高分解能共焦点顕微鏡による3D腫瘍スフェロイド侵入に対する移動性阻害剤の効果の特徴

前臨床創薬と潜在的な癌薬の開発のための3次元スフェロイド技術は、従来の薬剤スクリーンよりもますます支持されています。したがって、移動性、すなわち移動と侵入防止—薬物の開発が増えている。がん治療におけるこれらの発展の背後にある根拠は明らかである:3Dスフェロイドアッセイは、細胞単層培養よりも忠実に3D腫瘍アーキテクチャを模倣する潜在的な抗癌剤をスクリーニングするためのより現実的なアプローチを表し、薬物と腫瘍の相互作用(動態)をより正確に要約し、腫瘍関連の設定における薬物活性の特徴付けを可能にする。さらに、がん細胞が遠方の腫瘍部位に移行する能力によって増強された転移による多くの癌タイプにおける化学毒性薬に対する耐性の上昇と癌患者の死亡率の高さは、化学療法剤の包含を支持する。将来の臨床癌試験におけるアジュバント治療としての癌細胞の渡り目の可能性を標的^{とする 1.}これは特に、高品位神経膠芽腫(GBM)のような高侵襲性癌の場合に当てはまる。GBM管理には、手術、放射線療法、化学療法が含まれます。しかし、併用治療を行っても、ほとんどの患者は11〜15ヶ^月2、3の中央値生存期間を有する初期診断の1年以内に再発する。3D技術の分野における大きな進歩は、ここ数年で行われてきました:腐敗システム、微細加工構造、3D足場、およびその他の個々のアッセイは、大規模^な4で定期的なテストを可能にするために継続的に改善されています。 ^5,6,7.しかし、これらのアッセイから得られた結果は、2D画像解析システムを用いて3D生成データを解析する試みによってデータ解釈が妨げられることが多いため、有意義な方法で分析する必要があります。

画像取得速度と光毒性の低減の面で好ましいにもかかわらず、ほとんどの広視野システムは^解像度8によって制限されたままです。したがって、薬物有効性に関するデータ読み出しとは別に、広視野システムを用いて画像化すれば、移動細胞の3D細胞構造に対する薬物作用の詳細な影響は必然的に失われる。逆に、共焦点レーザースキャニング顕微鏡(CLSM)は、コンピュータソフトウェアを使用して3D取得後に再構築およびレンダリングすることができる高品質の光学的に切り分けた画像をキャプチャします。したがって、CLSMは複雑な3D細胞構造のイメージングに容易に適用可能であり、それによって3D構造に対する抗移動性阻害剤の影響の調査および細胞移動機構の詳細な分析を可能にする。これは間違いなく将来の移住薬開発を導くでしょう。ここで、スフェロイド生成、薬物処理、染色プロトコル、および高解像度共焦点顕微鏡による特性評価の組み合わせワークフローについて説明する。

1. 細胞スフェロイドの生成

1日目

1. 調査中の細胞株で必要に応じて標準培養培地を調用意する。
2. 無菌処理技術を用いて組織培養フード内のすべての組織培養関連ステップを行う。
3. がん細胞をトリプシン化し、カウントします。プレートあたり20mLのセルサスペンションを使用します。細胞懸濁液は、明確にラベル付きの滅菌ユニバーサルチューブに保管してください。
4. 各ウェルに所定の数のセルを追加します。必要な細胞の初期数と最終的なスフェロイドサイズの両方が、調査対象の細胞株の増殖速度に依存する。
   注:U251およびKNS42^9、10、5x 10³細胞/mLのような確立された神経膠腫細胞株のために、インキュベーションの4日後に顕微鏡的に見える球体(200または800 μm)を作り出す。
5. 細胞の束を避けるために穏やかな反転によって普遍的な管の細胞を再中断する。細胞懸濁液のピペット200μLを96ウェルプレートの各ウェルに入れた。すべての井戸が必要ない場合は、蒸発を避けるために、各空の井戸に1x PBSの200 μLを追加することをお勧めします。
6. 細胞を通常どおり37°Cでインキュベーターでインキュベートします。
   注:グリオーマ癌細胞株などの細胞株は、24時間以内にスフェロイドを形成し、72時間のスフェロイドをインキュベートすることによって3D細胞構造を形成することを可能にする。

