上皮内蛍光を用いたマウス消化管におけるカンダアルビカンスの可視化

サマリー

このプロトコルの目的は、哺乳動物の消化管におけるカンディダ・アルビカンス細胞の形状および局在を可視化することである。

要約

カンダ・アルビカンスは、ヒトおよび他の多くの哺乳動物における腸内微生物叢の真菌成分である。C.アルビカンスは、ほとんどの植民地化された宿主に症状を引き起こさないが、コンメンサル貯水池は感染症のリポジトリとして機能し、腸内の高真菌力低下剤の存在は炎症性腸疾患に関連している。ここでは、C.アルビカンス細胞形態と局在化を安定した消化管コロニー形成のマウスモデルで可視化する方法について説明する。コロニー形成は、経口抗生物質で治療された動物におけるC.アルビカンスの単回投与を用いて確立される。腸組織のセグメントは、宿主粘膜と同様に、発光内容物(微生物および粘液)のアーキテクチャを維持する方法で固定される。最後に、その中の蛍光は、C.アルビカンスおよびヒファエを染色する真菌rRNAに対するプローブを用いて行われる。このプロトコルの主な利点は、消化管のコロニー形成中にC.アルビカンス細胞形態とその細胞構造と宿主構造との空間的関連を同時に観察できることです。

概要

カンディダ・アルビカンスは、真菌性交腸ならびに日和見ヒト病原体である。この酵母は、定義された環境ニッチを欠き、代わりにヒトおよび他の哺乳^動物1の消化管、皮膚、および泌尿生殖器管内に伝播する。C.アルビカンスに関する初期の研究は主にその毒性の可能性に焦点を当てたが、いくつかの最近の報告は、腸内に交播生物が正常な健康に重要な役割を果たす可能性があることを示唆している。ホスト^2、3、4.哺乳類腸内のC.アルビカンス・コンメンサリズムの調査を容易にするために、安定したGIコロニー形成のマウスモデルと、真菌酵母細胞およびヒファエを可視化するsituハイブリダイゼーション(FISH)ベースの蛍光法を開発した。腸内腔。

いくつかの^例外5を除いて、実験室育ちのマウスは、典型的には消化管の真菌コロニー形成に対する耐性を示す。コロニー形成耐性は、特定の細菌種によって媒介されると考えられている;しかし、これは、^{抗生物質6、7}またはおそらく細菌種^{組成物8、9}を変更する化学的に定義された食事の使用を有する動物の治療によって克服することができる。同様に、ヒトにおいて、広域スペクトル抗生物質の使用は、C.アルビカンスの過剰増殖および播^種10に関連している。私たちのマウスのコロニー形成モデルは、広範囲の抗生物質を使用して、免疫担当のC.アルビカンスコロニー形成を確立し、従来飼育されたマウスを形成します。ペニシリンとストレプトマイシンは、C.アルビカンスの10⁸コロニー形成単位(CFO)を有するガバゲージュの前に1週間、動物の飲料水中に提供される。抗生物質注入水が続く限り、C.アルビカンスはGI管を通って伝播し、10 6−10⁸ CFO/gの便性のテッタに達する。真菌のコロニー形成の高レベルにもかかわらず、動物は健康なままで、感染していないコントロールと同じ速度で体重を増やします。このモデルは、複数のC.アルビカンス・コンメンサリズム^{因子11、12}をスクリーニング^し、特徴付けるために正常に使用されています。

真菌王国の他のメンバーと同様に、C.アルビカンスは巨大な形態形成可塑^性13が可能である。インビトロ条件下では、少なくとも6種類の単細胞酵母細胞型、ならびに多細胞性ヒファおよび偽子宮内の間で遷移することが示されている。酵母からヒプファへの移行は、その最も特徴的な毒性属性の一つであり、ほとんどの哺乳類疾患モデルおよび感染したヒト組織において、ヒファおよび偽ヒファが優勢である。マウス消化管内のC.アルビカンスの局在化と細胞形態を決定するために、固定組織学的セクションで酵母とヒファを染色するFISH技術を開発しました。プローブは、真菌細胞質全体に分布する真菌23SリボソームRNA(rRNA)にハイブリダイズする蛍光標識DNAオリゴヌクレオチドで構成されています。宿主組織は、宿主粘膜、消化器、細菌微生物叢、腸内粘液を含む腸の立体構造を保持する方法で固定されているため、この技術は真菌の局在化を可能にする染色されたとき、これらのランドマークに関して細胞。FISH技術は、周期性アシッドシフ(PAS)やゴモリのメテナミン銀(GMS)などの真菌の伝統的な組織学的汚れと良好に比較し、これらの試薬は特異的ではないので、市販の抗真菌抗体と比較します。C.アルビカンス。さらに、標準的な固定剤は粘液層を除去^し、腸内^腔14、15の他の内容物^を破壊する。

