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方法論記事

M1マクロファージ-4T1マウス乳腺癌細胞における食細胞活性のタイムラプス2Dイメージング

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DOI：

10.3791/60281

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2019年12月14日

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1Department of Cell and Molecular Biology, Faculty of Biotechnology and Biomolecular Sciences, Universiti Putra Malaysia, 2Institute of Tropical Forestry and Forestry Products (INTROP), Universiti Putra Malaysia, 3Department of Biomedical Science, Faculty of Medicine, University of Malaya, 4Agro-Biotechnology Institute (ABI), National Institute of Biotechnology Malaysia (NIBM)

この記事について

サマリー

癌細胞に対するマクロファージ貪食活性、具体的には4T1マウス乳腺癌細胞を、本研究で画像化した。生細胞共培養モデルを確立し、蛍光干渉造影造影顕微鏡の組み合わせを用いて観察した。この評価は、イメージングソフトウェアを使用して画像化し、マルチポイントタイムラプスビデオを開発しました。

要約

腫瘍関連マクロファージ(AM)は、腫瘍の増殖、浸潤、転移、および癌治療に対する耐性の重要な構成要素として同定されている。しかし、腫瘍関連マクロファージは、腫瘍の微小環境に応じて腫瘍に有害であり、免疫細胞の細胞傷害活性に拮抗するか、または抗腫瘍応答を増強することによって、その表型特性を可逆的に変化させることができる。マクロファージの分子作用と腫瘍細胞との相互作用(例えば、食作用)は広く研究されていない。そこで、腫瘍微小環境における免疫細胞(M1/M2サブタイプTAM)とがん細胞との相互作用は、現在、がん免疫療法研究の焦点になっている。本研究では、誘導M1マクロファージおよびマウス乳腺4T1癌細胞の生細胞共培養モデルを開発し、位相コントラスト、蛍光、および差動干渉コントラスト(DIC)顕微鏡を用いてタイムラプスビデオ機能を用いてマクロファージの貪食活性を評価した。本方法は、食細胞症の多点生細胞イメージングを観察し、文書化することができる。M1マクロファージによる4T1細胞の貪食は、カルボキシフルオレセインコハシニミジルエステル(CFSE)で4T1細胞を染色する前に蛍光顕微鏡を用いて観察することができる。本研究では、マクロファージと腫瘍細胞を単一のイメージング皿で共培養し、M1マクロファージを偏光させ、13時間の共培養中に4T1細胞を巻き込むマクロファージのマルチポイントイベントを記録する方法について説明している。

概要

マクロファージは免疫防御の第一線であり、癌細胞を含む病原体や異物に対する免疫応答を調整する役割を果たしています。彼らは破壊し、体内の不要な粒子を取り除く特殊な食細胞です。マクロファージは、アポトーシス細胞や微生物のクリアランスや他の免疫細胞1の募集などの防御機能に寄与する。マクロファージは、環境信号2に応答して、M1とM2マクロファージの2つの異なるタイプに区別することができます。M1偏光マクロファージ(すなわち、古典的に活性化されたマクロファージ)は、サイトカインインターフェロンγ(IFN-γ)およびリポ多糖(LPS)によって活性化され、炎症反応、病原体クリアランス、効率的な貪食、および腫瘍性免疫3、4に関与する。M2マクロファージは、腫瘍関連マクロファージ(AM)と密接に関連しており、抗炎症および腫瘍促進特性4を有する。

古代ギリシア語(ファゲイン)に由来する食細胞症は、「食べる」(キトス)を意味し、「細胞」を意味し、-osisは「プロセス」5を意味します。食細胞症は、食細胞(マクロファージ、単球、好中球を含む)が病原体を殺して巻き込み、異物を浄化し、アポトーシス細胞破片を除去する受容体媒介性プロセスです。腫瘍関連マクロファージ(AM)は、乳癌を含む異なる腫瘍の間質に見出され、プロ腫瘍機能6、7を有し、食細胞症に対する耐性をもたらす。マクロファージによる腫瘍細胞食作用の詳細なメカニズムはまだ分かっていない。

