方法論記事

新規ビオチニル化酵素の選択のための細菌ペプチド表示

DOI：

10.3791/60266

⸱

2019年10月3日

 ,  , 
1Department of Molecular Medicine, University of Southern Denmark, 2Department of Nephrology, Odense University Hospital

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、特定の標的ペプチドをビオチン化する大腸菌ビオチンタンパク質リゲスBirAの新規変異体を選択する方法を提示する。プロトコルは、標的ペプチドの細菌表示のためのプラスミドの構築、BirAライブラリーの生成、BirA変異体の選択および特徴付けについて説明する。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ビオチンは、タンパク質の単離と検出のための強力なタグを提供するタンパク質の魅力的な翻訳後修飾です。大腸菌ビオチンタンパク質リゲスBirAによる酵素生物化は非常に特異的であり、そのネイティブ環境における標的タンパク質の生体化を可能にする。しかしながら、BirA媒介バイオチリン化の現在の使用法は、標的タンパク質中の合成アクセプターペプチド(AP)の存在を必要とする。したがって、その用途は、APを含むするように設計されたタンパク質に限定される。本プロトコルの目的は、未修飾標的タンパク質に由来するペプチドの細菌表示を用い、ペプチドを生体化するBirA変異体を選択することである。システムは細菌表面のペプチド表示のための足場と共にBirA変異体の共発現を可能にする単一のプラスミドに基づいている。このプロトコルは、ターゲットペプチドをディスプレイ足場に組み込む場合の詳細な手順、BirAライブラリの作成、アクティブなBirA変異体の選択、および単離されたBirA変異体の初期特性を説明する。この方法は、複雑な溶液中で天然タンパク質を生体化するビオチンタンパク質リチウムのさらなる方向進化に使用できる新規BirA変異体の単離に対して非常に効果的な選択システムを提供する。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

タンパク質のバイオチリン化は、その親和性の単離および検出のための強力なタグを作成します。酵素タンパク質バイオチニル化は、ビオチンタンパク質リチウムによって触媒された非常に特異的な翻訳後修飾である。大腸菌ビオチンタンパク質リゲスBirAは、非常に特異的であり、共有的に特定のリジン残剤1で天然に存在するタンパク質の制限された数のみを共有生物化する。BirA触媒バイオチニル化の利点は、現在、効果的にビオチン化された小さな合成15-アミノ酸ビオチンアクセプテイタペプチド(AP)と標的タンパク質を融合することによって利用され、非常に特異的であり、Via3,4,5の共発現または添加による生体内およびインビトロバイオチニル化の効率的な。インビボおよびインビトロBirA触媒ビオチンタンパク質ライゲーションは魅力的な標識戦略ですが、その用途はAP融合タンパク質を含むサンプルに限定されています。この方法の目的は、天然の未修飾タンパク質を選択的に生体化し、酵素生物化戦略を使用できるアプリケーションの数を拡大するビオチンタンパク質リチウムの新しい変異体の開発です。

タンパク質機能は、所望の機能を有する遺伝子変異、選択、増幅の反復ラウンドを通じて進化させることができる。強く、有効な選択戦略は、指向性進化のために重要であり、ビオチンタンパク質リガーゼ活性は、ビオチンとストレプトアビジンとそのホモログ6との間の強い結合のために容易に選択される。ファージディスプレイ技術は、バイオチニル化ペプチド7、8を表示するファージの選択を可能にします。しかし、単離されたファージの増幅は細菌宿主の感染を必要とするので、ストレプトアビジンを用いたファージ選択は、非変性下でのビオチンとストレプトアビジンの高親和性結合が事実上不可逆的であるという点でボトルネックを生み出す。条件。ビオチン化ファージの可逆結合を確実にするために、親和性の低いモノメリックアビジンが使用され、その結果、適度〜10倍の濃縮7が得られた。我々は最近、アフィニティマトリックスからの溶出の必要性を排除し、それによって以前のBirA選択システム9からボトルネックを取り除く新しいBirA変異体の単離のための細菌表示方法を開発した。実際、当社の細菌表示システムは、1回の選択ステップ9で活性クローンの>1,000,000倍の濃縮を可能にし、新規のBirA変異体の指向進化のための効果的な選択システムを提供します。

