高分解能共焦点顕微鏡による3D腫瘍スフェロイド侵入に対する移動性阻害剤の効果の特徴

サマリー

ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤を用いた三次元(3D)侵入アッセイにおけるグリオーマ癌細胞移動に対する移行抑制剤の効果は、高分解能共焦点顕微鏡によって特徴付けられる。

要約

がん研究における創薬と開発は、3D形式の薬剤スクリーンに基づいてますます進んでいます。がん細胞の移動性および侵襲性を標的とする新規阻害剤、ひるま症などの高侵襲性癌における補完的な治療法として発見され、考えられている。したがって、薬剤の添加後の3D環境における細胞の詳細な分析を可能にするデータの生成が必要となる。ここで説明する方法論は、共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)による高解像度画像キャプチャーとデータ解析とスフェロイド侵入アッセイを組み合わせることで、潜在的な抗渡走阻害剤の効果の詳細な特徴付けを可能にした。グリオーマ細胞上のMI-192.スフェロイドは、低付着性96ウェルプレートの侵入アッセイ用の細胞株から生成され、CLSM分析のために調製された。記載されたワークフローは、容易さと再現性の両方に起因する他の一般的に使用されるスフェロイド生成技術よりも好まれていました。これは、従来の広視野アプローチと比較して共焦点顕微鏡によって達成される高められた画像分解能と組み合わせることで、次の3D環境における移動細胞における明確な形態変化の同定と分析を可能にした。移動性薬物MI-192による治療。

概要

前臨床創薬と潜在的な癌薬の開発のための3次元スフェロイド技術は、従来の薬剤スクリーンよりもますます支持されています。したがって、移動性、すなわち移動と侵入防止—薬物の開発が増えている。がん治療におけるこれらの発展の背後にある根拠は明らかである:3Dスフェロイドアッセイは、細胞単層培養よりも忠実に3D腫瘍アーキテクチャを模倣する潜在的な抗癌剤をスクリーニングするためのより現実的なアプローチを表し、薬物と腫瘍の相互作用(動態)をより正確に要約し、腫瘍関連の設定における薬物活性の特徴付けを可能にする。さらに、がん細胞が遠方の腫瘍部位に移行する能力によって増強された転移による多くの癌タイプにおける化学毒性薬に対する耐性の上昇と癌患者の死亡率の高さは、化学療法剤の包含を支持する。将来の臨床癌試験におけるアジュバント治療としての癌細胞の渡り目の可能性を標的^{とする 1.}これは特に、高品位神経膠芽腫(GBM)のような高侵襲性癌の場合に当てはまる。GBM管理には、手術、放射線療法、化学療法が含まれます。しかし、併用治療を行っても、ほとんどの患者は11〜15ヶ^月2、3の中央値生存期間を有する初期診断の1年以内に再発する。3D技術の分野における大きな進歩は、ここ数年で行われてきました:腐敗システム、微細加工構造、3D足場、およびその他の個々のアッセイは、大規模^な4で定期的なテストを可能にするために継続的に改善されています。 ^5,6,7.しかし、これらのアッセイから得られた結果は、2D画像解析システムを用いて3D生成データを解析する試みによってデータ解釈が妨げられることが多いため、有意義な方法で分析する必要があります。

画像取得速度と光毒性の低減の面で好ましいにもかかわらず、ほとんどの広視野システムは^解像度8によって制限されたままです。したがって、薬物有効性に関するデータ読み出しとは別に、広視野システムを用いて画像化すれば、移動細胞の3D細胞構造に対する薬物作用の詳細な影響は必然的に失われる。逆に、共焦点レーザースキャニング顕微鏡(CLSM)は、コンピュータソフトウェアを使用して3D取得後に再構築およびレンダリングすることができる高品質の光学的に切り分けた画像をキャプチャします。したがって、CLSMは複雑な3D細胞構造のイメージングに容易に適用可能であり、それによって3D構造に対する抗移動性阻害剤の影響の調査および細胞移動機構の詳細な分析を可能にする。これは間違いなく将来の移住薬開発を導くでしょう。ここで、スフェロイド生成、薬物処理、染色プロトコル、および高解像度共焦点顕微鏡による特性評価の組み合わせワークフローについて説明する。