本研究は、1)4T1マウス乳腺癌細胞とM1偏光マクロファージが共培養され、2)マクロファージの貪食活性を生細胞ビデオ顕微鏡を用いて評価する2段階の方法を提示する。CFSE蛍光色素を用いて、4T1マウス乳腺癌細胞を染色した。染色は4T1細胞にラベルを付け、単一の画像皿内で養成されたM1マクロファージと区別する。RAW 264.7マクロファージは、LPSおよびIFN-γと共極化され、M1表現型に変調される。完全な偏光を確保するために、FITCに共役した抗iNOS抗体を用いた免疫染色を行った。その後、共培養中に食細胞症を含む複数の事象を観察するために、マルチポイントシリーズのタイムラプス画像を取得した。

腫瘍細胞とマクロファージ間の相互作用をよりよく理解することは、潜在的な癌免疫療法につながる可能性があります。生細胞イメージングは、リアルタイムの設定で細胞ダイナミクスの詳細なビューを提供し、神経科学、発生生物学、および創薬における細胞移動、フェノチピックスクリーニング、アポトーシス、および細胞毒性8、9の研究に使用されています。本研究で提案された腫瘍は乳癌であるが、この方法は複数の標的細胞および明確なエフェクター細胞にも適用することができる。

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プロトコル

注:セクション1-6は、4T1マウス乳腺癌細胞およびRAW 264.7マウスマクロファージの共培養モデルについて説明する。セクション7は、M1マクロファージ貪食4T1細胞のタイムラプス評価について説明する。

1. 4T1マウス乳腺癌細胞およびRAW 264.7マウスマクロファージの培養

  1. 37°Cの水浴中の穏やかな攪拌または細胞株の正常な増殖温度により、極低温保存4T1およびRAW 264.7通路6細胞のバイアルを解凍する。
    メモ:解凍は、約2分以内に迅速に行う必要があります。汚染を避けるため、水浴からバイアルを取り出し、70%のエタノールを吹き付けて除染します。遺伝的ドリフトを避けるために、特にマクロファージのために、低い通路数(すなわち、20未満)を使用する。
  2. 解凍した細胞を15mL円錐管内の完全DMEM培地の10mLで希釈し、細胞を600 x gで遠心分離して5分間細胞ペレットを得た。
    注:10%(v/v)胎児ウシ血清(FBS)、200 U/mLペニシリン/ストレプトマイシン、および2 mM Lグルタミンを添加した完全なDMEM培地がプロトコル全体で使用されます。
  3. 慎重に培地を吸引し、完全培地の8mLで細胞を再中断し、25cm2組織培養処理フラスコに移す。4T1とRAW264.7の両方の細胞を37°Cで完全なDMEM培地に5%CO2で培養する。
    注:細胞ペレットを穏やかに再懸濁し、細胞を殺さないようにドロップして培養フラスコドロップに細胞懸濁液を追加します。
  4. 細胞の付着を可能にするために培養の1週間後、フラスコを毎日監視し、必要に応じて完全なDMEM培地の8 mLを追加します。