当社の細菌表示システムは、C末端6xHisタグを持つBirAと、標的ペプチドの表面表示を可能にする足場タンパク質の2つの成分で構成されています。ペプチドの有効表示はN-ターミニ10、11の両方で観察することができるので、我々は、円形に透過した外膜タンパク質X(eCPX)を増強足場タンパク質を用いた。標的ペプチド配列をeCPXのC-終位に融合させることで、活性BirA変異体を発現する細菌の生体化が保証される。細菌は、ビオチン化ペプチドが表面に表示されるようになったように効果的なストレプトアビジン選択を可能にする(図1a)。

この方法の目的は、天然タンパク質に存在するペプチド配列をビオチン化するBirAの新規変異体を選択することです。このシステムは、プラスミドpBAD-BirA-eCPX-AP上に存在する遺伝子によってコードされ、これは、アビノセ誘導性プロモーターを含むBirA(araBAD)、およびeCPX9を制御するT7プロモーター(図1b)を含む。本プロトコルは、1)標的タンパク質由来のペプチドをeCPXのC末端に組み込む場合の詳細な手順、2)エラーが起こりやすいPCRによるBirAの変異ライブラリーの作成、3)ストレプトアビジン結合細菌の選択について説明する。磁気活性化細胞選別(MACS)、4)細菌濃縮の定量化、および5)単離クローンの初期特性特性。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. pBAD BirA-eCPX-APにおけるペプチド符号化シーケンシング配列の挿入

注:天然標的タンパク質を生体化するBirA変異体を選択するには、少なくとも1つのリジン(K)残剤を含むタンパク質一次配列中の15-アミノ酸ペプチド配列を同定することから始める。

  1. シーケンス操作スイート12に移動します。
  2. FASTA形式で入力ボックスに特定された15アミノ酸ペプチドシーケンスを貼り付け、[送信]を押します。
  3. ペプチド配列の45ヌクレオチド逆翻訳を選択してコピーする。
  4. http://n2t.net/addgene:121907からpBAD-BirA-eCPX-AP用のGenBankファイルをダウンロードしてください。
  5. プラスミドエディタ(例えば、ApE)にファイルをロードし、機能ウィンドウで「AviTag(TM)」と指定されたAPシーケンスを選択します。
  6. DNA シーケンス ウィンドウで強調表示されたAP シーケンスを右クリックし、コンテキスト メニューで[Rev-Com の貼り付け]を選択します。
    注:eCPXのコード配列は逆方向であり、ペプチドコード配列は、したがって、逆補体として貼り付けるべきである。
  7. 強調表示されたシーケンスを右クリックし、[新機能]を選択します。
  8. 挿入されたシーケンスの説明的な名前を追加し、[OK]を押します。
  9. 変更したファイルを保存するには、[ファイル]メニューで [名前を付けて保存]を選択します。
  10. ペプチドコード配列の逆補体の最後の30ヌクレオチドを含むように前方プライマーを設計し、プラスミド結合ヌクレオチド配列(3'-GCGGCCGCCTGC-5')をその5'末端に加える。
  11. ペプチドコード配列の逆補体の最初の30ヌクレオチドを含むように逆プライマーを設計し、プラスミド結合ヌクレオチド配列(3'-CTTAAGTAGTTAATGATTCGAG-5')をその5'末端に加える。
  12. 表1に記載されている試薬を添加して、薄壁PCRチューブに20μL PCR反応を設定します。
  13. チューブをサーマルサイクラーに移し、初期回電を30°Cで98°C、30サイクル(98°Cで15s、60°Cで15s、72°Cで3分)のプログラムを使用してPCRを行い、72°Cで2分間の最終延長を行い、4°Cで保持します。
  14. 1%のアガロースゲル上でPCR反応の5μLを実行し、約6kbのPCR産物の増幅を確認します。
    注:PCR 製品が観察されない場合は、製造元の指示に従って PCR 状態を最適化します。プロトコルはここで一時停止できます。
  15. PCR反応にDpnIの1 μLを追加し、37 °Cで1時間インキュベート
  16. DpnI消化PCR反応とプレートをリソジェニックブロス(LB)/Ampプレート上の2μLで大腸菌を変換します。37 °Cで一晩インキュベートします。
  17. 単一のコロニーで100 μg/mLアンピシリンを含む5 mL LBを接種する。200 rpmで振りながら37°Cで一晩インキュベートします。
    注:少なくとも 6 つのコロニーをテストすることをお勧めします。
  18. グリセロールを培養に15%の最終濃度に加えて、各一晩培養量850μLの凍結ストックを作ります。-80 °C.で保存します。
  19. 残りの4mL培養物からプラスミドDNAをミニ調製DNA抽出キットにより抽出する。
  20. T7末端プライマー(GCTAGTTGCTCAGCGG)を用いたDNAシーケンシングによりペプチドコード配列の正しい挿入を確認する。

