5つの脊椎動物群にわたる中枢神経系微小血管の信頼性の高い絶縁

サマリー

このプロトコルの目的は、リッセンセファリックおよびギレンセファリック脊椎動物の中枢神経系の複数の領域から微小血管を分離することです。

要約

中枢神経系(CNS)からの微小血管の単離は、一般的に、複数の動物、最も頻繁にげっ歯類からの皮質組織を組み合わせることによって行われる。このアプローチは、血液脳関門(BBB)特性の尋問を皮質に制限し、個々の比較を可能にしません。このプロジェクトは、皮質、小脳、視床下部、下垂体、脳幹、脊髄など、複数のCNS領域からの神経血管ユニット(NVU)の比較を可能にする単離方法の開発に焦点を当てています。さらに、もともとマウスサンプル用に開発されたこのプロトコルは、脳半球白物から微小血管を分離することができる小さな大きな脊椎動物種のCNS組織での使用に適応することに成功しました。この方法は、免疫標識と組み合わせると、タンパク質発現の定量と個体、組織型、または治療間の統計的比較を可能にする。神経炎症性疾患、多発性硬化症のマウスモデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)におけるタンパク質発現の変化を評価することで、この応用性を証明した。さらに、この方法で隔離されたマイクロ容器は、qPCR、RNA-seq、ウェスタンブロットなどの下流アプリケーションに使用できます。これは、超遠心分離または酵素解離を使用せずにCNSマイクロ容器を分離する最初の試みではありませんが、単一の個人と複数のCNS領域の比較に対するその熟達性においてユニークです。したがって、CNS部分(皮質、小脳、視葉、脳幹、視床下部、下垂体、脊髄)、CNS組織型(灰色または白色物質)、個体、実験的治療群、および種。

概要

私たちの脳は、私たちの体の中で最も重要な器官です。このため、正常からの逸脱を引き起こす可能性のある外的要因にもかかわらず、脳恒常性を維持することが優先事項である。一部の学者によると、約4億〜5億年前^の1、脊椎動物は、私たちが今血液脳関門(BBB)2、3として知っているものを開発しました。この保護「フェンス」は、血液とCNSパレンチマ間のイオン、分子、細胞の輸送を厳密に調節することにより、中枢神経系(CNS)恒常性および機能に最も大きな影響を及ぼします。BBBが破壊されると、脳は毒性暴露、感染、炎症を受けやすくなります。したがって、BBB機能障害は、すべてではないにしても、神経学的および神経発達障害^4、5、6に関連している。

BBBの高度な機能は、神経血管ユニット(NVU)2、3によって適合されたユニークなCNS微小血管系に起因する。高度に専門化された内皮細胞、ペリサイト、および星値状端足は、NVU^2、3の細胞成分である。これらの細胞によって生成される細胞外マトリックスは、NVUおよびBBB生理学^2、3にも不可欠である。NVUの必須細胞成分および分子成分は脊椎動物の間で保存されるが、異質性は、秩序および種^7、8の間で報告される。しかし、技術的な制限は、神経生物学、生物医学、または翻訳研究におけるこれらの違いを十分に考慮する能力を妨げる。

このため、CNS領域特異的なマイクロ血管分離法を拡充し、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類の5つの脊椎動物群から多数の種に適用できるようにしました。このプロトコルは、小リッセンセファリックおよび大ギレンセファリック脊椎動物に使用するために記載されており、翻訳関連性⁹を有する種を含む。さらに、我々は、この文脈内で以前に調査されていないCNSの他の領域が含まれていますが、神経生理学に関連し、驚異的な臨床的意味を持つ:視床下部、下垂体、および白色物質。最後に、NVUおよび/またはBBB^9、10、11に沿ったタンパク質発現の変化を同定するための信頼できるツールとして^、この単離方法^の容量を試験した。概念実証として、EAE中のVCAM-1およびJAM-B発現の変化を、免疫蛍光に続いて単離法を用いて決定する方法を示した。

