方法論記事

共焦点顕微鏡を用いたクロスキングダムバイオフィルムの細胞外pHのモニタリング

DOI：

10.3791/60270

⸱

2020年1月30日

 , 
1Department of Dentistry and Oral Health, Aarhus University

この記事について

サマリー

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このプロトコルは、カンジダ・アルビカンスとストレプトコッカス・ミュータンスからなるクロスキングダムバイオフィルムの栽培を記述し、これらのバイオフィルム内の細胞外pHを監視するための共焦点顕微鏡ベースの方法を提示する。

要約

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真菌細胞と細菌細胞の両方からなるクロスキングダムバイオフィルムは、歯内感染症、歯中炎、粘膜感染症、特に幼児期のうねりなど、さまざまな口腔疾患に関与しています。これらの条件の全てにおいて、バイオフィルムマトリックス中のpHは微生物と宿主の相互作用に影響を及ぼし、ひいては疾患進行に影響を及ぼす。本プロトコルは、カンジダ・アルビカンスおよび連鎖球菌ミュータンを含むクロスキングダムバイオフィルム内のpHダイナミクスをモニターする共焦点顕微鏡ベースの方法を記述する。pH依存性デュアルエミッションスペクトルとレシオメトリックプローブC-SNARF-4の染色特性は、バイオフィルムの細胞外領域におけるpHの低下を決定するために利用される。プローブでpHレシオメトリーを使用するには、細心の注意を払った画像パラメータの選択、染料の完全なキャリブレーション、および画像データの慎重な閾値ベースの後処理が必要です。正しく使用すれば、バイオフィルムの異なる領域における細胞外pHの迅速な評価が可能になり、時間の経過とともに水平および垂直の両方のpH勾配を監視することができます。共焦点顕微鏡の使用は、75 μm以下の薄いバイオフィルムに対するZプロファイリングを制限する一方で、pHレシオメトリーの使用は、界を越えたバイオフィルムにおける重要な毒性因子の非侵襲的研究に理想的に適している。

概要

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真菌種および細菌種の両方を含む界を横断するバイオフィルムは、口腔内のいくつかの病理学的状態に関与している。カンディダ属は、頻繁に歯内感染症1および歯周病変2、3から単離されている。粘膜感染症において、ミツチス群由来のレンサ球菌種は、インビトロモデルおよびマウスモデル4、5、6、7の両方で真菌バイオフィルム形成、組織浸潤、および播種を増強することが示されている。最も興味深いことに、カンディダsppの経口運送は、子供8における齲虫の蔓延に関連することが証明されている。げっ歯類モデルに示すように、レンサ球菌ミュータンとカンジダスアルビカンスとの共生関係は、細胞外多糖の産生を増加させ、より厚く、より多くの齲蝕性バイオフィルム9、10の形成をもたらす。

上記のすべての条件において、特に幼児期のうねりは、疾患進行にとってバイオフィルムpHが重要であり、および、酸性マイクロ環境の開発のためのバイオフィルムマトリックスの著しい役割を有し、11は、クロスキングダムバイオフィルム内のpH変化を研究することを可能にする方法論を求めている。細菌12および真菌13のバイオフィルムの中のpHを監視するための簡単で正確な共焦点顕微鏡ベースのアプローチが開発されている。レシオメトリック色素C-SNARF-4と閾値ベースの画像後処理により、細胞外pHはバイオフィルム14の3次元すべてにおいてリアルタイムに決定することができる。バイオフィルムにおける顕微鏡ベースのpHモニタリングに関する他の公開技術と比較して、C-SNARF-4によるpHレシオメトリーは、参照色素15を含む粒子または化合物の合成または2光子励起16の使用を必要としないため、簡便かつ安価である。1つの染料を使用するだけで、プローブ区画化、蛍光ブリードスルー、選択的漂白16、17、18の問題を防ぎ、細胞内pHと細胞外pHの間で信頼性の高い差別化を可能にします。最後に、色素を用いたインキュベーションは、バイオフィルムの成長後に行われ、実験室とその場で成長したバイオフィルムの両方を研究することができます。

本研究の目的は、pHレシオメトリーの使用を拡張し、界を越えたバイオフィルムのpH変化を研究する方法を提供することである。概念実証として、この方法は、グルコースにさらされたS.ミュータンとC.アルビカンスからなる二重種バイオフィルムのpHを監視するために使用される。