2. M1偏光RAW 264.7マクロファージの免疫染色

  1. RAW 264.7細胞のコンフルエンスが70−80%に達すると、培養媒体を廃棄し、少なくとも2mLのPBSで2xを穏やかにすす上げます。
    注: RAW 264.7 細胞をシードする前に、細胞の分化が発生していないことを確認してください (つまり、樹状表現型や細胞サイズの増加)。細胞形態の変化が目に見える場合は、培養物を廃棄し、以前の通路バイアルから新しい細胞株を解凍します。
  2. 細胞スクレーパーを使用して付着細胞を穏やかに外し、15 mL円錐形チューブに移すことによって、収集のためのマクロファージを準備します。
  3. ヘモサイトメーターを使用して細胞をカウントし、完全なDMEM培地を使用して1 x 105細胞/皿の細胞懸濁液を調製します。
  4. マクロファージサスペンションのシード2 mLを2つのイメージング皿に入れる。細胞を5%CO2で37°Cで2−3時間インキュベートし、細胞の付着を可能にします。
  5. 完全なDMEM媒体10、11に100 ng/mL LPSおよび20 ng/mL IFN-γを加えることによってM1偏光媒体を準備する。
  6. マクロファージから培養上清を廃棄し、少なくとも1mLのPBSで皿2x内のモノレイヤーを慎重に洗浄する。
  7. イメージング皿の1つに2mLのM1偏光メディアを追加し、RAW 264.7細胞がM1マクロファージ表現型を誘導し、5%CO2で37°Cで2〜3時間インキュベートできるようにします。
    注:抗iNOS抗体染色の制御として10%FBSを補充したDMEMを用いたイメージング皿中の種子RAW 264.7マクロファージ。イメージング皿RAW(対照)およびM1マクロファージ(LPSおよびIFN-γ偏光)にそれぞれラベルを付けます。
  8. 免疫染色の前に、4%パラホルムアルデヒドの2mLを使用してRAW 264.7およびM1マクロファージ細胞を固定し、37°Cで15分間インキュベートします(室温、RT)。
  9. 上清を取り除き、少なくとも3xのPBSで細胞単層を洗浄します。
  10. PBSで塩化アンモニウム50 mLの2mLでクエンチし、RTで15分間インキュベートする。
  11. RTで15分間PBSで0.3%トリトンX-100の2 mLを使用して透過する。
  12. 上清を取り除き、少なくとも3xのPBSで細胞単層を洗浄します。
  13. RT で 30 分間、PBS で 10% FBS の 2 mL を使用してブロックします。
    注:免疫染色におけるブロッキングステップは、細胞内の抗体の非特異的結合を最小限に抑える。
  14. 上清を取り除き、少なくとも3xのPBSで細胞単層を洗浄します。
  15. PBSで2mLの抗iNOS-FITCを、4°Cで一晩FBSを1%でインキュベートします。
    注:製造業者の推奨事項に従って、適切な抗体希釈を使用して細胞にラベルを付けます。この時点からアルミ箔でそれらをカバーすることにより、光から料理を保護します。
  16. 上清を取り除き、少なくとも3xのPBSで細胞単層を洗浄します。
  17. 300 nM 6-ジアミディノ-2-フェニルリンドール(DAPI)の1 mLを、アルミ箔で覆って暗闇の中で、37°で10分間のイメージング皿にインキュベートします。
  18. 少なくとも3xのPBSの1 mLで細胞を洗浄し、イメージング皿に完全なDMEM培地の1 mLを追加します。
    注:細胞は蛍光イメージングの準備ができました。顕微鏡のセットアップは選択された汚れ(この場合はFITCおよびDAPI)のための反転段階および励起フィルターを必要とする。
  19. 顕微鏡の電源を入れ、イメージングソフトウェアをロードします。顕微鏡にイメージング皿を取り付け、RAW 264.7およびM1マクロファージを観察するように焦点を調整します。透過光時間と露光時間を調整して、位相コントラストFITCおよびDAPI画像の外観を最適化します。
    メモ:すべてのポイントにフォーカスがあり、チャンネルが最適化されたら、イメージングを開始します。
  20. 位相コントラスト FITC および DAPI イメージのキャプチャ (図 1)。

3. 4T1マウス乳腺癌細胞の播種

  1. 4T1細胞のコンフルエンシーが70~80%に達すると、培養媒体を廃棄し、少なくとも2mLのPBSで2xを穏やかにすす上げます。1 mL の前温トリプシンを加えて細胞の解剖を解除し、37 °C で最大 20 分間インキュベートします。
    メモ:顕微鏡で細胞を観察してください。デタッチされたセルは丸められます。
  2. 細胞が剥離したら、15 mL円錐形チューブに移し、2 mLの前温DMEM培地を加えてトリプシンを不活性化します。細胞層表面をピネットして媒体を穏やかに分散させ、細胞を回収する。次いで、600xgで5分間遠心分離機を行い、細胞ペレットを得た。
  3. 上清を取り外し、プレミングされた完全なDMEM培地の10 mLでペレットを再サスペンドします。
  4. 組織培養で処理した2つの35mmガラス底イメージング皿のそれぞれで、2mLの完全なDMEM培地でヘモサイトメーターとシード1 x 105 4T1細胞を使用して細胞をカウントします。細胞を5%CO2で37°Cで一晩インキュベートする。
    注:M1偏光媒体とラベル4T1-インデューサー (制御)を用いたイメージング皿の1つに4T1細胞を培養する。これは、インデューサーにさらされたときに4T1細胞の正常な増殖を確実にするためである。