プロトコル

本研究のすべての手順は、カリフォルニア大学(UC)、デイビス制度動物ケア・使用委員会(IACUC)が定めたガイドラインに従っています。UCデイビスの動物ケアは、いくつかの独立したリソースによって規制されており、1966年以来、ラボアニマルケアインターナショナル(AAALAC)の評価と認定のための協会によって完全に認定されています。豚CNS組織は、食肉科学研究所動物科学UCD学科から得られました。レセウス・マカクのCNS組織は、カリフォルニア国立霊長類研究センター病理部(NIH P51OD011107)から得られた。麻酔、安楽死、または壊死は、豚やマカクの実験室スタッフによって行われませんでした。したがって、これらの問題に関する特定の推奨事項はありません。

注:この方法は、複数の種のために検証されましたが、提供されたプロトコルは、マウスとブタの組織により直接的に対応しています。哺乳動物標本を使用する場合、光学ローブに関する詳細は適用されません。すべてのバイオ危険物は、適切なバイオセーフティレベル(BSL)施設で取り扱う必要があります。すべての急性毒性材料は、ヒュームフードの下で処理する必要があります。すべての生体有害な医療廃棄物および急性毒性廃棄物は、適切に処分されなければならない。

1. 準備

1. 少なくとも1日前に解決策(表1)を準備します。
   注:70 kDa分子量(MW)デキストランを溶解することは非常に困難です。パラフィンフィルムまたは箔のいずれかで覆われた溶液を一晩攪拌させる方が効率的です。プロトコルは、調査中の標本に応じて2つの異なるMV-2ソリューションを使用する必要があります。18%デキストランは、小さなリッセンセファリック標本に対してプロトコルを実行する際に、ミエリンをマイクロ容器ペレットから効率的に分離します。しかし、それは大きなギレンセファリック標本からのCNS組織の界面内でミエリンのスミアを開発するだけでなく、小さな標本から視床下部と下垂体。このスミアは20%デキストランを使用して防止されます。
2. ポリD-リジンのウェルあたり50°Lをロードして十分なスライドを準備し、室温(RT)で2時間乾燥させ、好ましくは生物学的安全キャビネットクラス2(BSC-2)で乾燥させます。過乾燥しないでください。リン酸緩衝生理食塩分(PBS)で2回すすいで、使用できるまで冷蔵庫に保管してください。

2. 小さなリッセンセファリック脊椎動物標本からのCNS組織解剖

注:この記事では、C57BL6/J、10週齢、〜25g、オスマウスにプロトコルを適用する方法を示します。

1. 15 mL円錐形チューブ2本と1.7mLマイクロ遠心管をそれぞれ5mLと1mLで調製し、検体1個あたりMV-1溶液を用意します。チューブは氷の上に置いておきなさい。
2. 麻酔
   1. ケタミン、キシラジン、アセプロマジン麻酔カクテルを体重1kg当たり100/10/3mgで腹腔内注射し、70%エタノールでスプレーすることにより、マウスを麻酔する。眼に触れ、足をつまむことで、手のひらとペダル反射の欠如を評価して麻酔を確認する。
   2. 誘導麻酔ボックスを用いて5%のイソフルランを吸入してハトを麻酔する。
   3. 魚を保持する水タンクまたは両生類リンガーの溶液(材料の表)のいずれかで1%トリカインで魚やカエルを麻酔します。
   4. 安楽死前に4°Cで冷却することにより、トカゲを麻酔する。
3. 外科的はさみで動物を切断し、頭蓋骨を露出させるために鉗子で皮膚を剥がし、ラグランジュは、マグナムを通してラグランジュハサミでカットする(図1A)。
4. ヘラで脳を解剖し、MV-1溶液で15 mL円錐管に移す。チューブは氷の上に置いておきなさい。
5. 鉗子で頭蓋骨のセラ・トゥルシカから下垂体を取り出し、MV-1溶液で1.7 mLマイクロ遠心管に移す。チューブは氷の上に置いておきなさい。
6. 皮膚と筋肉を取り除き、椎骨柱を露出させます。手足、肋骨ケージ、内臓を切り取ります(図1B)。
7. 後述する2つの方法のうちの1つによって脊髄を解剖する。次いで、MV-1溶液で5mL円錐管に移す。チューブは氷の上に置いておきなさい。
   1. 腰部コードに達するまで、頸椎の脊椎動物を通して始まるラグランジュはさみで、ラルストラルを切ってコード方向に切断してラミネクトーミーを行う。
   2. 18 G針と10 mLシリンジをMV-1溶液でロードした腰椎椎骨のフォルメン全体のロストラル方向にラウダルでフラッシュを行います(図1C,D)。
      注:この方法は、非常に小さな標本、主にげっ歯類(<100 g)でのみ動作します。
8. 解剖スコープを使用して、脊髄から硬膜嚢をスプリングハサミで切り取り、残りの髄膜を二重ピックで取り除きます(図2)。
9. 脳をペトリ皿に移し、解剖スコープを使用して、二重ピックで髄を取り除きます(図2A-C)。
10. 嗅球と視床を鉗子、虹彩はさみ、春はさみで切除します。二重のピックを使用して、すべての脳心室からコロイド神経叢を取り除く。すべてのコロイド神経叢を取り除くようにしてください。
    注:コロイド神経叢と嗅球は、汚染の大規模な源です。BBBとは対照的に、これらの毛細血管は非常にフェネストレートされ、その後の実験の結果は除去されないと損なわれます。
11. 鉗子を使用して、明確なCNS領域を分離する:皮質、小脳、脳幹、視葉(哺乳類標本ではない)、および視床下部。