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プロトコル

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唾液採取の議定書はオーフス郡の倫理委員会(M-20100032)によって審査され承認された。

1. クロスキングダムバイオフィルムの栽培

  1. 有酸素条件下で37 °Cの血の寒天の版のS.ミュータンDSM 20523およびC.アルビカンスNCPF 3179を成長させる。
  2. 脳心臓注入(BHI)の5 mLで満たされた試験管に各生物の単一コロニーを移管する。37 °Cで好気条件下で18時間成長します。
  3. 上清を捨て、生理食塩水で細胞を再懸濁し、C.アルビカンス(約107細胞/mL)とS.ミュータン(約108細胞/mL)の場合は、OD550 nmを0.5に調整します。S.ミュータンス懸濁液1:10を無菌生理食塩水(〜107細胞/mL)で希釈します。
  4. ピペット50μLの滅菌唾液は、デ・ジョンら19の方法に従って調製され、顕微鏡検査用の光学底96ウェルプレートのウェルに調製される。37 °Cで30分間インキュベートします。ウェル3xを100μLの無菌生理食塩水で洗浄します。井戸を空にします。
  5. 各ウェルにC.アルビカンスサスペンションの100 μLを追加します。37 °Cで90分間インキュベートし、滅菌生理食塩水で3倍洗浄します。
    注:洗濯中に井戸を完全に空にしないでください。せん断力を避けるために20μLの貯留部を残してください。
  6. 熱不活性化ウシのウシ血清(56°Cで30分間不活性化)を各ウェルに100μL加えます。37 °Cで2時間インキュベートし、滅菌生理食塩水で3倍洗浄します。20 μLの貯蔵所を残して、井戸を空にします。
  7. 各ウェルにS.ミュータンスサスペンション(ステップ1.3で準備)を100μL加えます。5%のショ糖を含むBHIの150 μLを加えます。37 °Cで24時間以上インキュベートします。古いバイオフィルムを栽培する場合は、毎日培地を新鮮なBHIに変更してください。クロスキングドバイオフィルム成長期の終わりに、滅菌生理食塩水で5倍洗浄する。

2. レシオメトリックpHイメージング

注:レシオメトリックpHイメージングは、バイオフィルムの成長が完了した直後に行う必要があります。

  1. レシオメトリックpHイメージングでは、63倍の油または水浸漬レンズ、543nmレーザー線、およびスペクトルイメージングシステム(すなわち、META検出器)を用いて、重なり合う蛍光信号のイメージングを可能にする反転共焦点レーザー走査顕微鏡を使用します。インキュベーターを使用して顕微鏡ステージを35°Cまで温める。
  2. 検出器を設定して、576-608 nm からの緑色蛍光検出と 629-661 nm からの赤色蛍光の同時検出を確認します。露出過多や過少露光を避けるために、適切なレーザーパワーとゲインを選択します。
    注:画像の露出は、間違った着色を持つパレット画像で最もよく見られます。
  3. ピンホールサイズを1エアリーユニットに設定するか、光学スライスを~0.8 μmに設定します。平均オプションを使用して、行平均 2 を選択します。
    メモ:一連の実験の開始時に、選択した顕微鏡設定が細菌細胞、真菌細胞壁、バイオフィルムマトリックス、および真菌細胞質の間の明確なコントラストを提供することを確認してください。
  4. グルコースの0.4%(w/v)を含む無菌生理食塩水の100μLを調製し、pH7に滴定した。C-SNARF-4(ジメチルスルホキシド中1mM)のストック溶液を調製する。染料を30μMの最終濃度に加えます。
    注意: レシオメトリック染料を扱う際は、ニトリル手袋を着用してください。
  5. クロスキングダムバイオフィルムで井戸の1つを空にし、20 μLの貯蔵所を残し、グルコースとレシオメトリック色素を含む無菌生理食分を加えます。96ウェルプレートを顕微鏡ステージに置き、バイオフィルムのイメージングを開始します。
  6. バイオフィルムの異なる場所で単一の画像またはZスタックを取得します。顕微鏡ソフトウェアでX-Y位置をマークし、時間の経過とともに特定の視野でpHの変化に従うようにします。定期的に、レーザーをオフにして画像を撮影し、検出器のオフセットを補正します。
  7. 異なるウェルで成長した各バイオフィルムの分析について、ステップ 2.4 ~2.6 を繰り返します。