2日目

7. 24時間後の明視野顕微鏡で細胞をチェックする 細胞株によっては、細胞が井戸の底部に検出可能なスフェロイドを形成している可能性がある。
   注:確立されたグリオーマ癌細胞株は24時間以内にスフェロイドを容易に形成し、患者由来のグリオーマ癌細胞株は最大1〜2週間かかることがある。

2. コラーゲン侵入アッセイ

3日目

1. コラーゲン、5倍培養培地、1M NaOH、および氷の上に20mLチューブを1本置きます。
2. 冷たい培養管に冷たいコラーゲンの10.4 mLを慎重かつゆっくりと追加します。気泡を避けてください。このコラーゲンの量は、1つの96ウェルプレートのために十分です。アップスケーリングは可能ですが、プレートごとに20mLチューブを1本ずつ用意することをお勧めします。
3. 冷菌5x培養培地の1.52mLをゆっくりと加えます。気泡を避けてください。
4. 使用直前に、冷間無菌1M NaOHの72μLを静かに加えます。氷の上に溶液を保管してください。
5. ピペッティングで優しく混ぜます。気泡を避けてください。効率的な混合は、媒体の色の変化(赤からオレンジレッド(pH 7.4))につながります。使用するまで氷の上に混合物を残します。
6. 重要なステップ:1日目に調製された96ウェルプレートから190μLの上清を取り除きます。井戸の底に形成されたスフェロイドを邪魔しないように非常に注意してください。ピペットは、井戸の中心ではなく、側面に向かって角度で使用します。
7. 各ウェルにコラーゲンミックスの100 μLをゆっくりと加えます。任意のスフェロイドの乱れを防ぐために、井戸の側面にミックスをピペット。気泡を避けてください。重合を評価するために室温で20 mLチューブに残っているコラーゲンミックスを保ちます。
8. インキュベーター内のプレートを少なくとも10分間インキュベートし、コラーゲンが重合することを可能にする。ガイドラインとして、残りのコラーゲンが設定されている場合、半固体およびスポンジ状になり、スフェロイドは阻害剤で処理する準備ができている。
9. 培養剤に2倍濃度で薬剤または阻害剤を添加する。各ウェルに適当にミディアムを加えます(ウェルあたり100μL)。繰り返しますが、スフェロイドの乱れを避けるために、ウェルの側面に媒体をピペットします。
10. T = 0 h、24 h、48 h、および 72 h の時間に明視野顕微鏡検査によって各スフェロイドを観察し、画像化し、薬物活性を評価します。その後、プレートをインキュベーターに戻します。
    注:細胞株の侵襲的挙動に応じて、元の球状コアからの離れた移動が24時間以降に観察されてもよい。