3. 大きなギレンセファリック脊椎動物標本からのCNS組織解剖

注:このプロトコルは、アバトワールから得られた豚CNS組織を使用しています。したがって、麻酔、安楽死、または壊死は、ここで説明または示されていません。

1. 氷の箱/バケツの中にMV-1溶液を積んだ0.946 L(32オンス)組織学の容器の輸送ブタCNS組織。
2. 解剖スコープを使用して、各CNS組織から二重ピック、鉗子、虹彩はさみ、およびスプリングハサミで髄を取り除きます。脳心室からコロイド神経叢を取り除くようにしてください。

4. CNS組織均質化

注:2人の研究者が均質化プロセスに従事する場合、1つはステレオスコープの下で髄質を解剖し、もう1つはミンチ組織を均質化する場合に効率的です。このようにして、組織はすぐに氷のバケツに戻され、冷たく保たれます。

1. 各CNS領域をMV-1溶液の約1mLのペトリ皿に置きます。シングルエッジブレードを使用して、組織をミンチして1~2mmの部分を得ます。
   1. 小さな脊椎動物の標本の場合は、100 mm x 20 mmのペトリ皿を使用します。
   2. 大きな脊椎動物の標本の場合は、150 mm x 15 mmのペトリ皿を使用してください。
2. 小さい脊椎動物標本の均質化 (表2および表3)
   1. コルテックス、小脳、脳幹、視ローブ、脊髄を、転写ピペットを用いてPTFE害虫を用いて個々の10 mLポッター・エルベヘムガラス組織グラインダーでMV-1溶液の〜1 mLに移す。5 mL の MV-1 溶液を追加し、各組織を均質化します (約 10 ストローク).。個々の15 mL円錐管に移す。チューブは氷の上に置いておきなさい。
      注:小さな脊椎動物の場合、5または4、光学ローブの有無にかかわらず、それぞれ10 mLポッター-エルベヘムグラインダーと15 mL円錐チューブが必要です。
   2. 鉗子を含む視床下部と下垂体を個々の1.7 mLチューブで約100μLのMV-1溶液に移し、ガラスミクロペストルで慎重に均質化します。MV-1溶液の〜1 mLで各ミクロペスをすすいでください。チューブは氷の上に置いておきなさい。
      メモ:小さな脊椎動物の場合、ガラスミクロペス2個と1.7mLチューブが必要です。
3. 大きな脊椎動物標本の均質化 (表4及び表5)
   1. 転写ピペットを使用して、55 mLポッター-エルベヘムガラス組織グラインダーにPTFE害虫でミンチ組織を移し、頭上の攪拌機に取り付けます。MV-1溶液の推奨体積の半分を、均質化される特定のCNS部分に従って加える(表5)。
   2. オーバーヘッドスターラーを非常に低速(約150rpm)でオンにし、ガラス管を約30s上下に慎重に動かします。
   3. オーバーヘッドスターラーをオフにし、さらにMV-1溶液を追加し、均質なスラリーが得られるまでステップ4.3.2を繰り返します。
   4. 50 mL円錐形チューブに移します。チューブは氷の上に置いておきなさい。
   5. 各CNS組織均質化の間に脱イオン水で粉砕機を洗浄します。
      注:大きな脊椎動物5または4の場合、それぞれ白物の有無にかかわらず、50 mLの円錐管が必要です。同様に、視床下部および下垂体には2本の(2)15mL円錐管が必要である。