この記事では、マウスGI管の高品位C.アルビカンスコロニー形成、安楽死動物からの消化管の解剖、発光を保持する方法での組織固定のための詳細な指示を提供しますアーキテクチャ、およびFISHを使用して宿主組織内のC.アルビカンスの検出のために。C.アルビカンスの野生型および変異株に加えて、ギャバゲーション技術は、他の微生物を送出するために使用することができる。固定技術は、腸の内容物の保存が望まれる任意の研究に有用であろう。FISHプロシージャは1日以内に完了することができ、複数の微分標識されたプローブを使用して複数の真菌種を局在させるために使用することができる。

プロトコル

以下に説明する手順は、UCSF機関動物管理利用委員会(IACUC)によって承認されています。

1. 口腔ガビ細胞を用いたC.アルビカンスによるマウスの消化管コロニー形成

1. 地元のIACUCの承認を受けて、18-21gの雄または雌のマウス(8-10週齢)にハウジングを提供します。初日からオートクレーブフードと水を使用してください。
   注:殺菌ケージ、寝具、食品、水を使用すると、腸からC.アルビカンを置き換える可能性のある抗生物質耐性環境細菌による汚染のリスクを低減します。また、実験の質問に応じて、マウスはコプロファジーであり、腸の内容物はコハウス動物間で共有されるため、動物の個々のハウジングを考慮する必要があります。
2. 翌日、オートクレーブ飲料水を5%グルコース、1,500 U/mLペニシリンG、および2mg/mLストレプトマイシンを含むオートクレーブ水に交換してください。
3. 便宜上、200x抗生物質ストック溶液(表1)をあらかじめ調製し、殺菌を濾過し、-20°Cで凍結する。
4. 抗生物質で動物を1週間維持する。
   1. 抗生物質が開始された後の3日と6日に、抗生物質耐性好気性細菌による汚染について各動物の便を評価する。片手で動物を保持し、アヌスの近くに上限のないマイクロフュージチューブを置き、少なくとも1つの便ペレットを収集します。
   2. 各フェカルペレットをルリアスープ(LB)、酵母エキスペプトンデキストロース(YEPD)、または脳心臓注入(BHI)と血液寒天プレートの1mLの滅菌水とプレート100°Lで再サスペンドします。37°Cで標準インキュベーター(嫌気性ではない)でプレートを一晩インキュベートし、細菌の増殖を評価します。
      注:プレートは、最小限の成長(0-20コロニー)を示す必要があります。ペニシリンとストレプトマイシンで治療した動物から>20コロニーの細菌が回収された場合、C.アルビカンスによる高レベルのコロニー形成が確立され、実験を中止する可能性は低い。
5. ガベージの3日前に、凍結グリセロール株からYEPD+2%寒天プレートにC.アルビカンスをストリークし、2日間30°Cでインキュベートする。
6. ギャバゲージの1日前に、各C.アルビカンス株の1つのコロニーを接種し、液体YEPDの5 mLに試験する。振とうで一晩30°Cでインキュベートする。
7. ギャヴァージュの朝、C.アルビカンスの飽和培養物を、YEPDを30°Cに前温したYEPDの100mL中0.1の600nm(OD600)の光学密度に希釈する。OD 600が1(中間対対数成長)に達するまで、4時間から5時間の間、30°C_で200 rpmで軌道シェーカーで振ります。
8. 各100 mL培養物を2本の50mL円錐管に移し、室温(RT)で5分間3,000 x gで遠心分離機を送ります。
   注: C. アルビカンスはRT で比較的ゆっくりと伝播します。このプロトコルを別の種に適応させる場合、イノクラは継続的な成長を防ぐために氷の上に保つ必要があるかもしれません。
9. 上清を廃棄し、培養50mL当たり20mLの滅菌生理食塩分でペレット化細胞を再懸濁し、重複した再懸濁ペレットを単一の円錐管にプールする。5分間3,000 x gで遠心分離機。
10. 上清を捨て、滅菌生理食塩分20mLで再サスペンドする。渦を短時間で取り外し、OD₆₀₀測定用に20°Lを除去します。滅菌正常生理食塩水で1:50を希釈する。残りの再懸濁細胞を3,000 x gで5分間遠心分離する。
11. 上清を捨てる。1 x 10⁸ CFUの接種サイズの場合、OD₆₀₀測定から決定された推定濃度に基づいて、ペレット化された細胞を約5 x 10⁸ CfUs/mLに無菌正常生理食塩水中に再スレドします。