2. ビラ図書館の生成

注:初期 BirA 突然変異ライブラリー (図 1c、ステップ 1) は、エラーが発生しやすい PCR によって作成されます。BirA 変異ライブラリを生成する他の方法も同様に機能する可能性があります。

  1. 変異型メガプライマーをBirA-6xHisフォワード(ATGAAGGAACATGTGCCCCCC)とリバース(TCAATGGGGGGGGGGGTTTT)で、ターゲットペプチド配列(ステップ1.20で調製および確認)を使用して、ターゲットペプチド配列と35PCRサイクルを使用して、変異型メガプライマーを合成します。メーカーの指示に従って60 °Cのアニーリング温度と。
  2. 1%のアガロースゲル上で増幅反応の5μLを実行し、984 bp PCR製品の増幅を確認します。
  3. 市販のPCR精製キットを用いて増幅反応の残りの45μLからPCR生成物を精製し、分光光度計を使用してDNA収率を定量します。
    注:単一の45 μL増幅反応からの精製は、一般に十分な収率(>250 ng)を生成します。
  4. 表2に記載の試薬を添加して薄壁PCRチューブでサンプル反応を調製する。
  5. 反応混合物をサーマルサイクラーに移し、次のパラメータを使用してステップ2.3で調製した変異型メガプライマーでPCRを実行します:95°Cで1分、95°Cで50sの25サイクル、60°Cで50s、68°Cで12分。反応を4°Cに保存します。
  6. 増幅反応に直接DpnI制限酵素の1 μLを加え、穏やかに混合します。
  7. 反応混合物をスピンダウンし、37°Cで2時間インキュベートします。
  8. DpnI反応の2μLを有するT7 Express lysY/Iq有能な大腸菌細胞を変換する。
  9. 100 μg/mLアンピシリンを含む100mL LBを形質転換細胞で接種し、200rpmで振盪して37°Cで一晩インキュベートします。
  10. 15%のグリセロールとLBの一晩培養の10 mLで冷凍ストックを作り、-80 °Cで保存します。

3. ビオチン化ペプチドを発現する細菌の選択

注:プロトコルのこの部分は、図 1cの手順 2-5 をカバーしています。選択アプローチは、pBAD-BirA-eCPX-AP と pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A)を正および負のコントロールとして設定することを強くお勧めします。