3. レシオメトリック色素の校正

メモ:色素のキャリブレーションとキャリブレーション曲線のフィッティングは、レシオメトリックpHイメージングとは異なる日に実行できます。

  1. 50 mM 2-モルフォリノエタンスルホン酸(MES)の一連のバッファーをpH 4.0-7.8に滴定して、35°Cで0.2 pH単位で調製する。顕微鏡検査用光学底96ウェルプレートのウェルに各バッファー溶液のピペット150μL。
  2. 96ウェルプレートのバッファー充填ウェルに染料を加え、最終濃度30μMにします。5分間平衡を取りましょう。
  3. 顕微鏡ステージを35°Cに温める。レシオメトリックpHイメージングと同じ顕微鏡設定を選択します。96ウェルプレートを顕微鏡ステージに置きます。井戸の底に焦点を当てます。すべてのバッファソリューションに対して、ウェルの底部から5μm上の2つの画像(緑と赤のチャンネル)を取得します。定期的に、レーザーをオフにして画像を撮影し、検出器のオフセットを補正します。
  4. 三重でキャリブレーション実験を行います。
  5. すべてのイメージを TIF ファイルとしてエクスポートします。専用の画像解析ソフトウェア(ImageJ20)にインポートします。[プロセス] をクリックして、バッファソリューションのそれぞれの画像からレーザーをオフにして撮影した画像を差し引きます。イメージ電卓 |減算します)。
    注: 必要に応じて、画像をトリミングして、画像|トリミング.
  6. 緑色のチャンネル画像を赤チャンネル画像で分割し、[Analyze]をクリックして、結果の画像の平均蛍光強度を計算します。ヒストグラム.
  7. 三重実験から、pHに対する平均緑/赤比をプロットします。専用のソフトウェアを使用して、キャリブレーションデータ(MyCurveFit)に機能を適合させます。

4. デジタル画像解析

メモ:デジタル画像解析は、色素とレシオメトリックpHイメージングのキャリブレーション後、いつでも実行できます。

  1. 緑と赤のチャンネルのバイオフィルム画像を別々のフォルダに保存し、連続する番号(例えば、GREEN_0001)を持つファイルの両方の名前を変更します。画像を専用の画像分析ソフトウェア(ImageJ)にインポートします。[分析|ヒストグラムは、レーザーをオフにして撮影した画像の平均蛍光強度を決定し、プロセスをクリックしてバイオフィルム画像から値を引く |数学|減算.
  2. 2 つの画像シリーズを専用画像解析ソフトウェア (daime21)にインポートします。赤チャンネル画像のしきい値ベースのセグメンテーションを実行する(Segment |自動セグメンテーション|カスタムしきい値)。真菌細胞質の蛍光強度を上回る「低」閾値と、真菌細胞壁および細菌の強度を下回る「高」閾値を設定する。
    メモ:適切なしきい値を選択すると、細胞外領域のみがオブジェクトとして認識されます。
  3. セグメント化された画像シリーズのオブジェクトレイヤーを、緑のチャンネル画像シリーズに転送します。これを行うには、[セグメント|オブジェクト レイヤーを転送します。
    注: 細胞外領域と真菌細胞質のコントラストが個々のカラーチャンネルで弱すぎる場合は、[編集] をクリックして、セグメンテーションの前に緑色のチャンネル画像シリーズを赤チャンネルシリーズに追加します。画像計算機|追加.4.2 で説明されているようにセグメンテーションを実行し、セグメント化されたイメージシリーズのオブジェクト レイヤーを緑と赤の両方のチャンネル イメージ シリーズに転送します。
  4. オブジェクトエディタを使用して、赤と緑のチャンネル画像シリーズのオブジェクト以外のピクセルを削除します (ビジュアライザー |オブジェクトエディタ|すべての画像で|オブジェクト以外のピクセルを削除する)。今バイオフィルム画像は、細菌および真菌細胞の両方からクリアされます。処理されたイメージシリーズを TIF ファイルとしてエクスポートします。
  5. 両方のイメージ シリーズを ImageJ にインポートします。ImageJ は、オブジェクト以外のすべてのピクセルに 0 の強度を割り当てます。赤の画像シリーズ(R1)をそれ自体で割って、これらのピクセルを削除します(プロセス|画像計算機|画像 1: R1;操作: 除算;図2:R1)、生成された画像系列(R2)と元の赤画像系列を乗算する(プロセス|画像計算機|画像 1: R1;操作: 乗算します。イメージ 2: R2)。R1 の 3 番目のイメージ シリーズ(R3)は、R1 の強度が 0 のすべてのピクセルに NaN が割り当てられている点を除いて、R1 と同一の 3 番目のイメージ シリーズが作成されます。緑の画像シリーズと同じ方法で進みます。
  6. [平均] フィルタを使用する (プロセス|フィルター |平均|半径|1ピクセル)検出器のノイズを補正するために、赤と緑のチャンネル画像シリーズに。緑のチャンネル画像シリーズを赤チャンネル画像シリーズで分割します (プロセス|画像計算機|画像 1: G3;操作: 除算;イメージ 2: R3)。生成されたイメージシリーズ(G3/R3)は、すべてのオブジェクトピクセルの緑/赤の比率を示します。
  7. 各画像の平均比を計算する (分析|ヒストグラム。画像の比率をより良く視覚的に表現するために偽の着色を適用する(画像|ルックアップ テーブル緑と赤の比率を、3.6以下に適合した関数を採用したpH値に変換します。