4. CFSE染色を用いた生きた4T1マウス乳腺癌細胞の標識

  1. まず、4T1細胞から既存のメディアを取り出して、皿をイメージングします。1mLのPBSで少なくとも2xの細胞単層を洗浄する。
  2. CFSEを1mLのPBSで希釈することにより、CFSE染色溶液を5μM調製します。各イメージング皿に5μM CFSE染色液を1mL加え、暗闇の中でRTまたは37°Cで20分間細胞をインキュベートします。
    注:最適なCFSE染色濃度を得るために、メーカーの推奨事項と予備実験に従って適切なCFSE作業濃度を使用して細胞にラベルを付けます。CFSEをPBSで希釈すると、ラベリング効率が高くなります。
  3. 10%FBSと染色溶液を含む完全なDMEM培地の等量を細胞に添加して染色をクエンチし、暗闇の中でRTで5分間インキュベートする。
  4. CFSE含有溶液を廃棄し、同じ量の培養媒体で細胞1xを洗浄する。
    注:4T1細胞が蛍光標識されるようになりました。
  5. 4T1-CFSE細胞を5%CO2のRTで標準培養条件に戻します。

5. RAW 264.7マウスマクロファージの播種と4T1との共培養

  1. RAW 264.7のコンフルエンスが70−80%に達すると、培養媒体を廃棄し、少なくとも2mLのPBSで2xを穏やかに洗い流す。
  2. 細胞スクレーパーを使用して付着細胞を穏やかに外し、15 mL円錐形チューブに移すことによって、収集のためのマクロファージを準備します。
  3. ヘモサイトメーターを使用して細胞をカウントし、播種密度に応じて完全なDMEM培地で残りの溶液を希釈することにより、1 x 105細胞/mLの細胞懸濁液を調製します。
    注:共培養中の過度にコンフルエントな細胞は、食細胞症を著しく減少させる可能性があります。本研究では、マクロファージの播種率:癌細胞を1:1比に調整した。比率は、腫瘍細胞の攻撃性およびマクロファージの起源に応じて調整することができる。
  4. 凝置する前に、前日に播種した4T1細胞から培養上清を廃棄し(ステップ4.5)、少なくとも1mLのPBSで単層2xを慎重に洗浄する。
  5. 種子1 x 105 RAW 264.7細胞/2 mL当たりの完全なDMEM培地を4T1イメージング皿の1つに。細胞を5%CO2で37°Cで2−3時間インキュベートし、細胞の付着を可能にします。イメージングディッシュ4T1-M1共培養にラベルを付けます。
    注:4T1(対照)細胞はマクロファージと共培養されなかった。

6. RAW 264.7マクロファージのM1偏光

  1. 10% (v/v) FBS10、11を補完する完全な DMEM 培地に 100 ng/mL LPS および 20 ng/mL IFN-γ を追加してM1偏光メディアを準備します。
  2. 前にインキュベートしたマクロファージから培養上清を廃棄し(ステップ5.5)、少なくとも1mLのPBSで皿2x内のモノレイヤーを慎重に洗浄する。
  3. 次いで、2mLのM1偏光メディアをイメージング皿に添加し、RAW264.7細胞を5%CO2で37°CでインキュベートすることによりM1マクロファージ表現型に誘導することを可能にする。
    注:M1マクロファージ細胞は、完全な偏光を達成するために2−3時間のインキュベーションを要する場合があります。マクロファージの完全な偏光を可能にするために、適切なインキュベーション期間を確保するために予備実験を行う必要があります。

