癌細胞に対するマクロファージ貪食活性、具体的には4T1マウス乳腺癌細胞を、本研究で画像化した。生細胞共培養モデルを確立し、蛍光干渉造影造影顕微鏡の組み合わせを用いて観察した。この評価は、イメージングソフトウェアを使用して画像化し、マルチポイントタイムラプスビデオを開発しました。
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この記事について
サマリー
要約
腫瘍関連マクロファージ(AM)は、腫瘍の増殖、浸潤、転移、および癌治療に対する耐性の重要な構成要素として同定されている。しかし、腫瘍関連マクロファージは、腫瘍の微小環境に応じて腫瘍に有害であり、免疫細胞の細胞傷害活性に拮抗するか、または抗腫瘍応答を増強することによって、その表型特性を可逆的に変化させることができる。マクロファージの分子作用と腫瘍細胞との相互作用(例えば、食作用)は広く研究されていない。そこで、腫瘍微小環境における免疫細胞(M1/M2サブタイプTAM)とがん細胞との相互作用は、現在、がん免疫療法研究の焦点になっている。本研究では、誘導M1マクロファージおよびマウス乳腺4T1癌細胞の生細胞共培養モデルを開発し、位相コントラスト、蛍光、および差動干渉コントラスト(DIC)顕微鏡を用いてタイムラプスビデオ機能を用いてマクロファージの貪食活性を評価した。本方法は、食細胞症の多点生細胞イメージングを観察し、文書化することができる。M1マクロファージによる4T1細胞の貪食は、カルボキシフルオレセインコハシニミジルエステル(CFSE)で4T1細胞を染色する前に蛍光顕微鏡を用いて観察することができる。本研究では、マクロファージと腫瘍細胞を単一のイメージング皿で共培養し、M1マクロファージを偏光させ、13時間の共培養中に4T1細胞を巻き込むマクロファージのマルチポイントイベントを記録する方法について説明している。
概要
マクロファージは免疫防御の第一線であり、癌細胞を含む病原体や異物に対する免疫応答を調整する役割を果たしています。彼らは破壊し、体内の不要な粒子を取り除く特殊な食細胞です。マクロファージは、アポトーシス細胞や微生物のクリアランスや他の免疫細胞1の募集などの防御機能に寄与する。マクロファージは、環境信号2に応答して、M1とM2マクロファージの2つの異なるタイプに区別することができます。M1偏光マクロファージ(すなわち、古典的に活性化されたマクロファージ)は、サイトカインインターフェロンγ(IFN-γ)およびリポ多糖(LPS)によって活性化され、炎症反応、病原体クリアランス、効率的な貪食、および腫瘍性免疫3、4に関与する。M2マクロファージは、腫瘍関連マクロファージ(AM)と密接に関連しており、抗炎症および腫瘍促進特性4を有する。
古代ギリシア語(ファゲイン)に由来する食細胞症は、「食べる」(キトス)を意味し、「細胞」を意味し、-osisは「プロセス」5を意味します。食細胞症は、食細胞(マクロファージ、単球、好中球を含む)が病原体を殺して巻き込み、異物を浄化し、アポトーシス細胞....
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プロトコル
注:セクション1-6は、4T1マウス乳腺癌細胞およびRAW 264.7マウスマクロファージの共培養モデルについて説明する。セクション7は、M1マクロファージ貪食4T1細胞のタイムラプス評価について説明する。
1. 4T1マウス乳腺癌細胞およびRAW 264.7マウスマクロファージの培養
- 37°Cの水浴中の穏やかな攪拌または細胞株の正常な増殖温度により、極低温保存4T1およびRAW 264.7通路6細胞のバイアルを解凍する。
メモ:解凍は、約2分以内に迅速に行う必要があります。汚染を避けるため、水浴からバイアルを取り出し、70%のエタノールを吹き付けて除染します。遺伝的ドリフトを避けるために、特にマクロファージのために、低い通路数(すなわち、20未満)を使用する。 - 解凍した細胞を15mL円錐管内の完全DMEM培地の10mLで希釈し、細胞を600 x gで遠心分離して5分間細胞ペレットを得た。
注:10%(v/v)胎児ウシ血清(FBS)、200 U/mLペニシリン/ストレプトマイシン、および2 mM Lグルタミンを添加した完全なDMEM培地がプロトコル全体で使用されます。 - 慎重に培地を吸引し、完全培地の8mLで細胞を再中断し、25cm2組織培養処理フラスコに移す。4T1とRAW264.7の両方の細胞を37°Cで完全なDMEM培地に5%CO2で培養す....