5. マイクロ容器の精製

1. ステップ4.2.1、4.2.2、または4.3.4で2,000 x gで得られた遠心分離組織ホモジを4°Cで10分間行う。ミエリンの大きな白い界面は、赤みを帯びたマイクロ容器のペレットの上に形成されます。上清を捨てる。
   1. 小脊椎動物標本(表2及び表3)
      1. 皮質、小脳、脳幹、視ローブ、脊髄ペレットを5mLの血清学的ピペット(〜10フラッシュ)で氷冷MV-2溶液の5mLで再中断する。各サスペンションに5mLの氷冷MV-2溶液を加え、チューブをひっくり返して慎重に混ぜます。
      2. 視床下部と下垂体ペレットを1mLのMV-2溶液で再中断します。
   2. 大脊椎動物標本(表4及び表5)
      1. 皮質、小脳、脳幹、脊髄マイクロ血管ペレットに20mLの氷冷MV-2溶液を加えます。チューブリボルバーシェーカーに混合してペレットを再懸濁し、40rpmで〜5分間攪拌します。
      2. 視床下部および下垂体マイクロ容器ペレットを5mLの血清学的ピペット(〜10フラッシュ)でMV-2溶液の5 mLで再中断する。懸濁液に5mLの氷冷MV-2溶液を加え、チューブをひっくり返して慎重に混ぜます。
2. 遠心分離機は4,400 x gで4°Cで15分間。
3. 慎重にチューブを回転させ、上清が壁に沿って通過できるようにすることで、各チューブの壁から液体界面の厚くて密なミエリン層を慎重に取り外します。
4. ミエリンと液体の界面を捨て、低リント紙の拭き取りで包まれたスパチュラで各チューブの内壁をブロットします。小さな脊椎動物の標本の場合は、移圧ピペットで慎重に吸引することにより、各視床下部および下垂体チューブからミエリン層を除去します。
5. ねじれた低リント紙の拭き取りで余分な液体を拭き取ります。低結合チップを使用して、MV-3溶液の1 mLで各ペレットを再サスペンドします。チューブは氷の上に置いておきなさい。