  1. 1%のブドウ糖と100 μg/mLのアンピシリンを1mLのBirAライブラリーで含むLBの100 mLを接種し、200rpmで振って37°Cで一晩インキュベートします。
  2. 1%グルコースを含むLBの5 mLと100 μg/mLアンピシリンを一晩培養の100μLで接種する。
  3. 培養量が約0.5のOD600に達するまで2時間30分間インキュベートする。
  4. 0.2%w/v L-アラビノース、100 μMイソプロピルβ-D-1-チオガラクピラノサイド(IPTG)および100μMビオチンでeCPXおよびBirA発現を誘導し、37°Cで1時間200rpmで培養物を振ります。
  5. 5,000 x gで10分間培養を遠心分離し、上清を取り除きます。
  6. 氷冷PBSの1 mLで細胞を再中断し、遠心分離機を5分間5,000 x gで再濁させる。
  7. 上清を廃棄し、400 μLの氷冷PBSで細胞を再懸濁し、氷上に細胞を保存します。
  8. 再懸濁した細胞の10 μLを取り出し、「入力」とラベル付けされた1.5 mLチューブで氷の上に保存します。
  9. 20 μLのストレプトアビジン磁気ビーズを1mLの氷冷PBSで洗浄し、上清を慎重に除去する前に、チューブをベンチトップ磁性粒子セパレータに入れます。
  10. 20 μLの氷冷PBSでストレプトアビジン磁気ビーズを再懸濁し、ステップ3.8から再懸濁細胞の390 μLに移します。
  11. 穏やかにピペッティングして混ぜ、4°Cで30分間インキュベートします。
    注:これは細胞をlysese可能性があるため、渦をしないでください。ビーズの凝集は、多くの場合、ビオチン化ペプチドを示す細菌の豊富さで観察される。
  12. 磁性磁性球を持つカラムを磁性粒子セパレータに入れ、5mLの氷冷PBSで洗浄します。
  13. セルセパレータに取り付けられたカラムに細胞およびストレプトアビジン磁気ビーズを移す。
  14. カラムリザーバが空になったら、500 μLの氷冷PBSを追加し、カラムが5mLの氷冷PBSの総体積で洗浄されるまで繰り返します。
  15. セパレータからカラムを取り外し、1.5 mLチューブに入れます。
  16. 氷冷PBSのピペット1mLをカラム上に置き、カラムに付属のプランジャーを塗布して磁気標識細胞を溶出させる。
  17. 1.5 mLチューブをベンチトップセパレータに移し、磁気標識セルを1mLの氷冷PBSで洗浄します。
  18. 磁気標識細胞を氷冷PBSの1mLで静かに再懸濁してから、「出力」とラベル付けされた1.5mLチューブに10μLのリサスペンションを取り出して保存します。
  19. 1%グルコースと100μg/mLアンピシリンを磁気標識細胞で100mLのLBを接種し、200rpmで振盪して37°Cで一晩インキュベートします。
  20. 翌日、10mLの一晩培養を使用して、15%のグリセロールを含むLBの細胞を用いて冷凍ストックを作り、次の選択の次のラウンド、すなわちステップ3.2の夜間培養物の-80°Cと1 mLで保存します。
    注:一般に、ストレプトアビジン結合細菌の濃縮には3〜5ラウンドの選択が推奨される。

4. 濃縮の定量化

注:「入力」および「出力」サンプル中の生菌の定量は、サンプルのシリアル希釈のめっきとその後のコロニー形成単位(CCF)の計数によって、各選択ラウンド後に行われます。

  1. 入力(ステップ3.8から)と出力(ステップ3.18から)に990 μLの氷冷PBSを追加し、チューブにそれぞれ「入力10-2」と「出力10-2」のラベルを付けます。
  2. 「入力10-2」および「出力10-2」サンプルを、入力サンプルで10-10の最終希釈に達するまで、氷冷PBSのサンプルを10倍の連続希釈し、出力サンプルで10-4に達する。
  3. 「入力10-6」、「入力10-8」、「入力10-10」、「出力10-2」、「出力10-3」、「出力10-4」からのサンプルのプレート100μLをLB/Ampプレートに、37°Cで一晩インキュベートします。
  4. 明確に分離されたコロニーを持つプレート上のコロニーの数をカウントします。コロニー数に希釈係数を掛けて、細菌濃度数/100 μLを得ます。
  5. 入力サンプルと出力サンプルの総細菌数をそれぞれ入力(400 μL)と出力体積(1mL)で乗じて計算し、入力セル数で出力を分割して濃縮を推定します。
    注:重要なエンリッチメントは、3-5の選択ラウンドの後に表示される必要があります