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結果

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24時間と48時間後、ウェルプレートで開発された堅牢なクロスキングバイオフィルム。C.アルビカンスは様々な程度の糸状成長を示し、S.ミュータンは高さ35μmまでの密なクラスターを形成した。真菌ヒパエの周りにグループ化された単一細胞およびS.ミュータンの鎖、および大きな細胞間空間は、ボリュームマトリックスの存在を示した(図S1)。

レシオメトリック色素の較正は、非対称的なシグモイド曲線13、14をもたらす。バイオフィルム中の細胞外pHは、異なる顕微鏡的視野で異なる速度でグルコースに曝露した後、最初の5分で急速に低下した。その後、酸性化は遅くなり、通常は15分後に5.5~5.8の値に達する(図1)。バイオフィルムの反復は、平均pHのわずかな変動しか示さなかった(図S2)。

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ディスカッション

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C.アルビカンスとストレプトコッカスSppを含むクロスキングダムバイオフィルムの栽培のための異なるプロトコルは、以前に説明されている9、22、23、24、25。しかし、本セットアップでは、単純な成長条件、通常の営業日と互換性のあるタイムスケジュール、バランスのとれた種組成、および膨大なバイオフィルムマトリックスの開発に焦点を当てています。さらに、96ウェルプレートは、ある程度接着の口腔条件を模倣するために唾液溶液でコーティングされた。

C-SNARF-4によるpHレシオメトリーの使用は、バイオフィルムpHの迅速な測定のための安価な方法であり、その利点と欠点は、他の場所で詳細に議論されている

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開示事項

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著者たちは開示するものは何もない。

謝辞

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アネット・アクジャル・トムセンとハビエル・E・ガルシアは、優れた技術サポートを受けています。著者らは、画像解析に関する実りある議論に対するルーベンス・スピン・ネトに感謝している。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
血液寒天プレートStatens Serum Institut677
脳心点滴OxoidCM1135
脳心点滴 + 5% スクロースBDH 実験室用品10274
カンジダ アルビカンス病原性真菌の国立コレクションNCPF 3179
D-(+)-グルコースSigma-AldrichG8270
Daime:微生物生態学におけるデジタル画像分析Universität WienN/Aフリーウェア;V2.1;https://dome.csb.univie.ac.at/daime
ジメチルスルホキシドLife TechnologiesD12345
ウシ胎児血清Gibco Life technologies10270
GS-6R 冷蔵遠心分離機ベックマンN/A
ImageJ国立衛生研究所N/Aフリーウェア;V1.46r;https://imagej.nih.gov/ij
>JavaOracleN/AImageJ を実行するために必要なフリーウェア;V8.0;https://java.com/en/download
>µ-Plate 96 Well BlackIbidi89626
MyCurveFitMyAssays Ltd.N/A
2-(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸(MES)緩衝液Bioworld700728
PHM210 pHメーター放射計 分析
プラン-アポクロマート 63倍油浸対物レンズツァイスN/ANA=1.4
SNARF®-4F 5-(and-6)-Carboxylic AcidLife TechnologiesS23920
滅菌生理食塩水VWR6404
Streptococcus mutansDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenDSM 20523
Vis-spectrophotometer V-3000PCVWRN/A
XL IncubatorPeCONN/A
Zeiss LSM 510 METAZeissN/A

参考文献

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pH pH C SNARF 4 Candida albicans Streptococcus mutans

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