6. マイクロ容器の溶出とろ過

1. CNS地域ごとに個々のビーカーに氷冷MV-3溶液を注ぎます。4°Cに保管してください。
   1. 小さな脊椎動物の標本の場合は、50 mL ビーカーあたり 10 mL の MV-3 溶液を使用します。光学ローブが含まれているかどうかに応じて、合計6~7ビーカーが必要です。
   2. 大きな脊椎動物の標本の場合は、100 mL ビーカーあたり 30 mL の MV-3 溶液を使用します。白質が含まれているかどうかに応じて、合計6~7ビーカーが必要です。
2. 50 mL円錐管の上にセルストレーナーを置きます。CNS リージョンごとに 1 つを使用します。皮質、脳幹、視葉、脊髄、下垂体には100μmのストレーナーを使用します。小脳および視床下部には70μmの細胞ストレーナーを使用してください。
3. 各ストレーナーを1mLの氷冷MV-3溶液で濡らします。
4. 凝集を避けるために混合しながら、血清学的ピペットでステップ5.5で調製した懸濁液にさらにMV-3溶液を追加します。慎重にストレーナーの上にマイクロ容器をロードします。氷冷MV-3溶液ですすす。
   1. 小さな脊椎動物の標本(表2および表3)の場合は、血清学的ピペットで10~15mLのMV-3溶液を加え、5mLのMV-3溶液でリンスします。
   2. 大きな脊椎動物の標本の場合は、血清学的ピペットで20 mLのMV-3溶液を加え、10mLのMV-3溶液でリンスします。
5. 20 μmのナイロンネットフィルターを変更されたフィルターホルダー(図2D)に置いて、CNS領域ごとに1つずつ、ろ過ユニットを組み立てます。
   1. 小さな脊椎動物の標本(表2および表3)の場合は、皮質、小脳、脳幹、視葉、脊髄用の25mm改質フィルターホルダーを使用します。視床下部と下垂体には13mmの修正フィルターホルダーを使用してください。
   2. 大きな脊椎動物の標本(表4および表5)の場合は、皮質、小脳、脳幹、脊髄用の47mm修飾フィルターホルダーを使用します。視床下部と下垂体には 25 mm を使用します。
6. 50 mL円錐形チューブの上にフィルターを置き、5 mL の氷冷 MV-3 溶液を使用してフィルターを配置し、バッファーがフィルターホルダーを円錐管に流し込むことを確認します。
7. 溶出したマイクロ容器(ステップ6.4から)を20μmナイロンネットフィルターの上に移し、5~10mLの氷冷MV-3溶液でマイクロ容器をすすいでください。
8. クリーン鉗子を使用してフィルターを回収し、ステップ6.1で調製した氷冷MV-3溶液を含むビーカーに浸す。
9. マイクロ容器を約30sゆっくりと振ってフィルターから取り外します。小さな脊椎動物の標本の場合は、ビーカーの含有量を15 mL円錐チューブに注ぎます。大きな脊椎動物の標本の場合は、ビーカーの含有量を50mL円錐チューブに注ぎます。
10. 2,000 x gで4°Cで5分間遠心分離し、低結合ピペットチップを使用して1mLの氷冷MV-3溶液でペレットを再サスペンドします。
    1. 小さな脊椎動物の標本の場合は、懸濁液(ステップ6.10から)を1.7 mLマイクロ遠心管に移し、遠心分離機を20,000 x gで4°Cで5分間移します。
       注:このスピンは、堅牢な歩留まりを確保するために、最高速度(約20,000 x g)のベンチトップ遠心分離機で実行されます。
    2. 大きな脊椎動物の標本の場合は、ステップ6.10から5.0 mLマイクロ遠心管に懸濁液を移し、4mLのMV-3溶液を4mL加え、2,000 x gで遠心分離機を4°Cで5分間加えます。

7. 免疫染色

注:ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色は、爬虫類、両生類、魚類標本に対して、プロトコル実現可能性の概念実証として行った。したがって、これらの検体に対する免疫標識に対する推奨はない。

1. マイクロ遠心管から上清を取り除く。
2. 低結合ピペットチップ(材料表)を使用して、ペレットを1x滅菌PBSで再サスペンドします。マイクロ容器を複数回ピペット加工して凝集体を形成しないようにします。小さな脊椎動物の標本(表3)の場合は、ペレットサイズに応じて~100μL~2,000°Lを使用してください。大きな脊椎動物の標本(表5)の場合は、ペレットサイズに応じて~1,000μL~4,000°Lを使用してください。
3. 低結合ピペットチップを使用して、マイクロ容器をよくスライドに移し、サイドウォールを避けて各井戸の中央に追加するように注意してください。
4. BSC-2の内側に、覆われた井戸のスライドを設定し、RTで20〜30分間乾燥させます。
   注:凝集体形成を避けるために、1x PBSの比較的大きなボリュームが使用されます。このため、マイクロ容器がポリD-リジンコーティングによって保持されていることを確認するために、固定前にスライドを乾燥させる必要があります。
5. 転写ピペットでピペットをピペットで取り出して残留1x PBSを取り出し、4%パラホルムアルデヒド(PFA)の200μLを加え、RTで30分間インキュベートします。
6. 固定液をピペットアウトし、RTで5分間1x PBSの200 μLで3xを洗浄します。
   注:この時点で魚類、両生類、爬虫類CNS微小容器にH&E染色を行いました。
7. 200°Lのブロッキングバッファをウェルスライドに追加し、37°Cで60分間インキュベートします。
8. 転写ピペットでブロッキングバッファーを取り出し、抗体希釈剤に一次抗体カクテルの200μLを加えます(材料表)。4°Cで一晩インキュベートする。
9. ピペットは、一次抗体カクテルをピペットアウトし、RTで5分間1x PBSの200 μLで3xを洗浄します。
10. 1x PBSで希釈した二次抗体カクテル(材料表)をロードし、光から保護されたRTで2時間インキュベートします。
11. 二次抗体カクテルをピペットアウトし、光から保護されたRTで1x PBSの200 μLで3xを洗浄します。最後の洗浄後、よくスライドのフレームを取り外し、低リント紙ワイプで余分な1x PBSをブロットドライします。
12. 核染色用のカバースリップ、液体アンチフェードマウント剤、4',6-ジアミディノ-2-フェニリンドール(DAPI)を追加します。光から保護されたRTで一晩乾燥させてください。
13. 乾燥したら、共焦点顕微鏡検査とデータ取得の準備ができるまで、スライドボックスの光から保護してください。

