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方法論記事

光音響フローサイトメトリーを用いた卵巣癌検出

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DOI:

10.3791/60279

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2020年1月17日

 ,  , 
1School of Biological and Health Systems Engineering, Arizona State University

この記事について

サマリー

カスタムメイドの光音響流れ系と標的葉酸キャップ銅硫化銅ナノ粒子を利用した循環卵巣腫瘍細胞を検出するプロトコルが提示される。

要約

多くの研究は、循環腫瘍細胞(CtC)の列挙が卵巣癌の予後ツールとしての約束を示すかもしれないことを示唆している。CTCの検出のための現在の戦略は、フローサイトメトリー、マイクロ流体デバイス、およびリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を含みます。最近の進歩にもかかわらず、早期卵巣癌転移の検出方法は、臨床翻訳に必要な感受性および特異性を依然として欠いている。ここでは、フローチャンバーやシリンジポンプを含むカスタム3次元(3D)プリントシステムを利用した光音響フローサイトメトリー(PAFC)による卵巣循環腫瘍細胞の検出に関する新しい方法を提示する。この方法は、PFCによるSKOV-3卵巣癌細胞を標的とする葉酸キャップ硫化銅ナノ粒子(FA-CuS NPs)を利用する。この研究は、卵巣癌細胞に対するこれらの造影剤の親和性を示す。その結果、蛍光顕微鏡によるNP特性評価、PAFC検出、NP取り込みが示され、生理学的に関連する濃度で卵巣CtCを検出するこの新規システムの可能性を実証した。

概要

卵巣癌は最も致命的な婦人科の悪性腫瘍の一つであり、2018年に世界中で推定184,800人の死亡をもたらした。複数の研究は、卵巣癌の進行(すなわち、転移)とCTC2、3、4の存在との間の相関関係を示している。CTCの検出および単離のための最も一般的な方法は、EpCam受容体5を標的とするセルサーチシステムを利用する。しかしながら、EpCam発現は、癌転移6に関与している間葉転移に対する上皮においてダウンレギュレートされる。進歩にもかかわらず、現在の臨床技術は依然として低い精度、高コスト、複雑さに苦しんでいます。これらの欠点により、卵巣CTCの発見と列挙のための新しい技術は、研究の重要な分野となっています。

近年、PAFCは、がん細胞の非侵襲的検出、ナノ材料の分析、および細菌7、8、9の同定に有効な方法として浮上した。PAFCは、光音響を利用して流れの中の分析物を検出することにより、従来の蛍光フローサイトメトリーとは異なります。光音響効果は、熱弾性膨張を引き起こす材料によってレーザー光が吸収されると生成され、超音波トランスデューサ10、11によって検出できる音響波を生成する。従来のフローサイトメトリー法に対するPAFCの利点は、簡潔さ、臨床設定への翻訳の容易さ、および患者サンプル12、13における前例のない深さでのCTCの検出を含む。最近の研究では、内因性および気球コントラスト14、15を用いた細胞の検出にPAFCシステムを利用している。近赤外線(NIR)は、インドシアニン緑色色素などの光吸収造影剤、および金属NP(例えば、金およびCuS)を光音響イメージング16、17、18と組み合わせて細胞および組織の選択的標識に使用されている。生体組織内のNIR光の浸透深さが改善されたため、吸収剤の光音響検出は臨床応用のためのより大きな深さで行うことができる。クリニックでの使用の可能性が大きいため、標的NIR造影剤とPAFCの組み合わせにより、CTCの検出に大きな関心が生じています。

PAFCとターゲット造影剤を組み合わせることで、CTCの精度向上と標的検出を行う患者サンプルの高スループット分析に対する改善されたアプローチが提供されます。CTCの主要な検出戦略の1つは、目的の細胞上に存在する膜タンパク質の特異的ターゲティングです。卵巣CtCの顕著な特徴の1つは、外膜19に位置する葉酸受容体の過剰発現である。葉酸受容体ターゲティングは、葉酸受容体の発現が高い内因性細胞が一般的に発光しており、血流20への暴露が制限されているため、血液中の卵巣CTCの同定のための理想的な戦略である。硫化銅NP(CuS NPs)は、最近、癌細胞21に発現する葉酸受容体を標的とする能力が認められている。NIRの生体適合性、合成の容易さ、吸収と組み合わせることで、これらのNP造影剤はPAFCを利用した卵巣CtCの検出に理想的なターゲティング戦略を作ります。