    注:典型的には、1のOD₆₀₀は、〜1x 10⁷酵母細胞/mLに相当する。この値は分光光度計によって異なる場合があり、確認する必要があります。異なる微生物との感染に対して濃度の変化が望ましい場合は、動物への不快感を最小限に抑えるために、≤10 μL/gマウスの接種体積を計画します。
12. 1:1,000希釈をヘモサイトメーターでカウントして、接種の濃度を確認します。ヘモサイトメーターを使用して決定された濃度に基づいて、ゲーブされる細胞の体積を調整します。
13. 動物の摂食針(図1A)を使用して、所定の接種物の計算された体積で各動物をギャバゲージする。ゲーバ手順については、手順 1.13.1-1.13.8 を参照してください。
    注:ギャバゲージのトレーニングは、経験豊富な開業医から取得する必要があり、手順は事前に習得する必要があります。単一の動物の正常な手順は、通常1分以上かかります。
    1. オートクレーブされた動物飼育針を1mLの注射器に取り付け、注射器を1つのガベの容積で満たし、不正確な線量を避けるために気泡を除去する。滅菌面に置きます。
    2. 動物を飼育してください。支配的な手で尾の底に動物を保持し、耳のすぐ後ろの緩い皮膚に動物の背中に動物の背中をスライドさせます。
    3. 利き手の人差し指と親指を使用して、緩い皮膚をしっかりと一緒に集めます。これが「スクラップ」です。その擦り傷によって動物をピックアップし、手のひらに対して動物を固定するために尾の周りに同じ(非支配的な)手の小さな指をループ。動物の頭と体(したがって首と食道)が直線になるように、動物の頭をそっと伸ばします。
       注:動物の体が曲がったりねじれたりしている間に気道を試みると、食道穿話や動物の死などの合併症を引き起こす可能性がある。
    4. 利き手で注射器を拾い上げ、曲がった針を下に向けて動物に垂直に保持します(図1B)。針のボールを使って、口の内側の隅をそっと引っ掛け、口の側面に沿ってそっと喉の後ろに針を進め、最後に針を中央に動かします。
       注:横道に沿って針を導入することは、動物の歯や舌からの抵抗を避けるのに役立ちます。
    5. 針のボールが喉の後ろに回ったら、動物の体幹線と平行になるように針を上に傾けます(図1C)。
       注:この時点で、動物はギャグ反射を示します。これは、針が正しく配置されていることを示す良い兆候であり、ギャギングモーションは、食道の下に針を導くのに役立ちます。ギャグ反射がなければ、針は食道ではなく気管にある。針をそっと引き出し、ステップ1.13.1に戻します。
    6. 動物が数ミリメートルしか見えないまで接種を飲み込むことを許可する(図1D)。針を滑らかに進めます。
       注:針が進まない場合は、食道に損傷を与える可能性のある力の使用を避けてください。時には最後の半分センチメートルを進めるには、動物からの特大のギャグが必要になります。針が詰まっているように見える場合は、ゆっくりと取り出し、ステップ1.13.4からやり直してください。
    7. 針のボールが適切な位置(胃)にあるかどうかをテストします。抵抗がない場合は、接種を続けます。接種が行われたら、ゆっくりと針を引き出す。
    8. ケージ内の動物を交換し、5-10分間動物を監視し続け、骨の折れた呼吸や苦痛の兆候がないか。動物がギャージュの直後に正常な活動を再開することを確認します。
    9. 同じ接種が次の動物と一緒に使用される場合は、アルコールワイプで針をきれいにします。ステップ 1.13.1 に戻る。別の接種を使用する場合は、新しい針を使用して、手順 1.13.1 に戻ります。
       注:動物をガヴェージの翌日に検査することが重要です。苦痛の徴候を示す動物(例えば、ハンチンした姿勢、骨の折れた呼吸)は、食道破裂、肺への損傷、または回復が起こりにくい別の内部傷害を受けた可能性が高いので、人道的に安楽死させるべきである。
14. 動物のガベジに続いて、用量検証のためのイノクラのプレート希釈。
    1. 1:10⁵までの10倍のシリアル希釈を準備します。1:10⁵希釈の1つのガベジ体積を、サブラウドデキストロース寒天の100mmプレートにプレートします。
    2. プレートを30°Cで2日間インキュベートします。接種量を確認するためにCFOをカウントします。