結果

マウスCNSから単離された微小血管は、神経血管ユニット^2、3のすべての固有の細胞成分^を示した。血小板内皮細胞接着分子-1(PECAM、CD31とも呼ばれる)またはアイソレクチンIB4(内皮細胞グリコカリックスと結合する糖タンパク質)のいずれかを内皮細胞に使用し、 血小板由来増殖因子β(PDGFRβ)またはニューロングリア抗原2(NG2)は、天体細胞のペリサイトおよびアクアポリン-4(AQP4)に対して、これらの固有成分が単離された微小血管に存在することを示す。表示されるCNS領域には、皮質微小血管(図3B)、小脳(図3C)、下垂体(図

ディスカッション

BBBは、緊密な、付着物、"ペグソケット"-接合、およびCNS恒常性^2、3、19に不可欠な接着プラークの洗練されたアーキテクチャによって結合された脳微小血管系内皮細胞のユニークな特性を含む。内皮細胞特性は、ペリサイトおよび周囲のアストログリア末脚注プロセス^2、3、19によって誘導および維持される。BBB微小血管系は、極性(すなわち、発光またはアブルミナル内皮細胞表面に局在するタンパク質の非対称発現パターン⁾²⁰を表示する。これは一時的にBBBを定義するかもしれませんが、実際には神経科学の中で最も謎めいた概念の一つです。例えば、NVU内の地域的、性別、年齢差は、CNSの地域的な脆弱性を外傷、毒性、感染、炎症に対して説明する...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10X PBS	ThermoFisher	BP39920	ブロッキングおよび抗体希釈剤に使用されます。
20% PFA	電子顕微鏡科学	15713-S	固定剤として使用 (4% PFA)
70,000 MW デキストラン	ミリポア シグマ	9004-54-0	MV-2 溶液に使用
アドソン鉗子	ファイン サイエンス ツール (FST)	11006-12	筋肉と皮膚の除去に使用
アドソン鉗子、学生品質	FST	91106-12	上記と同じだが、より安価な
ウシ血清アルブミン(BSA)	ミリポアシグマ	A7906-100G	MV-3溶液、ブロッキングおよび抗体希釈剤に使用
コーニング100 μm セルストレーナー	ミリポアシグマ	CLS431752-50EA
コーニング 70 μm セルストレーナー	ミリポアシグマ	CLS431751-50EA
コーニング デスクワーク 低結合チップ	ミリポアシグマ	CLS4151	以下と同じですが、安価です。
カルトレックスポリ-D-リジン	R&D	3439-100-01	スライドコーティングに使用
ロバ抗ヤギ IgG-ALEXA 555	サーモ	A21432	二次抗体として使用。1:200の推奨希釈。
ロバ抗マウスIgG-ALEXA 488	Thermo	A21202	二次抗体として使用します。1:200の推奨希釈。
ロバ抗ウサギIgG-ALEXA 488	Thermo	A21206	二次抗体として使用されます。1:200の推奨希釈。
ロバ抗ウサギIgG-ALEXA 647	Thermo	A31573	二次抗体として使用します。1:200の推奨希釈。
ロバ抗ラットIgG-DyLight 650	モ	SA5-10029	二次抗体として使用されます。1:200の推奨希釈。
二重突きティッシュピック	FST	18067-11	髄膜および脈絡叢の除去に使用
デュモン #3c 鉗子	FST	11231-20	より繊細で、および/または小さな CNS 組織の取り扱いに使用 (下垂体など)
デュモン #7 鉗子	FST	11274-20	CNS tisssue 解剖および取り扱いに使用
デュモン #7 鉗子、学生	FST	91197-00	上記と同じ安い
ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention Tips	Eppendorf	22493008	上記のヒントよりも品質が良い(より高価)。
極細グレーフ鉗子、鋸歯状	FST	11151-10	骨の除去に使用