本研究では、FA-CuS NPの調製と光音響流れ系における卵巣癌細胞の検出のための使用について説明する。CuSのNPは、特に卵巣CTCを標的とし、1,053 nmレーザーで刺激されたときに光音響信号を放出するために葉酸で修飾されます。この結果は、PAFCシステム内でこれらの光音響造影剤をインキュベートした卵巣癌細胞の検出に成功したことを示している。これらの結果は、1細胞/μLの濃度まで卵巣癌細胞の検出を示し、蛍光顕微鏡検査は、SKOV−3卵巣癌細胞22によるこれらの粒子の取り込みに成功したことを確認する。本研究では、FA-CuSのNS合成、蛍光顕微鏡用試料の調製、光音響流れ系の構築、卵巣癌細胞の光音響検出について詳しく説明する。提示された方法は、FA-CuS NPsを利用した流れの卵巣CTCの正常な同定を示す。

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プロトコル

1. ナノ粒子合成と機能化

注:FA-CuS SPの合成は、以前に公開されたプロトコル21から適合した1つのポット合成法を使用して達成される。
注意:すべての合成は、換気された化学ヒュームフードで発生する必要があります。

  1. 合成の前に、0.2μmの滅菌フィルターを用いて約300mLの脱イオン化(DI)水を濾過する。
  2. 洗剤液で250mLガラスの丸底フラスコを洗浄し、DI水で洗い流します。1mMの溶液を作成するために、100 mLのDI水にCuCl2の0.0134 gを追加します。
  3. CuCl2溶液に0.015gの葉酸(FA)を加え、磁気攪拌バーを使用して約5分間撹拌します。
  4. 200°Lピペットを利用した反応混合物に、Na2S・9H2O(100μL DI水で0.024g)を約10s以上添加します。
    メモ:Na2S·9H2Oを追加すると、溶液は明るい黄色から濃い茶色に色を変更します。
  5. 反応をキャップし、オイルバスに入れ、90°Cに設定し、磁気攪拌バーで攪拌を続けます。約15分後、またはオイルバスが85-90°Cに達したら、さらに1時間反応を進めさせる。混合物は徐々に濃い緑色に変わるはずです。
    メモ:圧力の蓄積を避けるために、反応混合物を加熱しながらシステムを通るようにしてください。
  6. オイルバスから反応容器を取り出し、室温で約10~15分間冷ましてから氷浴に移します。
  7. 反応混合物が20°C以下に冷却されたら、1M NaOHを利用してpHを10に調整し、残りの葉酸を溶液に溶解させる。
  8. 30 kDa遠心分離カラムを使用してFA-CuS反応混合物を精製します。15 mL バッチで溶液をカラムに追加し、3,082 x g で 15 分間遠心分離します。
  9. 全ての反応混合物が濃縮されたら、濃縮画分を再結合し、30kDa遠心分離カラムでpH10 NaOHの15 mLで4x洗浄する。
  10. 質量測定の場合は、溶液の1/3(〜66°L)を取り、3つのガラスバイアルに分割します。真空オーブンで40°Cで~27mmHgの真空下で一晩乾燥させます。
  11. 濃縮溶液の他の2/3を250°LのPBSに溶かし、さらに使用するまで4°Cで保存します。
  12. FA-CuSのNPを利用する前に、高い設定で浴ソニシエーターで30分間超音波処理します。

2. NP特性評価

  1. 動的光散乱(DLS)を実行し、ステップ1.1.14から2 mLのDI水からPBS溶液に濃縮FA-CuS NPSを10°L追加します。DLSによる特性評価の前に、高い設定で浴ソニシエーターで30分間粒子を超音波処理し、0.2μmの滅菌フィルターを通して残留粉塵を除去します。
  2. 透過型電子顕微鏡(TEM)を行う:PBS溶液に濃縮FA-CuS NPSを10μLをワックス紙に加えます。液滴の上部にあるフォームバー被覆銅グリッドを反転し、2分間座らせます。空気を乾燥させてください。80kVの加速電圧で電子顕微鏡を利用した銅グリッドを画像化する。
    注: FA-CuS NPS 特性評価の一般的な結果を図 1に示します。

3. 細胞培養








  2. figure-protocol-1

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結果

図1Aは、合成されたナノ粒子の典型的なTEM像を示す。典型的なナノ粒子の平均サイズは約8.6nm±2.5nmである。ナノ粒子測定はImageJで行った。閾値および流域機能は、測定のために粒子を分離するために適用された。各粒子の水平および垂直直径は互いに垂直に測定され、さらに平均した。DLS の場合、代表的な測定値を図 1Bに示します。これらの粒子の平均流体力学的直径は73.6nmである。硫化銅ナノ粒子は、図1Cに示すように、NIRに延びる特性吸光度曲線を有する。分光光度計によるレーザーの切り替えによって引き起こされた850 nmの周りのわずかなアーティファクトがあります。

蛍...