2. 組織学のための消化管組織の準備

注:プロトコルのこのセクションは、ヨハンソンと^{ハンソン16}から適応されています。

1. 500mLのメタカーン溶液(60%メタノール、30%クロロホルム、10%氷酢酸)を、解剖した2匹につき大きなスクリューキャッププラスチック瓶に入れて調製します。
   注意:メタノールとクロロホルムは吸入すると有害であり、化学フードで操作する必要があります。氷酢酸は腐食性であり、適切な個人的な保護具で扱われるべきである。メタノール、クロロホルム、氷酢酸は有害廃棄物として廃棄する必要があります。
2. 実験エンドポイントでは、局所IACUCによって承認されたプロトコルに従って動物を人道的に安楽死させる。
   注:抗生物質処理動物では、C.アルビカンスのコロニー形成は、通常、5日目の~106 CFO/gから25日目までに~5 x 10⁷ CfUs/gまでさまたえる。
3. 10%の漂白剤で解剖ツールを殺菌し、70%エタノールですすします。
4. 各動物を解剖面に固定し、腹側を上に向けます。30 G 針を使用して、四肢を解剖面に固定します(図 2A)。70%のエタノールで動物をスプレーして毛皮をきれいにし、工具への付着を最小限に抑えます。
5. 鈍い力を使用して、非利き手で腹部の皮膚のセクションをつまみます。利き手でハサミを使用して、骨盤の基部の近くに皮膚と下層筋膜を切開します。腹腔の両側に沿ってU字形で切開部を延長し、肋骨ケージまで伸ばします。皮膚を邪魔にします。
6. 鉛筆を使用して、評価する GI セグメントのヒストロジーカセットのラベルをあらかじめ付けます。たとえば、動物ごとに、カセットを「胃」、「近位小腸」、「中小腸」、「遠位小腸」、「セカム」、「大腸」と別々にラベルを付けます。各カセットの底部にフォームパッドを置きます(図2A)。
   メモ:図2Bは、カセットに配置する推奨セクションの概要を示しています。
7. 鈍い終わりの鉗子を使用して、腹腔から直腸を穏やかに抽出する。はさみを使用して、卵丘と小腸と大腸の間の接続を切断します。
   注:セカル組織は非常に繊細で破裂しやすいです。操作するときは注意してください。
8. セカム全体を組織学のカセットに入れて、ねじれないようにして平らに置きます(図2C)。上に2つ目の泡パッドを置き、カセットを閉じます。カセットをメタカーンを入れたスクリューキャップの瓶に入れます。
9. カセットよりも長さが短い1-2の便ペレットを含む大腸の一部を切除する。
10. 組織セクションをカセットに入れ、組織を平らにしてねじれたく留め合います。2番目の泡パッドでオーバーレイし、カセットを閉じます。カセットをメタカーンに入れます。
11. サンプリングする小腸の各セクションについて、消化器を含む 1~2 cmのセグメントを切除します。
12. 組織を平らにしてねじれのない状態に保ち、組織学のカセットにセグメントを配置します。2番目の泡パッドでオーバーレイし、カセットを閉じます。カセットをメタカーンに入れます。
13. 胃の場合は、食道と小腸への接続を切断します。カセットに入れ、ティッシュを平らにしてねじれな状態に保ちます。2番目の泡パッドでオーバーレイし、カセットを閉じます。カセットをメタカーンに入れます。
14. カセットをメタカーン溶液に入れたままにして、少なくとも3時間2週間はRTに入れます。
    注:固定 GI セグメントを商用ヒストロジー サービスに転送できるポイントはいくつかあります。これらの組織は、発光内容物の破壊なしに切除することが困難であり、経験豊富な技術者によって最適な結果が得られます。商業サービスがパラフィンに組織を埋め込む前にワッシュを行う意思がある場合、カセットはステップ2.16の指示と共にこの段階で送信することができる。
15. 予熱70°ハイブリダイゼーションオーブンで大きなビーカーですべてのティッシュカセットをカバーするのに十分なパラフィンワックスを溶かし始めます。
16. 固定後、フォームパッドを取り外し、各無傷の組織セクションをカセットに戻します。RTで次の溶液でティッシュを振とうで洗う:100%メタノールで35分に2回、100%エタノールで25分間2回、キシレンで20分間2回。
    注意:キシレンは可燃性で有毒であり、吸入すると損傷を引き起こすことがある。適切な保護と化学フードで使用します。有害廃棄物の手順を介してキシレンを処分します。
17. カセットをペーパータオルで乾かし、ハイブリダイゼーションオーブンで70°Cで2時間、予め溶かしたパラフィンワックスに入れます。カセットがパラフィンで満たされ、気泡が残らないようにします。
    注:このステップはワックスがGIセグメントに浸透し、組織および内容物を安定させることを可能にする。
18. ワックスからカセットを取り出し、余分なワックスを排出させ、ワックスブロックに埋め込まれるまでRTに保管します。微量のキシレンを含むワックスを有害廃棄物として捨てます。
    注:ノーブルラボは、組織の埋め込みと断面化のための商業組織学サービスを使用しています。C.アルビカン酵母およびヒファエの標準的な可視化のために、4μmセクションが使用される。通常は複数の平面を通るハイファルセグメントの接続性を評価するために、8μmの断面を使用できます。FISHプローブが検体に浸透する能力によっては、さらに厚い切片を使用することができる場合があります。