7. 食細胞症の生細胞ビデオ顕微鏡

注:画像露出の最適化、時間測定、自動焦点補正など、生み出し可能なビデオを得るためにライブセルイメージングを行う際には、多くの要因を考慮する必要があります。

  1. 実験の前に、サーモスタットを37°Cでオンにし、5%CO2を供給することにより、細胞培養インキュベーターを設定します。
    メモ:顕微鏡のセットアップには、反転ステージ、ステージトップインキュベーター、湿度制御(95%)、ガスインキュベーションシステムが必要です。このセットアップは、長期生細胞ビデオ顕微鏡評価のための細胞を維持するために重要です。
  2. ピエゾステージを含む顕微鏡をオンにし、顕微鏡イメージングソフトウェアをロードします。
  3. シードコカルチャーセルをステージ中央の35mmガラス底イメージング皿に置き、上部チャンバーにそっとねじ込みます。ジョイスティックを使用して、イメージする位置を選択してステージをモータ化します。
  4. サンプルを表示するには、砲塔の位相コントラストフィルタを選択します。最初にサンプルを表示した後、適切なフィールドを見つけて、サンプルに焦点を合かします。
    注:イメージングソフトウェアは、完全に自動化された客観的選択、パーフェクトフォーカスシステム、タイムラプスシリーズ、マルチチャンネル画像取得、およびマルチポイント画像取得を使用することができます。
  5. CFSEラベリングおよび差動干渉コントラスト集録のマルチチャンネル蛍光を設定するには、イメージングソフトウェア取得ダイアログボックスを開き、[Lambda]タブチェックボックスをオンにします(図2)。
    メモ:13時間のタイムラプスイメージングでは、位相差チャネルを使用する必要があります。
  6. [ラムダ]タブを選択する |[光学構成]を選択し、差動干渉コントラストに[10X DIC]を選択し、緑色蛍光フィルタチェックボックスに[GFP-R]を選択します。[ラムダ] の下 |[フォーカス]欄に、[10X DIC]チェックボックスを選択してフォーカス参照として設定します。
  7. イメージングソフトウェア取得ダイアログボックスを開き、[XYZ時間...]ボタンをクリックし、[XY]タブを選択します。
  8. ライブ画像を確認しながら、電動ステージのジョイスティックを使用して画像取得ポイントに移動するか、接眼時計を介して別の位置を選択します。次に、[ポイント名]列の下にあるチェックボックスをクリックして、イメージキャプチャの各位置の各ポイントを設定します(図3参照)。
    注:自動ステージでは、異なるXY座標のマルチポイント画像取得を可能にし、複数のフィールドをキャプチャできます。
  9. 画面に表示される各サンプルのフォーカスを微調整します。オートフォーカス補正のコントロールを使用します。
  10. ソフトウェアを使用して、タイムラプスイメージキャプチャを設定します。イメージング ソフトウェアの取得ダイアログ ボックスで、[Time]タブを確認します (図 4参照)。
  11. [間隔](ある時点から別の時点までの遅延)と[期間](実験の全時間)を決定します。時間の単位はさまざまであり、ドロップダウン メニューからミリ秒 (ms)、秒 (秒)、分 (m)、または時間 (h) で選択できます。
    注:蛍光およびDICタイムラプス多チャンネル取得のタイムラプスイメージングのイメージング期間の長さは、このアッセイで使用される蛍光色素によって異なる場合があります。標識された細胞があまりにも長く露出している場合、光脱白が起こることがある。
  12. 取得した画像を保存するには、[ファイルに保存]チェックボックスをオンにします。[タイムスケジュール]タブで、[今すぐ実行]ボタンをクリックしてマルチポイント時系列画像を取得します(図5参照)。
    メモ:イメージングソフトウェアでは、イメージはnd2ファイル形式で保存されます。各タイムラプスは、後でMP4ファイル形式で個別に保存することができます。

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結果

4T1マウス乳腺癌細胞株の共培養モデルのタイムラプス2次元(2D)画像は、13時間の間にM1マクロファージによって巻き込まれる4T1細胞を示す。免疫染色を行うことによってM1マクロファージの完全な偏光を確保することが重要である。結果(図1)は、100ng/mLリポ多糖(LPS)および20ng/mL IFN-γ偏光RAW 264.7マクロファージの濃度がM1状態であることを示す。標的細胞に蛍光色素で標識し、エフェクター細胞を未染色のままにしておくと、生細胞共培養モデル(ムービー1)が可能になります。13時間及び15分間隔を通して、4T1細胞との共培養におけるM1マクロファージの貪食活性を文書化した(ムービー2)。6つのマルチポイントビデオ(ムービー2のA-F)は、単一の35mmガラス底イメージング皿内の複数のイベントを評価するために記録されました。ムービー3は、M1マクロファージによって貪食された4T1細胞を示す...