3. 共焦点顕微鏡のためのコラーゲン埋め込みスフェロイドと渡り細胞の調製

1. プレートを組織培養フードに入れ、上清(200μL)を静かに取り除きます。繰り返しますが、これはコラーゲンプラグを妨げる可能性があるため、スフェロイドを邪魔しないように注意し、コラーゲンに触れないようにしてください。
2. 上清を1x PBSの100 μLに置き換えます。この洗浄工程を3回繰り返します。
3. 最終洗浄を取り除き、1x PBS(ウェルあたり100μL)で4%ホルムアルデヒドに置き換えます。
   注意:ホルムアルデヒドは発がんの可能性があります。健康と安全に関するガイドラインに従って、注意して取り扱ってください。
4. 96ウェルプレートをラボベンチに置き、ホイルで覆い、室温で24時間放置します。
5. 慎重にホルムアルデヒドを取り除き、1x PBSに置き換えます。この1x PBS洗浄3xを繰り返します。
6. 1x PBSで0.1%トリトンX-100を準備します。1x PBS洗浄を取り外し、トリトンX-100溶液の100 μLに置き換えます。室温で30分間インキュベートします。その間、1x PBSと0.05%の脱脂粉乳でブロッキング溶液を準備し、完全に混ぜます。
7. トリトンX-100を取り外し、1x PBSで3倍を洗います。各ウェルに100μLのブロッキング溶液を加え、15分間インキュベートします。
8. 所定の濃度でブロッキングバッファーに必要な一次抗体を希釈する。ここで、抗マウスIgGアセチル化チューブリン抗体(1:100)を用いる。
9. 15,682 x gで5分間の一次抗体遮断バッファーミックスを遠心分離する。ブロッキング溶液を慎重に取り外し、各ウェルに上清(25−50 μL)を加えます。室温で1時間暗くインキュベートする。
10. 抗体溶液を取り出し、1x PBS(ウェル当たり100μL)で3xを洗浄します。
11. 任意の追加の蛍光汚れに加えて、推奨または所定の濃度でブロッキングバッファー内の二次抗体を希釈する。ここでは、1:500抗マウスフルオロフォア-488共役抗体、ファロイジン-594(1:500)をアクチン染色、およびDNA染色(DAPI)に用いる。
12. 繰り返しになりますが、13,000rpmで5分間二次抗体溶液を遠心分離します。
13. 各ウェルからブロッキング溶液を取り出し、二次抗体/ファロイジン/DAPIミックスの25~50μLを添加します。室温で1.5時間暗闇の中でインキュベートします。
14. 二次抗体染料溶液を取り出し、1x PBS(ウェル当たり100μL)で3倍を洗浄します。
15. プラスチックピペット(200μL)を使用して、高品質のプレーンガラススライドの中心に吸引して個々のコラーゲンプラグを慎重に持ち上げます。
16. コラーゲンプラグに適切なマウントを1滴加え、プラグが完全に覆われていることを確認します。気泡を避けてください。
17. イメージングに使用され、一晩設定できるようにする顕微鏡目的のための最適な厚さのカバースリップを適用します。暗い所温でスライドを保管してください。

4. 蛍光顕微鏡

1. 適切な共焦点顕微鏡を使用して蛍光画像をキャプチャします。

3次元スフェロイド技術は、がん特異的な環境をより代表的に表しているため、薬物腫瘍相互作用の理解を進めています。スフェロイドの生成は、いくつかの方法で達成することができます。このプロトコルでは、低付着96ウェルプレートが使用されました。異なるメーカーからいくつかの製品をテストした後、彼らは一貫して成功したスフェロイドの生産と均一性の面で最高のパフォーマンスを発揮したので、ここで使用されるプレートが選ばれました。成長培地がコラーゲンマトリックスに置き換えられる置換工程は、プロトコルの重要なポイントです。スフェロイド自体を邪魔することなく、媒体のほとんどを取り除くために細い注意が必要です。広視野顕微鏡による薬物誘発効果の特性を特徴付ける自動イメージングは、任意のハンドラーバイアスを除去すると考えられるかもしれませんが、現在市販されている機器はイメージングアプローチよりもかなり高価なままです。ここで概説します。