プロトコル

1. 細胞スフェロイドの生成

1日目

1. 調査中の細胞株で必要に応じて標準培養培地を調用意する。
2. 無菌処理技術を用いて組織培養フード内のすべての組織培養関連ステップを行う。
3. がん細胞をトリプシン化し、カウントします。プレートあたり20mLのセルサスペンションを使用します。細胞懸濁液は、明確にラベル付きの滅菌ユニバーサルチューブに保管してください。
4. 各ウェルに所定の数のセルを追加します。必要な細胞の初期数と最終的なスフェロイドサイズの両方が、調査対象の細胞株の増殖速度に依存する。
   注:U251およびKNS42^9、10、5x 10³細胞/mLのような確立された神経膠腫細胞株のために、インキュベーションの4日後に顕微鏡的に見える球体(200または800 μm)を作り出す。
5. 細胞の束を避けるために穏やかな反転によって普遍的な管の細胞を再中断する。細胞懸濁液のピペット200μLを96ウェルプレートの各ウェルに入れた。すべての井戸が必要ない場合は、蒸発を避けるために、各空の井戸に1x PBSの200 μLを追加することをお勧めします。
6. 細胞を通常どおり37°Cでインキュベーターでインキュベートします。
   注:グリオーマ癌細胞株などの細胞株は、24時間以内にスフェロイドを形成し、72時間のスフェロイドをインキュベートすることによって3D細胞構造を形成することを可能にする。

2日目

7. 24時間後の明視野顕微鏡で細胞をチェックする 細胞株によっては、細胞が井戸の底部に検出可能なスフェロイドを形成している可能性がある。
   注:確立されたグリオーマ癌細胞株は24時間以内にスフェロイドを容易に形成し、患者由来のグリオーマ癌細胞株は最大1〜2週間かかることがある。

2. コラーゲン侵入アッセイ

3日目

1. コラーゲン、5倍培養培地、1M NaOH、および氷の上に20mLチューブを1本置きます。
2. 冷たい培養管に冷たいコラーゲンの10.4 mLを慎重かつゆっくりと追加します。気泡を避けてください。このコラーゲンの量は、1つの96ウェルプレートのために十分です。アップスケーリングは可能ですが、プレートごとに20mLチューブを1本ずつ用意することをお勧めします。
3. 冷菌5x培養培地の1.52mLをゆっくりと加えます。気泡を避けてください。
4. 使用直前に、冷間無菌1M NaOHの72μLを静かに加えます。氷の上に溶液を保管してください。
5. ピペッティングで優しく混ぜます。気泡を避けてください。効率的な混合は、媒体の色の変化(赤からオレンジレッド(pH 7.4))につながります。使用するまで氷の上に混合物を残します。
6. 重要なステップ:1日目に調製された96ウェルプレートから190μLの上清を取り除きます。井戸の底に形成されたスフェロイドを邪魔しないように非常に注意してください。ピペットは、井戸の中心ではなく、側面に向かって角度で使用します。
7. 各ウェルにコラーゲンミックスの100 μLをゆっくりと加えます。任意のスフェロイドの乱れを防ぐために、井戸の側面にミックスをピペット。気泡を避けてください。重合を評価するために室温で20 mLチューブに残っているコラーゲンミックスを保ちます。
8. インキュベーター内のプレートを少なくとも10分間インキュベートし、コラーゲンが重合することを可能にする。ガイドラインとして、残りのコラーゲンが設定されている場合、半固体およびスポンジ状になり、スフェロイドは阻害剤で処理する準備ができている。
9. 培養剤に2倍濃度で薬剤または阻害剤を添加する。各ウェルに適当にミディアムを加えます(ウェルあたり100μL)。繰り返しますが、スフェロイドの乱れを避けるために、ウェルの側面に媒体をピペットします。
10. T = 0 h、24 h、48 h、および 72 h の時間に明視野顕微鏡検査によって各スフェロイドを観察し、画像化し、薬物活性を評価します。その後、プレートをインキュベーターに戻します。
    注:細胞株の侵襲的挙動に応じて、元の球状コアからの離れた移動が24時間以降に観察されてもよい。