5. 選択したBirAバリアントの特性解析

注:キャラクタライゼーションは、最初の BirA ライブラリから BirA バリアントを選択した後に実行できます。しかし、BirA変異体は、一般にペプチドに対する活性が低い。したがって、キャラクタライゼーションの前に、追加の突然変異と選択を実行することもできます。通常、最終選択ラウンドから10クローンは、さらなる特性化のために分離されます。

  1. 最終選択ラウンドから選択したクローンで100 μg/mLアンピシリンを含む5 mL LBを接種します。さらに、T7 Express lysY/Iq E.coliを含む100μg/mLアンピシリンを含む5mL LBをpBAD-BirA-eCPX-APで変換し、以下に説明するウェスタンブロットの陽性対照として使用します。
  2. 200 rpmで振りながら37°Cで一晩インキュベートします。
  3. グリセロールを培養に15%の最終濃度に加えて、各一晩培養量850μLの凍結ストックを作ります。-80 °C.で保存します。
  4. 100 μg/mLアンピシリンを含むLBの5mLを100μLの一晩培養で接種し、2時間200rpmで振盪して37°Cでインキュベートします。
  5. 残りの4mL培養物からプラスミドDNAを市販のミニ調製DNA抽出キットにより抽出する。pBAD(ATGCCATAGCATTTTTCC)およびpTrcHis rev(CTTCTGTGTTGTTATATTG)プライマーを持つBirA変異体の前方および逆方向にDNA配列を実行します。
  6. ステップ5.4から培養物に0.2%w/v L-アラビノースと100 μM IPTGおよび100 μMビオチンを加え、37°Cで1時間200rpmで培養物を振り、eCPXおよびBirA変異体の発現を誘導する。
  7. 培養物の65 μLを、試料装填バッファーの25μLと還元剤の10μLを含む1.5mLチューブに移す。
  8. 95°Cで5分間インキュベートします。
  9. サンプル(陽性コントロールを含む)をサイズマーカーと共に12%SDS-ポリアクリルアミドゲルにロードし、20、25、37 kDaの標準バンドが明確に分離されるまで約45分間200Vでゲル電気泳動を行います。
  10. カセットからゲルを放出し、PVDF膜にゲルをブロッティングするためのサンドイッチを組み立てます。
  11. 氷上で2時間35Vのエレクトロブロット。
  12. PVDF膜を取り出し、ブロッキングバッファー[PBS,0.05%Tween-20,3%スキムミルクパウダー]を1時間振った時にインキュベートします。
  13. PBSTでストレプトアビジン-HRP 1:1,000を希釈してビオチン検出溶液を調製します。
    注:ブロッキングバッファにはビオチンが含まれているため、ストレプトアビジン-HRPの希釈バッファーとして使用しないでください。
  14. ブロッキングバッファーを廃棄し、PBST[PBS,0.05%Tween-20]で速やかに膜を洗浄し、ビオチン検出溶液を添加する。室温で1時間、振り付けでインキュベートします。
  15. ビオチン検出液を廃棄し、室温で穏やかに振って5分間、10分間PBSTで膜を十分に洗浄します。
  16. PBSTを破棄し、2 mL ECLミックスを追加し、振り付けで1分間インキュベートします。
  17. ティッシュペーパーで素早く膜を乾燥させ、X線フィルムまたはデジタルゲルイメージングシステムで画像を開発します。
    注:陽性対照を搭載したレーンでは、2つの異なる連鎖性腫瘍反応バンドが明確に見える必要があります:30 kDaビオチン化内因性発現タンパク質と〜22 kDa eCXP-APバンド。選択された10のコロニーが表示されたペプチドを生化できる場合は、〜22 kDaのバンドが見える必要があります。これらのバンドの強度は、一般に正の制御よりも低いため、より長い露光時間を必要とする場合があります。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