細かいはさみ、鋭い	FST	14060-09	豚とマカクの硬膜嚢
ガラス乳棒の除去に使用 1.5mLマイクロ遠心チューブティッシュグラインダーホモジナイザー、10チャン	バイオサイエンス株式会社(eBay)	GP1.5_10	小さな獣医の視床下部と下垂体に使用されます。
ヤギ抗CXCL12、ビオチン化	PeproTech	500-P87BGBT	すべての検体からCNS微小血管に対する一次抗体として使用されます。推奨希釈:1:20。
ヤギ反JAM-B	R&D	AF1074	神経炎症を評価するための一次抗体として使用されます。推奨濃度:5 μg/mLです。
ヤギ抗マウスIgG-ALEXA 488	Thermo	A11001	二次抗体として使用されます。1:200の推奨希釈。
ヤギ抗マウスIgG-ALEXA 555	Thermo	A21424	二次抗体として使用されます。1:200の推奨希釈。
ヤギの抗PDGFR&β;	R&D	AF1042	すべての検体からCNS微小血管の一次抗体として使用。推奨濃度:5 μg/mLです。
ヤギ抗ウサギ IgG-ALEXA 555	Thermo	A21249	二次抗体として使用されます。1:200の推奨希釈。
ヤギ抗ウサギIgG-DyLight 488	Thermo	35552	二次抗体として使用されます。1:200の推奨希釈。
ヤギ抗ラットIgG-DyLight 650	Thermo	SA5-10021	二次抗体として使用されます。1:200の推奨希釈。
Graefeの鉗子、曲げられた先端、1X2歯	FST	11054-10	HBSSのナイロン フィルター網の保持および振とうのための使用
カルシウムおよびマグネシウムが付いている1X緩衝液	コーニング	21-022-CM	MV-1解決
HEPESの使用、1M液体緩衝器	コーニング	25-060-CI	MV-1解決
ソレクチンGS-IB4-Biotin-XX	のために使用される サーモフィッシャーサイエンティフィック(熱)	I21414	マメ科植物Griffonia simplicifoliaから単離された糖タンパク質は、内皮細胞glycocalysxのD-ガラクトシル残基に結合します。鳥類およびブタの中枢神経系微小血管に使用されます。推奨濃度:5 μg/mLです。
LaGrange はさみ、鋸歯状	FST	14173-12	頭蓋骨解剖および椎弓切除術に使用されます(ブタとマカクを除く)
Millicell EZ スライド 8 ウェルユニット	ミリポアシグマ	PEZGS0816
マウス抗 CLDN5	サーモ	35-2500	すべての検体から中枢神経系微小血管の一次抗体として使用されます。推奨濃度:5 μg/mLです。
マウス抗GGT1	Abcam	ab55138	すべての検体からCNS微小血管の一次抗体として使用されます。推奨濃度:5 μg/mLです。
マウス抗ヒトCD31	R&D	BBA7	霊長類中枢神経系微小血管の一次抗体として使用されます。推奨濃度:16.5 μg/mLです。
マウス抗NFM	Thermo	RMO-270	すべての検体からCNS微小血管の一次抗体として使用されます。推奨濃度:5 μg/mLです。
マウス抗抗体 - SMA	Thermo	MA5-11547	すべての検体からCNS微小血管に対する一次抗体として使用されます。1:200の推奨希釈。
ナイロンフィルターネット、ロール	ミリポアシグマ	NY6000010	レーザーカットされた直径13mmのフィルターネットディスク。小さな獣児の視床下部と下垂体に使用されます。
ナイロンフィルターネット、25mm	ミリポアシグマ	NY2002500	視床下部と下垂体を除くほとんどの小さな脊椎動物のCNS組織に使用されます。マカクザルやブタの視床下部や下垂体に使用されます。
ナイロンフィルターネット、47 mm	ミリポアシグマ	NY2004700	視床下部と下垂体を除く、マカクとブタの中枢神経系組織に使用されます。