3. 共焦点顕微鏡のためのコラーゲン埋め込みスフェロイドと渡り細胞の調製

1. プレートを組織培養フードに入れ、上清(200μL)を静かに取り除きます。繰り返しますが、これはコラーゲンプラグを妨げる可能性があるため、スフェロイドを邪魔しないように注意し、コラーゲンに触れないようにしてください。
2. 上清を1x PBSの100 μLに置き換えます。この洗浄工程を3回繰り返します。
3. 最終洗浄を取り除き、1x PBS(ウェルあたり100μL)で4%ホルムアルデヒドに置き換えます。
   注意:ホルムアルデヒドは発がんの可能性があります。健康と安全に関するガイドラインに従って、注意して取り扱ってください。
4. 96ウェルプレートをラボベンチに置き、ホイルで覆い、室温で24時間放置します。
5. 慎重にホルムアルデヒドを取り除き、1x PBSに置き換えます。この1x PBS洗浄3xを繰り返します。
6. 1x PBSで0.1%トリトンX-100を準備します。1x PBS洗浄を取り外し、トリトンX-100溶液の100 μLに置き換えます。室温で30分間インキュベートします。その間、1x PBSと0.05%の脱脂粉乳でブロッキング溶液を準備し、完全に混ぜます。
7. トリトンX-100を取り外し、1x PBSで3倍を洗います。各ウェルに100μLのブロッキング溶液を加え、15分間インキュベートします。
8. 所定の濃度でブロッキングバッファーに必要な一次抗体を希釈する。ここで、抗マウスIgGアセチル化チューブリン抗体(1:100)を用いる。
9. 15,682 x gで5分間の一次抗体遮断バッファーミックスを遠心分離する。ブロッキング溶液を慎重に取り外し、各ウェルに上清(25−50 μL)を加えます。室温で1時間暗くインキュベートする。
10. 抗体溶液を取り出し、1x PBS(ウェル当たり100μL)で3xを洗浄します。
11. 任意の追加の蛍光汚れに加えて、推奨または所定の濃度でブロッキングバッファー内の二次抗体を希釈する。ここでは、1:500抗マウスフルオロフォア-488共役抗体、ファロイジン-594(1:500)をアクチン染色、およびDNA染色(DAPI)に用いる。
12. 繰り返しになりますが、13,000rpmで5分間二次抗体溶液を遠心分離します。
13. 各ウェルからブロッキング溶液を取り出し、二次抗体/ファロイジン/DAPIミックスの25~50μLを添加します。室温で1.5時間暗闇の中でインキュベートします。
14. 二次抗体染料溶液を取り出し、1x PBS(ウェル当たり100μL)で3倍を洗浄します。
15. プラスチックピペット(200μL)を使用して、高品質のプレーンガラススライドの中心に吸引して個々のコラーゲンプラグを慎重に持ち上げます。
16. コラーゲンプラグに適切なマウントを1滴加え、プラグが完全に覆われていることを確認します。気泡を避けてください。
17. イメージングに使用され、一晩設定できるようにする顕微鏡目的のための最適な厚さのカバースリップを適用します。暗い所温でスライドを保管してください。