pBAD-BirA-eCPX-AP発現細菌のウェスタンブロットは、eCPXの分子量と一致する〜22 kDa連鎖性連鎖反応バンドを産生する(図2a)。BirA-6xHisとは異なり、生体化eCPX-APは、未誘導培養および誘導培養培養(図2a)の両方に存在し、未誘導培養および内因性BirAによるAPのその後のバイオチリン化においても、T7プロモーター活性が小さいためであった。培養を発現するBirA-eCPX-AP(K10A)では、ビオチン化eCPXバンドは検出されなかった(図2a)。eCPX-AP発現細菌における強い表面生物化は、ストレプトアビジン磁気ビーズを添加した際に凝集を引き起こし、チューブの底部にペレットが形成される(図2b)。eCPX-AP(K10A)発現細菌...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

すべての選択方法に関しては、洗浄ステップのストリンジェンシーが最も重要です。選択したクローンの増幅前にビーズから細菌を照合する必要がないため、以前にファージディスプレイシステムで行われたように、ビオチンとストレプトアビジンの間の高い親和性結合を使用することができます。BirAバリアント7、8の選択。これにより、希少なクローンが選択され、非生物化細菌が廃棄されます。細菌表示を使用するもう一つの利点は、ファージ表示と比較して、細菌表示が定量的な11であり、したがって、酵素活性に基づいて細菌の選択を可能にする。

プロトコルでは、表面上のビオチンの有無に基づいてバイナリ選択システムを作成する細菌を選択するためにMACSを使用しました。しかしながら、定量蛍光活性化細胞選別を用いることにより、代わりに、BirAの最も活性な変異体を発現する細菌を選択することが可能である。これは、最もアクティブなBirAバリアントの効果的な選択を可能...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は何も開示していない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、専門家の技術者の支援のためにモハメド・アブドゥラヒ・アーメドに感謝します。この研究は、ルンドベック財団、ノボ・ノルディスク財団、デンマーク腎臓協会、Aase og Ejnarダニエルセン財団、A.P.モラー医学振興財団、クヌードとエディス・エリクセンからの助成金によって支援されました。記念財団

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10% プレキャスト ポリアクリルアミド ゲルBio-Rad4561033
AmpicilinSigma-AldrichA1593
http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ ArabinoseSigma-AldrichA3256
BiotinSigma-AldrichB4501
DMSOSigma-AldrichD2650
DPBS (10x)、カルシウム、マグネシウムなしThermoFischer Scientific14200083
DpnI 制限酵素New England BioLabsR0176
Dynabeads MyOne ストレプトアビジン C1ThermoFischer Scientific65001
GenElute プラスミド ミニプレップキットSigma-AldrichPLN350
GeneMorph II EZClone Domain MutagensisキットAgilent Technologies200552
グルコースSigma-AldrichG8270
グリセロールSigma-AldrichG5516
Immobilon-P PVDF メンブレンミリポアIPVH15150
IPTGSigma-AldrichI6758
LSカラムMiltenyi Biotec130-042-401
NaClSigma-AldrichS7653
NEB 5-α Competent E. coliNew England BioLabsC2987
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)ThermoFischer ScientificNP0007
NuPAGE Sample Reducing Agent (10x)ThermoFischer ScientificNP0009
pBAD-BirA-eCPX-APAddgene121907テンプレートとポジティブコントロールを使用
pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A)Addgene121908ネガティブコントロール
Q5 ハイフィデリティ DNA ポリメラーゼニューイングランド バイオラボM0491pBAD-BirA-eCPX-AP にペプチド配列を挿入するために、任意のハイフィデリティポリメラーゼは
QuadroMACS セパレーターMiltenyi Biotec130-090-976
スキムミルクを行います粉末Sigma-Aldrich70166
Streptavidin-HRPAgilent TechnologiesP0397
T7 Express lysY/Iq Competent E. coliNew England BioLabsC3013
TryptoneMilliporeT9410
Tween-20Sigma-AldrichP9416
Western Lightning Plus-ECLPerkinElmerNEL103001EA
酵母エキスSigma-AldrichY1625
ApE - からダウンロードしたプラスミドエディター v2.0 NA

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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