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結果
4T1マウス乳腺癌細胞株の共培養モデルのタイムラプス2次元(2D)画像は、13時間の間にM1マクロファージによって巻き込まれる4T1細胞を示す。免疫染色を行うことによってM1マクロファージの完全な偏光を確保することが重要である。結果(図1)は、100ng/mLリポ多糖(LPS)および20ng/mL IFN-γ偏光RAW 264.7マクロファージの濃度がM1状態であることを示す。標的細胞に蛍光色素で標識し、エフェクター細胞を未染色のままにしておくと、生細胞共培養モデル(ムービー1)が可能になります。13時間及び15分間隔を通して、4T1細胞との共培養におけるM1マクロファージの貪食活性を文書化した(ムービー2)。6つのマルチポイントビデオ(ムービー2のA-F)は、単一の35mmガラス底イメージング皿内の複数のイベントを評価するために記録されました。ムービー3は、M1マクロファージによって貪食された4T1細胞を示す.......
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ディスカッション
記載されたプロトコルは、2つのステップを必要とする:1)4T1マウス乳腺癌細胞およびM1偏光マクロファージの共培養、および2)タイムラプス顕微鏡を用いたマクロファージ貪食活性の評価。生細胞共培養は、食細胞症および遊走アッセイに広く使用されている。ここでの生細胞共培養モデルは、4T1標的細胞の標識に使用される蛍光色素CFSEを利用した、シンプルで適応可能なインビトロ手順(図2)です。これは、生細胞イメージング中の細胞タイプの適切な追跡に使用されます。タイムラプス生細胞イメージングは、13時間の共培養前に多点タイムラプス2Dイメージングを用いてM1マクロファージの貪食活性を評価するために用われた。
生細胞共培養モデルは、4T1マウス乳腺癌細胞およびM1マウスマクロファージを用いて確立された。細胞を互いに区別するために、4T1細胞をCFSE蛍光色素を用いて染色した(セクション4参照)。CFSEは細胞を追跡し、細胞分裂を監視することを可能にする。CFSEは受動的に細胞に拡散することができ、CFSEは標的細胞の貪食を可視化するのに適.......
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開示事項
著者たちは何も開示する必要はない。
謝辞
この作品は、ジェラン・プトラ・ベリムパック(GBP)、大学プトラマレーシア:9542800によって財政的に資金提供されました。アグロバイオテクノロジー研究所、マレーシア(ABI)研究所、顕微鏡画像設備に感謝申し上げたいと思います。この作品の実験ビデオの編集と録画に協力してくれてありがとう。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 抗INOS抗体標識FITC | Miltenyi Biotec | REA982 | 150 µ1 mL カル |
| ボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル (CFSE) | Invitrogen | C1157 | 25 mg |
| DAPI (4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩) | Invitrogen | D1306 | 10 mg |
| DMEM/高グルコース | HyClone | SH30003.04 | 670.0 g |
| ウシ胎児血清 | Tico Europe | FBSEU500 | 500 mL |
| リポ多糖類 | Sigma | L4516-1MG | 1 mg |
| マウス組換えインターフェロン-γ | Stemcell Technologies | 78021 | 100 µg |
| ペニシリン-ストレプトマイシン溶液 | Cellgro | 30-003-CI | 100 mL |
| リン酸緩衝生理食塩水 | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10パック |
| トリプシン EDTA | Cellgro | 25-052-CI | 1X, 100 mL |
| 1000 & micro;L ピペットチップ | WhiteBox | WB-301-01-052 | 5000 チップ/ケース |
| 2 mL 血清学的ピペット | JET BIOFIL | GSP012002 | Non-pryogenic |
| 200 µLピペットチップ | WhiteBox | WB-301-02-302 | 20,000 tps/ケース |
| 25 cm2 細胞培養フラスコ | コーニング | CLS430639 | 組織培養処理 |
| ベンチトップ遠心分離機 | Dynamica | FA15C | モデル:Velocity 14R |
| 生物学的安全性 | Nuaire | NU-565-400 | モデル:ホーム/ LabGard®ES TE NU-565 Class II, Type B2 バイオセーフティ ヒュームフード |
| CO2/エアミキサー | Chamlide (Live Cell Instrument) | FC-R-20 | FC-5 (CO2/Air Mixer) 流量計付 |
| セルスクレーパー | NEST | 710001 | 220 mm |
| CO2 セルインキュベーター | パナソニック | N/A | 型式:MCO-19M(UV) |
| 共焦点顕微鏡 | ニコンインスツルメンツ株式会社 | N/A | ニコン Ti-Eclipse |
| ガラス底皿 | 同上 | 81218-200 | 35mm |
| NIS エレメントソフトウェア | コンインスツルメンツ株式会社 | オンラインダウンロード | |
| ピペットコントローラー | CappAid | PA-100 | CappControllerピペットコントローラー 0.1-100ml |
| サーモスタット | 神鋼 | 生産終了 | JCS-33A 48 x 48 x 96.5mm |
参考文献
- Rostam, H. M., Reynolds, P. M., Alexander, M. R., Gadegaard, N., Ghaemmaghami, A. M. Image based Machine Learning for identification of macrophage subsets. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
- Mantovani, A., Sozzani, S., Locati, M., Allavena, P., Sica, A.
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再版と許可