4. 蛍光顕微鏡

1. 適切な共焦点顕微鏡を使用して蛍光画像をキャプチャします。

結果

3次元スフェロイド技術は、がん特異的な環境をより代表的に表しているため、薬物腫瘍相互作用の理解を進めています。スフェロイドの生成は、いくつかの方法で達成することができます。このプロトコルでは、低付着96ウェルプレートが使用されました。異なるメーカーからいくつかの製品をテストした後、彼らは一貫して成功したスフェロイドの生産と均一性の面で最高のパフォーマンスを発揮したので、ここで使用されるプレートが選ばれました。成長培地がコラーゲンマトリックスに置き換えられる置換工程は、プロトコルの重要なポイントです。スフェロイド自体を邪魔することなく、媒体のほとんどを取り除くために細い注意が必要です。広視野顕微鏡による薬物誘発効果の特性を特徴付ける自動イメージングは、任意のハンドラーバイアスを除去すると考えられるかもしれませんが、現在市販されている機器はイメージングアプローチよりもかなり高価なままです。ここで概説します。

広視野上蛍光顕微鏡は、細胞の移動および侵入に対す...

ディスカッション

高解像度共焦点顕微鏡を用いて移動性薬物活性を同定するための癌細胞スフェロイドを作成する新しい方法が記載されている。ぶら下げ^滴15などの他の技術に対する低付着板の使用は、コラーゲン移行および侵入アッセイで使用するための再現性と均一なスフェロイドを生成する手段を容易にした。このプロトコルの重要なポイントは、コラーゲンマトリックスに埋め込まれる細胞スフェロイドの前の96ウェルプレートからの成長培地の除去と、その後のスフェロイドを含むコラーゲンプラグの慎重な取り扱いである。デジタルマイクロ^流体16などの新しい技術が利用可能になり、より高価であるが、メディアおよび流体の手動除去に代わる手段を提供する可能性がある。記載されたプロトコルの主な制限は、単一のスフェロイドを画像化し、阻害剤の薬物活性を評価するために明るい視野顕微鏡で手動で分析する場合に時間がかかることです。また、工程のすべての工程に必要な試薬は高価であり、高分解能共焦点顕微鏡という特殊な装置も必要です。播種に必要な最適な細胞数および必要なサイズの細胞スフェロイドを得るのに要する時間も、コラーゲ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
コラーゲンI、ラットテール、	100 mg Corning	354236	;これは多くの販売代理店/製造業者によって提供されており、意図するアッセイのタイプと使用する細胞株の両方について決定する必要があります。神経膠腫がん細胞株の場合、コラーゲンラットテール1型(例:コーニング)が好ましい選択です。コラーゲンは4°Cで保存する必要があります。C、暗闇の中で、必要になるまで。異なるバッチのコラーゲンを混合することは、重合したコラーゲンの一貫性に影響を与える可能性があるため、お勧めできません。
顕微鏡イメージング用の	さまざまな		カバースリップ
DMEM粉末	シグマ	D5648	、神経膠腫浸潤アッセイ用のコラーゲン溶液に5倍の濃度で必要です。 これは、粉末状で購入し、二重蒸留水で構成し、成長培地の最終組成に応じて、必要な添加剤で完成させることができます。完全な5倍溶液は、シリンジフィルターシステム(0.22 μm)使用前に。
神経膠腫細胞株の細胞培養に必要な	ウシの胎児血清	Sigma	F7524-500ML
顕微鏡		イメージングに	各種
高グルコースDMEM	神経膠腫細胞株の細胞培養に必要な	Gibco	41965062
阻害剤	トクリス	各種	さまざまな - 実験計画による。阻害剤は、SelleckchemやTocrisなどのメーカーから購入できます。これらのメーカーは、阻害剤の特性に関する詳細な説明、関連する参考文献へのリンク、および使用濃度の提案を提供しています。すべての阻害剤と同様に、それらは潜在的に有毒である可能性があり、健康と安全のガイドラインに従って取り扱われるべきです。阻害剤は、メーカーが推奨するストック溶液として調製されます。一例として、ミグラスタット阻害剤MI-192を使用して、そのような阻害剤の使用を実証しました。この方法で、さまざまな遊走抑制剤を試験し、同等の結果が得られました。