広視野上蛍光顕微鏡は、細胞の移動および侵入に対する薬物活性の影響を調べることができる。しかし、広視野顕微鏡検査から得られた分解能は、細胞形態に対する薬物効果に関する結果の詳細な解釈を可能にするのに十分ではない(図1)。ここで、グリオーマ・スフェロイドの調製および細胞の移動を容易に再現可能な染色プロトコルを介して記載し、続いて共焦点顕微鏡を用いて画像化する。広視野顕微鏡画像解析から、MI-192阻害剤による治療後の神経膠腫細胞に異なる形態変化が生じていることは明らかであったが、明確に定義された詳細は欠けていた。共焦点顕微鏡検査は、初期の所見を確認し、これらの高解像度画像は、さらにMI-192の効果の評価を可能にしました。未処理(対照)スフェロイド、移動細胞(図2)、および処理されたスフェロイドと細胞(図3)との間に有意な差が明らかになった。成体神経膠腫細胞株U251は「スパイク」で移行するように見えたのに対し、単一細胞を取り離して元の球体コアから放射し、小児細胞株KNS42は、明確な細胞スパイクがほとんどないシート状の遊離パターンを採用した。以前は、異なる細胞株間の異なる移行パターン(ここでは成人神経膠腫細胞株U251および小児細胞株KNS42)が観察され、それらが生じた細胞型および腫瘍単離部位を反映する可能性がある。重要なことに、増え続ける阻害剤濃度(0.1−10 μMから)を伴う酢酸化チューブリンの増加は、移行細胞だけでなく、スフェロイド関連細胞においても明らかになった。これは、最初の広視野顕微鏡で取得された画像では明らかではなかった。さらなるイメージングは、移動性阻害剤による治療に対する細胞応答としてのタンパク質発現レベルの定量的分析も可能にする。

本研究では、治療に応じて細胞が形態的に変化することが実証された。細胞丸めは、最も高い阻害剤濃度(10μM)で阻害剤濃度と細胞死を増加させ、U251細胞で核断片化が明らかになり、KNS42で微小管および核断片化が明らかになった。これらの知見は、グリオーマ細胞株上のMI-192の抗移動活性が濃度依存性13,14であるという以前の観察と一致している。プロトコルの全体的なワークフローを図 4 に示します。

図1:広視野顕微鏡で画像化したコラーゲンへの球状細胞浸潤細胞株U251およびKNS42の代表的な画像は、1μMの抗移動濃度および24時間間隔で阻害剤MI-192で処理した後に示される。治療を受けのないコントロールスフェロイドも示されている。潜在的な反移動効果またはプロマイグラトリー効果は、強調表示(矢印)として検出されます。これは特にKNS42で顕著であり、コントロールまたは処理されたスフェロイドのいずれの移行も一見ありません。すべての画像は4倍で撮影されました。スケールバー = 1,000 μm. SF188 = 200 μm、KNS42 = 1,000 μm の拡大画像のスケールバーを表示するには、ここをクリックしてこの図の大きなバージョンを表示してください。

図2:共焦点顕微鏡で明らかになった神経膠腫細胞株U251に対するマイグラスタティック阻害剤MI-192の効果。固定および染色されたグリオーマスフェロイドおよび移動細胞は、明確な渡り目の型を表示します。元の球状のエッジに近い移動細胞が表示されます。U251細胞スフェロイドは、元のスフェロイドから放射するスパイクを特徴とし、阻害剤濃度の上昇に伴って明らかな細胞の細胞丸めを増加させる(矢印は細胞スパイクを示す)。スケールバー = 10 μm. ラベル: 赤 = アクチン、 緑 = アセチル化チューブリン、青 = DAPI.各画像について、単一の代表的な光学セクションが、比較目的で維持される前と後の両方の設定でキャプチャされました。すべての画像は、その後処理されました。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:共焦点顕微鏡で明らかになったグリオーマ細胞株KNS42に対するマイグラスタティック阻害剤MI-192の効果。KNS42の移行は、単一細胞スパイクを伴うシート状の突起によって特徴付けられます(矢印は細胞シートを示します)。最も低い阻害剤濃度では、この表現型は顕著に見えるが、阻害剤濃度の増加と共に失われる(スケールバー= 10 μm);。ラベル: 赤 = アクチン、緑 = アセチル化チューブリン、青 = DAPI.各画像について、単一の代表的な光学セクションがキャプチャされ、比較目的で画像前と後の両方のキャプチャを持つすべての設定が維持されました。すべての画像は、その後処理されました。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 4: ワークフローの概要。このワークフローに組み込まれるのは、スフェロイドの生成であり、コラーゲンに埋め込み、薬物治療、固定、染色、および共焦点顕微鏡によるイメージングである。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

著者は利益相反を宣言しない。