタ・パルスオキシメータバイオネット株式会社BM3
脳定位固定装置マイクロマニピュレーター成重科学機器研究所SM-15R
手術顕微鏡オプトSM PLUS IBZ
Instruments
Allis組織鉗子Sklar36-2275
アルムリトラクター、丸みを帯びたポイント、4x4歯RhosseRH11078
Angled McPherson ForcepsOftalmologiabr11301A
湾曲した外科はさみハーバード装置株式会社72-8422
湾曲したティッシュ鉗子Sklar47-1186
解剖鉗子WPIWP5015
歯科用ドリルビットMicrodontISO.806.314.001.524.010
Essring組織鉗子Sklar19-2460
FG 1/4歯科用ドリルビットMicrodontISO.700.314.001.006.005
HalseyニードルホルダーWPI15926-G
Halstead蚊鉗子WPI503724-12
血鉗子、ストレートSklar17-1260
Jewler鉗子Sklar66-7436
McPherson-Vannas眼科用顕微鏡はさみ、3mmポイントArgos InstrumentalARGOS-4004
Pereostealラスパトリーゴルグラン38-1
スカルパルハンドルハーバード装置株式会社72-8354
ドライバーEurotoolSCR-830.00
Sodering IronHikari21K006
手術用ハサミHarvard Apparatus, Inc.72-8400
歯付き鉗子WPI501266-G
Disposables/Single Use
1 ml滅菌シリンジ、26 G針Descarpack7898283812785
130 cm x 140 cmの手術野、滅菌済みProtDesc7898467276344
24Gニードル、滅菌済みデスカーパック7898283812846
50cm×50cmの手術野、滅菌済みEsterili-med110100236
コットンチッププローブ、滅菌済み江蘇省Suyunメディカルマテリアルズ株式会社23007
コットンチップHigieトップ7898095296063
電極アレイ自家製
カフなし気管内チューブ、内径2.0mm、外径2.9mmSolidor7898913077201
錫メッキ銅線、直径
M1.4x3 ステンレス製ネジUSMICROSCREWM14-30M-SS-P
医療用テープMissner7896544910102
ナイロン外科用縫合糸シャロンN540CTI25
Scalpal Blade, presterilizedAdvantiVe1037
solderKesterSN63PB37
Sterile Saline 0.9%Isofarma7898361700041
Sterile Surgical GlovesMaxitex7898949349051
Sterile Surgical GownProtDesc7898467281208
Surgical Gauze, 15 cm x26 cm滅菌済みHéika7898488470315
Gelfoamファイザー
Drugs/Chemicals
0.25mg/ml アトロピンイソファルマ
10% リドカイン スプレーProdutos Químicos Farmacêuticos Ltda.
7896676405644 2.5% Enrofloxacinoの動物用抗生物質Chemitec0137-02
Dexametasonaの獣医の抗炎症MSDR06177091A-00-15
過酸化水素Farmaxの7896902211537
のIsoflouraneBioChimicoの7897406113068
ジェットのアクリルの重合の解決アルティゴス・オドントルógicos Clássico
ジェット自動重合アクリルArtigos Odontol ógicos Clássico
ケタミン 10%Syntec
リドカインおよびフェニレフリン 1.8 ml 局所麻酔薬SS ホワイト7892525041049
ポビドン - ヨウ素 solutiomFarmax7896902234093
Riohex 2% 外科用石鹸Rioquíマイカ7897780209418
シルバーペイントSPIサプライ05002-AB
トラマドール塩化物50mg / mlユニ&アチルド;o Quíマイカ7896006245452
リフレッシュジェル(ポリアクリル酸)アラガン
麻酔繊細な止ス0.15mmの

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