		顕微鏡イメージング用	各種封入剤
NaOH (1 M)	各種	さまざまな	NaOHは、必要なモル濃度で購入するか、固体の形で調製することができます。調製した溶液は、シリンジフィルターシステムを使用してフィルター滅菌する必要があります。One M NaOHは腐食性であるため、溶液調製中に注意する必要があります。
パラホルムアルデヒド		スフェロイドや細胞を固定するための様々な種類、4%で構成し、健康被害に注意し、健康と安全の規制が侵襲アッセイのコラーゲン溶液に遵守されていることを確認します
テット(目盛り付きピペット、3mL)	浸		潤アッセイ、溶液除去
PBS、組織培養用滅菌	グマ	D1408-500ML	神経膠腫細胞株の細胞培養および染色用洗浄液に必要
神経膠腫細胞株の細胞培養に必要な	Sigma		P4333
一次抗体、二次抗体、DAPI、ファロイジン	など		メーカーが多く、二次標識抗体にはAlexa Fluor(Molecular Probes)を推奨しています。ここでは一次抗体にマウス抗アセチル化チューブリン抗体 (1/100, Abcam) を用いました。二次抗体には、1/500 抗マウス Alexa Fluor 488 標識抗体 Molecular Probes を使用しました。核染色には、DAPI(多くのメーカー)とアクチン染色のファロイジン(多くのメーカー)を使用し、どちらも推奨希釈率1/500で使用しました。
倍の濃度で神経膠腫浸潤アッセイのためのコラーゲン溶液に必要な	重炭酸ナトリウム	シグマ	S5761
	膠腫浸潤アッセイのためのコラーゲン溶液に必要な	シグマ	P5280
トリプシン化のための	トリプシン	シグマ	T4049
超低アタッチメントプレート	シグマ/Nunc	CLS7007-24EA	神経膠腫浸潤アッセイ用;低接着性プレートが必要であり、調査中の化合物の大規模なスクリーニングを可能にするために96ウェルプレートが好まれます。市販されているいくつかの低接着プレートがあります。最適なスフェロイド生成のために、さまざまなプレートをテストすることをお勧めします。私たちの経験では、蓋付きの丸底のCostar Ultra Low Clusterは、100%のスフェロイド形成と再現性の点で、神経膠腫癌細胞からのスフェロイドの生成に最適です。これらのプレートは、当研究室では、患者由来の材料、膀胱がん、卵巣がん細胞からの神経膠腫スフェロイドの作製にも成功裏に使用されました。さらに、ステムまたは前駆ニューロスフェアをこれらのプレートで使用して、標準化されたニューロスフェロイド
ストライペット(血清学的ピペット、滅菌、5mLおよび10mL)	さまざまなもの、例えばCostar	CLS4488-50;組織	培養およびコラーゲン調製のための
さまざまなマルチチャネル(50 - 250 μL)およびシングルチャンネルピペット(10 μL、50 μL、200 μL 1 mL)	各種		細胞・スフェロイドハンドリング用
各種 広視野顕微鏡	各種	ここでは	、広視野蛍光画像はEVOS FL細胞イメージングシステム(Thermo Fisher Scientific)を使用してキャプチャされました。
Zeiss LSM 880 CLSMは、Plan Apochromat 63x 1.4 NAオイル対物レンズを装備しています	メーカーからのZeiss	の引用	共焦点画像は、Plan Apochromat 63x 1.4 NAオイル対物レンズを装備したZeiss LSM 880 CLSMを使用してキャプチャされました。Diode 405nm、458/488/514 nmのアルゴンマルチライン、およびHeNe 594nmレーザーを使用して、それぞれPhalloidin 594、Alexa Fluor 488、およびDAPIを励起しました。各画像について、1つの代表的な光学セクションがキャプチャされ、画像キャプチャ前とキャプチャ後の両方のすべての設定が比較目的で維持されました。その後、すべての画像は、関連するZenイメージングソフトウェアとAdobe Photoshopを使用して処理されました。

神経膠腫浸潤アッセイ用のはスライドガラス パスシ様々な5 5倍の濃度で神経CLS4487-50