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ディスカッション

このプロトコルは、PAFCおよび標的CuS造影剤を利用した卵巣CTCの検出のための簡単な方法である。マイクロ流体デバイス、RT-PCR、および蛍光フローサイトメトリー23、24、25を含む卵巣CTCの検出のための多くの方法が検討されている。これらの範囲の複雑さ、コスト、および精度は、臨床現場での有効性を制限します。PAFCは、患者サンプル内のCTCを検出する機能や、生体内アプリケーションへの変換の容易さなど、CTCの検出に関するこれらの従来の方法に対していくつかの利点を導入しています。PAFCはまた、標的造影剤26、27と組み合わせた場合に、インビトロおよびインビボでCTCを正確に検出することも示されている。

本研究では、FA-CuS NP造影剤が生理学的に関連する濃度でCTC検出...

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開示事項

著者たちは何も開示する必要はない。

謝辞

著者たちは、合成の助けのためにマドレーヌ・ハウエル、フローシステムを設計する彼の助けのためのマシュー・チェスト、およびSolidWorksの支援のためのイーサン・マーシャールを認めたい。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
EDTAコーニング25-053-CL0.025%トリプシン
;m 1,000 mL 真空ろ過ユニットVWR10040-440大量の単次元水のろ過用。
0.2 &マイクロ;m 滅菌シリンジフィルターVWR28145-477
3Dプリントタンクカスタムメイド
のアクイジションカードナショナルインスツルメンツPXIe-5170R250 MS/s、8チャンネル、14ビット
アルコノックスSigma-Aldrich242985-1.8KGガラス製品の洗浄に使用される洗剤。
アミコンウルトラ15遠心フィルターミリポアUFC903024
アミコンウルトラ4遠心フィルターミリポアUFC803024
ブライトライン血球計算計ハウサーサイエンティフィック1492
銅(II) 塩化物アクロス有機206532500
カップリング対物レンズソーラブLMH-10x-532結合するパルス光を光ファイバーに送ります。
カップリングステージニューポートF-91-C1-Tは、パルス光を対物レンズに結合するためのステージです。FP-1AおよびLMH-10x-532
CPXシリーズデジタル超音波洗浄バスFisherbrandModel CPX3800
データ収集ソフトウェアNational InstrumentsNI LabVIEW 2017 (32ビット)LabVIEWレーザーパルスとデータ収集を同期します。
データ処理ソフトウェアMathworksMatlab R2016aMatlabソフトウェアを使用して作成された再構成とグラフ。
FBSSigma-AldrichF2442-500ML
ファイバーチャックニューポートFPH-DJ裸のファイバーを保持するために使用されます。
ファイバーカプラーニューポートFP-1A3軸ステージで、ファイバーチャックと光ファイバーを対物レンズの焦点に位置決めします。
葉酸Sigma-AldrichF7876-10G
Formvar コーティング TEM グリッド電子顕微鏡科学FCF300-CU-SB
Masterflex チューブコール パーマーEW-96420-14
McCoy's 5A 中型ATCC30-2007
Norm-Ject 10 mL シリンジHENKE SASS WOLF4100-X00V0
光ファイバーThorlabsFG550LECサンプルをパルス光にさらすために使用されます。
PBSAlfa AesarJ62036
ペニシリン ストレプトマイシンGIBCO15140-122
パルスレーザーRPMC Lasers IncQuantus-Q1D-1053仕様 1053 nm、8 ns パルス、最大 10 Hz のパルス レーザー光源。
パルサー/レシーバーオリンパス5077PR光音響信号を受信し、フィルタリングし、増幅します。59dBのゲインで動作。
クォーツ キャピラリーチューブサッター インストゥルメントQF150-75-10
RPMI Midum 1640 (1x) 葉酸フリーGibco27016-021
SiliconeMomentive Performance Materials, Inc.GE284
SKOV-3 セルATCCHTB-77
重炭酸ナトリウムSigma-AldrichS5761
炭酸ナトリウムSigma-AldrichS7795-500G
水酸化ナトリウムビーズBDHBDH9292-500G
硫化ナトリウム非水和物Sigma-Aldrich431648-50G
シリンジポンプNew Era Pump Systems IncDUAL-1000
Texas Red-X-Succinimydl エステルInvitrogen1949071
トランスデューサOlynmpusV214-BB-RM超音波検出器、中心周波数 50 MHz、-6 dB フラクショナル帯域幅 82%。
トリパンブルー溶液0.4%アムレスコK940-100ML
トゥイーン20シグマ-アルドリッチP7949-100ML
超音波ゲルカー研究所トランスデューサーカップリング用のAquasonic 100
0.2およびmicroのス を保持し、パー超音波ゲル

参考文献

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