ProLong Gold 退色防止試薬 DAPI	ThermoFisher	P36935	スライドのカバースリップに使用します。
Rabbit anti-AQP4	Millipore Sigma	A5971	すべての検体からCNS微小血管に対する一次抗体として使用されます。1:200の推奨希釈。
ウサギ抗LSR	ミリポアシグマ	SAB2107967	すべての検体からCNS微小血管に対する一次抗体として使用されます。推奨濃度:5 μg/mLです。
Rabbit anti-NG2	Millipore Sigma	AB5320	すべての検体からCNS微小血管に対する一次抗体として使用されます。1:200の推奨希釈。
ウサギ抗OSP	Abcam	ab53041	すべての検体からCNS微小血管の一次抗体として使用されます。推奨濃度:1 μg/mLです。
ウサギ抗VE-Cadherin	Abcam	ab33168	すべての検体からCNS微小血管に対する一次抗体として使用されます。推奨濃度:5 μg/mLです。
Rabbit anti-ZO-1	Thermo	61-7300	すべての検体から中枢神経系微小血管に対する一次抗体として使用されます。推奨濃度:5 μg/mLです。
ラット抗CD31	Becton Dickinson	BD 550274	マウス中枢神経系微小血管の一次抗体として使用されます。推奨濃度:5 μg/mLです。
ラット抗GFAP	Thermo	13-0300	すべての検体からCNS微小血管に対する一次抗体として使用されます。1:200の推奨希釈。
ラット抗VCAM-1	Becton Dickinson	BD 553329	神経炎症を評価するための一次抗体として使用されます。推奨濃度:5 μg/mLです。
滅菌リンガー液、フロッグ	アルドンコーポレーション	IS5066	アンフィビア麻酔に使用
ストレプトアビジン-ALEXA 555	サーモ	S32355	ビオチン化一次抗体を標識するための二次抗体として使用されます。1:500の推奨希釈。
Streptavidin-ALEXA 647	Thermo	S32357	ビオチン化一次抗体を標識するための二次抗体として使用されます。1:500の推奨希釈。
外科用ハサミ、シャープ	なFST	14002-12	筋肉や皮膚の除去に使用
外科用ハサミ、シャープな鈍い	FST	14001-16	斬首に使用(ブタとマカクを除く)
Swinnex フィルターホルダー、13mm	ミリポアシグマ	SX0001300	レーザーカットで修正。小さな獣児の視床下部と下垂体に使用されます。
Swinnexフィルターホルダー、25mm	ミリポアシグマ	SX0002500	レーザーカットで変更。視床下部と下垂体を除くほとんどの小さな脊椎動物のCNS組織に使用されます。マカクザルやブタの視床下部や下垂体に使用されます。
Swinnexフィルターホルダー、47mm	ミリポアシグマ	SX0004700	レーザーカットで変更。視床下部と下垂体を除く、マカクとブタの中枢神経系組織に使用されます。
Triton X-100	ThermoFisher	50-165-7277	ブロッキングおよび抗体希釈剤に使用されます。
Wheaton 120 Vac オーバーヘッドスターラー	VWR (サプライヤー DWK Life Sciences)	62400-904 (DWK #903475)	視床下部と下垂体を除く 55 mL の組織グラインダーを備えたマカクとブタの CNS 組織に使用されます。
PTFE乳棒、10 mL	VWR(サプライヤーDWKライフサイエンス)	14231-384(DWK#357979)	視床下部と下垂体を除くほとんどの小さな脊椎動物CNS組織で使用されるウィートンポッター-エルヴェイェムティッシュグラインダー。マカクザルやブタの視床下部や下垂体に使用されます。
PTFE乳棒、55 mL	VWR(サプライヤーDWKライフサイエンス)	14231-372(DWK #357994)	床下部と下垂体を除くマカクとブタのCNS組織に使用されます。