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ディスカッション

記載されたプロトコルは、2つのステップを必要とする:1)4T1マウス乳腺癌細胞およびM1偏光マクロファージの共培養、および2)タイムラプス顕微鏡を用いたマクロファージ貪食活性の評価。生細胞共培養は、食細胞症および遊走アッセイに広く使用されている。ここでの生細胞共培養モデルは、4T1標的細胞の標識に使用される蛍光色素CFSEを利用した、シンプルで適応可能なインビトロ手順(図2)です。これは、生細胞イメージング中の細胞タイプの適切な追跡に使用されます。タイムラプス生細胞イメージングは、13時間の共培養前に多点タイムラプス2Dイメージングを用いてM1マクロファージの貪食活性を評価するために用われた。

生細胞共培養モデルは、4T1マウス乳腺癌細胞およびM1マウスマクロファージを用いて確立された。細胞を互いに区別するために、4T1細胞をCFSE蛍光色素を用いて染色した(セクション4参照)。CFSEは細胞を追跡し、細胞分裂を監視することを可能にする。CFSEは受動的に細胞に拡散することができ、CFSEは標的細胞の貪食を可視化するのに適...

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開示事項

著者たちは何も開示する必要はない。

謝辞

この作品は、ジェラン・プトラ・ベリムパック(GBP)、大学プトラマレーシア:9542800によって財政的に資金提供されました。アグロバイオテクノロジー研究所、マレーシア(ABI)研究所、顕微鏡画像設備に感謝申し上げたいと思います。この作品の実験ビデオの編集と録画に協力してくれてありがとう。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
抗INOS抗体標識FITCMiltenyi BiotecREA982150 µ1 mL カル
ボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル (CFSE)InvitrogenC115725 mg
DAPI (4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩)InvitrogenD130610 mg
DMEM/高グルコースHyCloneSH30003.04670.0 g
ウシ胎児血清Tico EuropeFBSEU500500 mL
リポ多糖類SigmaL4516-1MG1 mg
マウス組換えインターフェロン-γStemcell Technologies78021100 µg
ペニシリン-ストレプトマイシン溶液Cellgro30-003-CI100 mL
リン酸緩衝生理食塩水Sigma-AldrichP5368-10PAK10パック
トリプシン EDTACellgro25-052-CI1X, 100 mL
1000 & micro;L ピペットチップWhiteBoxWB-301-01-0525000 チップ/ケース
2 mL 血清学的ピペットJET BIOFILGSP012002Non-pryogenic
200 µLピペットチップWhiteBoxWB-301-02-30220,000 tps/ケース
25 cm2 細胞培養フラスココーニングCLS430639組織培養処理
ベンチトップ遠心分離機DynamicaFA15Cモデル:Velocity 14R
生物学的安全性NuaireNU-565-400モデル:ホーム/ LabGard®ES TE NU-565 Class II, Type B2 バイオセーフティ ヒュームフード
CO2/エアミキサーChamlide (Live Cell Instrument)FC-R-20FC-5 (CO2/Air Mixer) 流量計付
セルスクレーパーNEST710001220 mm
CO2 セルインキュベーターパナソニックN/A型式:MCO-19M(UV)
共焦点顕微鏡ニコンインスツルメンツ株式会社N/Aニコン Ti-Eclipse
ガラス底皿同上81218-20035mm
NIS エレメントソフトウェアコンインスツルメンツ株式会社オンラインダウンロード
ピペットコントローラーCappAidPA-100CappControllerピペットコントローラー 0.1-100ml
サーモスタット神鋼生産終了JCS-33A 48 x 48 x 96.5mm
に g ドラフト ニ可能

参考文献

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