3. 新設計プローブの検証

注:C. アルビカンスプローブを検証するための以下のプロトコルは、スウィジンスキー^ら17から適合した。

1. ストリークC.アルビカンスSC5314および密接に関連するコンパレータ種(例えば、カンジダ・ダブリン症、カンジダ・トロカリシス)にYEPD+2%寒天プレート。30 °Cで1−2日間インキュベートする。
2. 単一コロニーで液体YEPD培地の5mLを接種する。
3. 懸濁した細胞のピペット1mLをマイクロ遠心管に、遠心分離機を3,000xgで5分間廃棄する。
4. リン酸緩衝生理食塩分(PBS)のペレットを100μLで再スペンドします。
5. ピペット5−10 μLの再懸濁された細胞およびガラススライドの上にスポット。より大きな円に広げ、乾燥させます。
   注:細胞が付着していない場合は、ポリ-L-リジンコーティングスライドを使用してください。
6. 細胞スポットをPAPペンで円で囲み、PBSで2.5%パラホルムアルデヒド(PFA)の50°Lで覆います。RTで10分間インキュベートします。
   注意:PFAは可燃性であり、吸入されたり皮膚に接触したりすると健康上の問題を引き起こす可能性があります。PFAで汚染された物品は、有害廃棄物として廃棄する必要があります。
7. PBSで3xを洗います。ペーパータオルに液体をタップし、PBSの100°Lで覆います。2 回繰り返します。最終洗浄を破棄します。
8. 複数日のストレージ用にスライドを準備します。同じ日に FISH を実行する場合は、このセクションの手順を実行せずに手順 3.9 に進みます。
   注:ハイブリダイゼーションをすぐに実行することをお勧めしますが、時間が短い場合は、保存する前にステップ3.8に従ってください。スライドは4 °Cで数日間保存することができます。
   1. 60%のエタノールでスポットをカバーします。RTで3分間インキュベートします。
   2. 80%のエタノールでスポットをカバーします。RTで3分間インキュベートします。
   3. 100%エタノールでスポットをカバーします。RTで3分間インキュベートします。ステップ 3.9 に進みます。
9. ハイブリダイゼーションオーブンで1時間50°Cでスライドを外します。手順3.8に従った場合は、スライドを4°Cに保管してください。そうでない場合は、ステップ 4.2 に進み、ハイブリダイゼーション プロトコルを実行します。

4. GIトラクト組織における魚のスステイン

1. デワックスパラフィン埋め込み組織学的セクション。
   1. ハイブリダイゼーションオーブンで、キシレンで満たされたコプリン瓶を60°Cに前温します。
   2. キシレン入り瓶にスライドを挿入します。60°Cで10分間置き、キシレン洗浄を廃棄します。スライドを瓶に入れ、キシレンを廃棄物容器に注ぎます。
   3. 新鮮なRTキシレンを瓶に注ぎ、60°Cで10分間インキュベートします。
   4. 瓶に100%エタノールを充填し、RTで5分間インキュベートします。
   5. セクション4.2のステップでハイブリダイゼーションオーブンを50°Cに設定します。
2. FISHプローブでC.アルビカンを染色します。
   1. 新鮮なハイブリダイゼーション溶液(20 mM Tris–HCl、pH 7.4、0.9 M NaCl、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム[SDS]、RNaseフリーウォーター中の1%ホルムアミド)を調製します。サンプル計算については、表 1を参照してください。
   2. 50 μLのハイブリダイゼーション溶液を1μLのC.アルビカンスプローブ(5'Cy3-ACAGCAGAAGCCGTCC 3';RNaseフリー水で50μg/mL)と混ぜ合わせ、スライドあたり0.5μgの最終プローブ量を得ます。
      注:多くの実験室育ちのマウスは、微生物叢の中に真菌を含んでいない。この場合、C.アルビカンスだけでなく、ほとんどの真菌種の23S rRNAを認識するパン真菌プローブ(5'CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCtTATTC 3')を置換することができる。著者の経験では、パン真菌プローブは、C.アルビカンス特異的プローブよりも明るい染色を生み出す。
   3. 溶液を光から保護し、50°Cに前暖にします。
   4. PAPペンを使用して、セクション4.1から組織セクションの周りに円を描きます。
   5. ピペット50μLのプローブ含有ハイブリダイゼーション溶液を固定組織上に、ピペットチップで組織部に穏やかに広げた。気泡を防ぐようにハイブリダイゼーションカバースリップで液体をオーバーレイします。
   6. 密封は、水密ハイブリダイゼーションチャンバーでスライドし、ハイブリダイゼーションオーブンで暗闇の中で50°Cで3時間のセクションをインキュベートします。
   7. 一方、FISH洗浄液50mL(20mMトリスHCl、pH 7.4、0.9 M NaCl、RNaseフリー水)を調製します。サンプル計算については、表 1を参照してください。
   8. 洗浄液を50°Cに動かして前温を下ろします。
   9. 3時間後、コプリン瓶に洗浄液を加える。次に、鉗子でスライドからカバースリップを慎重に取り外し、スライドを洗浄液に入れます。
   10. 瓶をアルミホイルで覆い、50°Cで20分間インキュベートします。
   11. このインキュベーション中に、ムチン核染色溶液(20ng/mL 4',6-ジアミディノ-2-フェニリンドール[DAPI]、1.6μg/mLフルオレセインイソチオシアネート[FITC]レクチン)を調製する。サンプル計算については、表 1を参照してください。胃および大腸の場合は、FITC-ウレックスエウロパエウス凝集1(UEA-1)を使用してください。小腸と精液の場合は、FITC-UEA-1 と FITC-小麦胚芽凝集体 (WGA) を組み合わせて使用します。
       注:異なる種のレクチンは、ムチンなどの糖タンパク質の異なる糖修飾を認識します。ここで推奨されるレクチンの組み合わせは、異なるGIコンパートメントにおける粘液の最適な染色のために経験的に決定された。
   12. FISH洗浄液を注ぎ、瓶にRT PBSを詰め込んでスライドを洗います。すぐにPBSを注ぎ、PBSで補充します。合計2つのワッシュのためにPBSを注ぎます。
   13. 繊細なタスクワイパーティッシュでPBSを取り除き、PAPペンで腸組織セクションを円で囲みます。スライドを不透明なプラスチック容器に入れ、50μLのムチン核染色液を組織部に加えます。光から保護するためにアルミ箔で容器を覆います。4°Cで45分間インキュベートする。
   14. コプリン瓶にスライドを置き、RTでPBSで素早く2回洗います。
   15. ペーパータオルで余分なPBSをタップし、組織でPBSの最終的な滴を拭き取ります。
   16. 各セクションに取り付け媒体の1滴を置き、ガラスカバースリップでオーバーレイし、気泡を防ぎます。取り付け媒体をカバースリップ全体の下に広げます。即時イメージングのために、カバースリップをコーナーにマニキュアで固定します。長期保存の場合は、カバースリップの周りにマニキュアでシールします。
   17. 蛍光顕微鏡を用いてスライドを画像化します。

結果

提供された指示に従って、この技術の結果は、宿主上皮、粘液、および断面GI組織におけるC.アルビカンスにおける核の蛍光標識であろう。野生型カンジダ・アルビカンス細胞は、円形、単細胞酵母細胞または高度に細長い細胞、時には分岐、多細胞性ヒファエ(細胞細胞分裂は、子宮内では明らかされない)として現れるべきである。C.アルビカンスの変異体は、さらに、より小さく、わずかに細長い「灰色」酵母として、またはより大きく、わずかに細長い「GUT」(消化管誘発転移)または「不透明」酵母として現れる。

図1は、口腔の移動に使用される給餌針と、移動手順中の針の重要な位置を示しています。図 2は、臓器解剖とマウスの GI セグメントの外観に使用される一般的なセットアップを示しています。

図3は、インビトロおよびマウスモデル内の伝播後の異なるC.アルビカンス細胞型のFISH染色を示す。図3Aは、固定、透過、インビトロ伝播ヒファの蛍光および相画像を示す。ハイファ形成は、液体リーの^培地18を2%N-アセチルグルコサミンで誘導し、pHは37°Cで誘発した。図3Bは、固定、透過、インビトロ伝播酵母細胞の蛍光および相画像を示す。図3C,Dは、それぞれ固定、透過、インビトロ伝播性GUT細胞および不透明細胞を示す。GUTおよび不透明な細胞型は、走査型電子顕微鏡で可視化した場合を除き、形態学的に区別がつかない。インビトロ伝播細胞のFISH染色は、細胞が十分に透過していない場合、最適ではないことに注意してください。弱い染色と拡散染色の例を図3Cに示す。最良の結果を得るには、細胞固定および透過条件を調査する細胞の種類および種ごとに経験的に決定されるべきである。幸いなことに、断面組織のC.アルビカンを視覚化するための推奨プロトコルは、より一貫した透過を生成します。

図3E-Gは、マウス大腸におけるC.アルビカンスを、C.アルビカンス特異的プローブ(図3E)またはパンファンガルプローブで染色した(図3FF,G)を示す。これらの画像では、C.アルビカンスは赤色で表示され、宿主細胞核は青色で、粘液層は緑色です。丸い酵母と非常に細長いヒファ(白い矢印)の両方が大腸で発生します。パンフンガルプローブでは染色が明るくなりますのでご注意ください。図3Gは、同じコンパートメント内のume6変異体を示し、パン真菌プローブで染色した.Ume6は、インビトロ条件下でのヒファ形成に必要な転写因子をコード^する19.興味深いことに、この変異体によって表示される酵母ロックされた表現型は、腸内で再現されず、宿^主12内で冗長因子を活性化しなければならないことを示唆している。図4は、マウス粘膜に直隣接する領域および腸内腔のより中央領域を含む、マウスGI管の異なるセグメントにおける野生型C.アルビカンスの出現を示す。

図1:ギャバージ中の主要な給餌針位置。(A) 給餌針。(B) 舌の側面に挿入された針ボールを供給する。(C) 食道に挿入して直立位置に針を供給する。(D) 鼻の上に数ミリのミリメートルが見える胃に挿入された給餌針。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 2: 解剖レイアウトの例(A)解剖パッドとツール。(B) 物品化された GI 管。遠位(肛門)切片への近位(食道):I.胃。II. 近位小腸.III. 小腸の内側。IV. 遠位小腸V. セカムVI. 大腸。ピンクの破線の境界線ボックスは、固定する組織を示します。(C) カセットに配置された組織。ローマ数字はパネルBと同じです。

図3:2%N-アセチルグルコサミン、pH6.8を有する液体リーの^媒体18で成長したC.アルビカンスヒファエのFISHの代表的な画像。(B)YEPD+2%寒天プレート上で増殖したC.アルビカンス丸酵母細胞のFISH。(C)C.アルビカンスGUT細胞(ySN1045)のFISHは、YEPD+2%寒天プレート上で増殖した。(D)YEPD +2%寒天プレート上で増殖したC.アルビカンス不透明細胞のFISH。(E)大腸における野生型C.アルビカンス(ySN250)を、C.アルビカンス特異的プローブで染色した。(F)大腸における野生型C.アルビカンスを、パン真菌プローブで染色した。(G)大腸におけるUme6変異体(ySN1479)は、パンフンガルプローブで染色された:赤はC.アルビカンス、青は宿主上皮核、緑はムチンである。矢印はヒファエを示す。矢印は酵母を示す。スケールバー = 20 μm. Images F および G はウィッチリーら¹²から適合しています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図4:異なる腸コンパートメントにおけるFISH染色C.アルビカンの外観野生型C.アルビカンスは、マウスGI管の示されたセグメントに示されている。各コンパートメント内では、画像は、宿主粘膜と腸内腔の中央領域に隣接する領域を示しています。染色はパンファンガルプローブで行った。スケールバー = 20 μm. 画像はウィッチリー^ら12から適応されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

抗生物質ストック(200x)
ペニシリンG	181 mg/mL
ストレプトマイシン	400 mg/μL
メタカーン
株式	最終濃度	ボリューム	単位
メタノール	60%	300	Ml
クロロホルム	30%	150	Ml
氷酢酸	10%	50	Ml
ハイブリダイゼーションソリューション
株式	最終濃度	ボリューム	単位
1 M トリス-HCl, pH 7.4	20 mM	20	Μ l
5 M ナCl	0.9メートル	180	Μ l
10% SDS	0.10%	10	Μ l
100% ホルムアミド	1.00%	10	μL (使用間の -20 °C で小さなアリコートに保持)
ルナセフリーウォーター		780	Μ l
FISH洗浄液
1 M トリス-HCl, pH 7.4	20 mM	1	Ml
5 M ナCl	0.9メートル	9	Ml
ルナセフリーウォーター		40	Ml
ムチン核染色液
DAPI、10 μg/mL	20 ng/mL	2	Μ l
レクチン, 40 μg/mL	1.6 μg/mL	40	Μ l
PBS、 pH 7.4		958	Μ l

表 1: このプロトコルで使用される一般的な量とソリューションの濃度。

ディスカッション

ここで説明する方法は、任意の性別または株の構成コロニー化マウスのGI管におけるC.アルビカンス酵母およびヒファエの可視化を可能にする。FISHプローブは、真菌細胞質全体に分布する23S rRNAにハイブリダイズします。我々の方法は、腸内^細菌20を可視化するための以前に報告されたプロトコルから適合した。C.アルビカンスは宿主内の形態を変化するので、真菌細胞の形状と局在化を監視する方法が有用である。例えば、この方法を用いて、酵母が消化管全体を支配するという仮説を否定し、特定の「フィラメント欠陥」変異^体12のインビボとインビトロ表現型との間の不一致を露呈した。

C. アルビカンス共罰のマウスモデルがいくつか存在する。実験室マウスとヒトの微生物叢は異なっており、マウスでは、安定したコロニー形成を確立するために抗生物質または専門的な食事の使用が必要である。抗生物質による治療はまた、ヒトのC.アルビカンスの植民地化を増強し、播種^性疾患10の主要な危険因子である。この研究で使用される抗生物質は比較的安価であり、細菌微生物叢の信頼性の高い減少をもたらす。抗生物質は、動物からすべての細菌を排除するのではなく、拮抗細菌種の負担を軽減するために使用されることに注意してください。研究者が細菌の不在時にC.アルビカンス-宿主相互作用を研究したい場合、または抗生物質や特別な食事の使用を避けるために、生殖不能動物は、従来の飼育動物の代わりにすることができます。しかし、グノトビオティックマウスは、特定の免疫および解剖学的異常を示すため、すべての目的に適しているとは言えない。

FISH染色を成功させるためには、いくつかのステップが重要です:推奨される固定方法は、GI組織の構造的完全性、特に粘液層や三次元などの腸内腔の脆弱な内容物を維持するために重要です。真菌および細菌の組織¹⁶.水を含む多くの一般的に使用される固定ソリューションは、発光アーキテクチャに大きな損害を与があることに注意してください。このプロトコルで推奨される固定後のワッシュの固定剤とソリューションには水が含まれていないため、水による汚染を避けることは重要です。もう一つの重要なステップは、ハイブリダイゼーションオーブン内のスライドのインキュベーション中にハイブリダイゼーション溶液の蒸発を避けるために重要であるハイブリダイゼーションステップです。この問題を回避するために、スライドを防水容器に入れることをお勧めします。あるいは、マイクロアレイのハイブリダイゼーションに最初に使用されるような水密ハイブリダイゼーションチャンバーを使用することもできる。

C. アルビカンス特異的 FISH プローブは、このプロトコルで説明されています。しかしながら、多くの実験室飼育マウスは天然腸内微生物叢の一部としてC.アルビカンスまたは他の真菌を含まないので、パン真菌プローブは実験的に植民地化された動物においてC.アルビカンを特異的に染色し得る。パン真菌プローブの置換は、その優れたハイブリダイゼーション特性と高い信号対雑音比のために望ましいかもしれません。パン真菌プローブがC.アルビカンスの擬似特異的プローブとして使用される場合、未感染動物(すなわち、抗生物質で治療されるがC.アルビカンスではない)における染色の欠如を文書化することが重要である。非コロニー化対照動物の染色は、食品微粒子へのFISHプローブの付着に起因する可能性のある背景染色を評価するのにも有用である。全体的に、FISHプローブの使用は、カルコフルオ白(キチンを染色する、細胞タイプによって異なる可能性がある細胞壁成分)、GMS、または市販の抗真菌抗体などの真菌を染色する他のほとんどの方法よりも高い特異性を提供します。さらに、FISH染色は、種特異的rRNAに微分標識されたFISHプローブを使用して、複数の生物のコイニングを可能にします。

この技術の1つの注意点は、特定のC.アルビカンス酵母細胞タイプがFISH(例えば、不透明およびGUT細胞タイプ)によって非常によく似ているように見えることである。これらの細胞型を区別するために、細胞型特異的真菌mRNAにハイブリダイゼーションプローブを開発することが有用であろう。それにもかかわらず、現在の形態では、FISH技術はすでに、両方の^条件12で評価されたC.アルビカンス変異体のインビボとインビトロ挙動との間の驚くべき相違を明らかにし、における複雑な相互作用を示す。既存のインビトロアッセイによって十分に模倣されていない自然な一般環境。追加の野生型および変異型宿主における異なるC.アルビカンス染色のさらなる研究は、真菌宿主相互作用にさらなる洞察をもたらす可能性が高い。特に、^ヒト21におけるC.アルビカンスの高力力に関連する炎症性腸疾患のモデル、およびC.アルビカンスの過剰増殖および疾患の他のモデルにおいてC.アルビカンスをプロファイルすることが有益であろう。FISH技術はまた、特定の宿主細胞を染色するために免疫ヒスト化学と組み合わせてもよい。全体的に、ここで提示される方法は、哺乳動物GI管内のC.アルビカンの局在および形態を決定するための合理的に迅速かつ信頼性の高い手段を提供する。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1mLシリンジ	BD	309659	はどのベンダーからでも代用可能
BHI血液寒天			は、どのベンダーからでも代用可能
C. albicans FISHプローブ	IDT DNAテクノロジー	ズ カスタムオーダー
ハイブリダイゼーション用チャンバー インキュ			蒸発を減らすための水密チャンバー
クロロホルム	シグマ	C2432	>=99.5%
DAPI	ロシュ	10236276001	どのベンダーからでも代用可能
デリケートなタスクワイパー組織	キンバリー・クラーク	34256CT	キムワイプ
D-グルコース	シグマ	G7021-5KG	は、どのベンダーからでも代用可能
エタノール	シグマ	E7023	分子生物学グレード
給餌針	ケイデンス株式会社	7910	金属; 20 X1-1/2" W/2-1/4; オートクレーブ滅菌可能
FITC-UEA-1	Sigma	L9006-1MG	その他の蛍光色素が利用可能
FITC-WGA	Sigma	L4895-2MG	その他の蛍光色素が利用可能
フォームパッド	フィッシャー	22038221	カセット内に収まるフォームパッドを注文
ホルムアミド	Sigma	47671	分子生物学グレード
氷酢酸	マクロンファインケミカル	MK881746	ACS試薬、>= 99.5%
ガラスコプリンジャー	ッシャー08-815		、背中合わせに最大10スライドを保持します
組織学カセット	Simport	M512	盲腸が押しつぶされないように深いカセット
ハイブリダイゼーションカバースリップ	シグマ	GBL712222	RNaseフリー
ハイブリダイゼーションオーブン			任意のベンダーから置換可能
LB
Leeらの1975
Methanol	Sigma	179337	ACS試薬、>=99.8%
マウス	Charles River Laboratories	028	成人BALB/c、18-21グラム(8-10週間)
パラホルムアルデヒド	フィ	ッシャー50-980-487	16%溶液
パラフィンワックス	シグマ	P3558-1KG	パラプラストPBSを埋め込む組織用
pH 7.4	UCSF細胞培養施設 培地生産ユニット	CCFAL003	カルシウム、マグネシウムフリー、任意のベンダーから代用できます
ニシリンG	シグマ	PENNA-100MU
サブローデキストロース寒天			任意のベンダーから代替
生理食塩水	バクスター	2F7123	滅菌、任意のベンダーから代替可能
塩化ナトリウム (NaCl)	Σ	S3014	任意のベンダーから代替可能; RNase-フリー
ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)	Σ	L3771	任意のベンダーから代替可能; RNase-free
ストレプトマイシン	Σ	S9137-100G
スーパーPAPペン	ライフ	テクノロジー8899	は、任意のベンダーから置き換えることができます
Tris-HCl	シグマ	T3253	は、任意のベンダーから置き換えることができます;RNaseフリーを維持する
Vectashield	研究所	H-1000	は、DAPI
キシレン	シグ	マ214736	試薬グレード
YEPD			を含まないことができます任意のベンダーから代替