このプロトコルの目的は、リッセンセファリックおよびギレンセファリック脊椎動物の中枢神経系の複数の領域から微小血管を分離することです。
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方法論記事
5つの脊椎動物群にわたる中枢神経系微小血管の信頼性の高い絶縁
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
中枢神経系(CNS)からの微小血管の単離は、一般的に、複数の動物、最も頻繁にげっ歯類からの皮質組織を組み合わせることによって行われる。このアプローチは、血液脳関門(BBB)特性の尋問を皮質に制限し、個々の比較を可能にしません。このプロジェクトは、皮質、小脳、視床下部、下垂体、脳幹、脊髄など、複数のCNS領域からの神経血管ユニット(NVU)の比較を可能にする単離方法の開発に焦点を当てています。さらに、もともとマウスサンプル用に開発されたこのプロトコルは、脳半球白物から微小血管を分離することができる小さな大きな脊椎動物種のCNS組織での使用に適応することに成功しました。この方法は、免疫標識と組み合わせると、タンパク質発現の定量と個体、組織型、または治療間の統計的比較を可能にする。神経炎症性疾患、多発性硬化症のマウスモデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)におけるタンパク質発現の変化を評価することで、この応用性を証明した。さらに、この方法で隔離されたマイクロ容器は、qPCR、RNA-seq、ウェスタンブロットなどの下流アプリケーションに使用できます。これは、超遠心分離または酵素解離を使用せずにCNSマイクロ容器を分離する最初の試みではありませんが、単一の個人と複数のCNS領域の比較に対するその熟達性においてユニークです。したがって、CNS部分(皮質、小脳、視葉、脳幹、視床下部、下垂体、脊髄)、CNS組織型(灰色または白色物質)、個体、実験的治療群、および種。
概要
私たちの脳は、私たちの体の中で最も重要な器官です。このため、正常からの逸脱を引き起こす可能性のある外的要因にもかかわらず、脳恒常性を維持することが優先事項である。一部の学者によると、約4億〜5億年前の1、脊椎動物は、私たちが今血液脳関門(BBB)2、3として知っているものを開発しました。この保護「フェンス」は、血液とCNSパレンチマ間のイオン、分子、細胞の輸送を厳密に調節することにより、中枢神経系(CNS)恒常性および機能に最も大きな影響を及ぼします。BBBが破壊されると、脳は毒性暴露、感染、炎症を受けやすくなります。したがって、BBB機能障害は、すべてではないにしても、神経学的および神経発達障害4、5、6に関連している。
BBBの高度な機能は、神経血管ユニット(NVU)2、3によって適合されたユニークなCNS微小血管系に起因する。高度に専門化された内皮細胞、ペリサイト、および星値状端足は、NVU
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プロトコル
本研究のすべての手順は、カリフォルニア大学(UC)、デイビス制度動物ケア・使用委員会(IACUC)が定めたガイドラインに従っています。UCデイビスの動物ケアは、いくつかの独立したリソースによって規制されており、1966年以来、ラボアニマルケアインターナショナル(AAALAC)の評価と認定のための協会によって完全に認定されています。豚CNS組織は、食肉科学研究所動物科学UCD学科から得られました。レセウス・マカクのCNS組織は、カリフォルニア国立霊長類研究センター病理部(NIH P51OD011107)から得られた。麻酔、安楽死、または壊死は、豚やマカクの実験室スタッフによって行われませんでした。したがって、これらの問題に関する特定の推奨事項はありません。
注:この方法は、複数の種のために検証されましたが、提供されたプロトコルは、マウスとブタの組織により直接的に対応しています。哺乳動物標本を使用する場合、光学ローブに関する詳細は適用されません。すべてのバイオ危険物は、適切なバイオセーフティレベル(BSL)施設で取り扱う必要があります。すべての急性毒性材料は、ヒュームフードの下で処理する必要があります。すべての生体有害な医療廃棄物および急性毒性廃棄物は、適切に処分されなければならない。
1. 準備
- 少なくとも1日前に解決策(表1)を準備します。
注:70 kDa分子....
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結果
マウスCNSから単離された微小血管は、神経血管ユニット2、3のすべての固有の細胞成分を示した。血小板内皮細胞接着分子-1(PECAM、CD31とも呼ばれる)またはアイソレクチンIB4(内皮細胞グリコカリックスと結合する糖タンパク質)のいずれかを内皮細胞に使用し、 血小板由来増殖因子β(PDGFRβ)またはニューロングリア抗原2(NG2)は、天体細胞のペリサイトおよびアクアポリン-4(AQP4)に対して、これらの固有成分が単離された微小血管に存在することを示す。表示されるCNS領域には、皮質微小血管(図3B)、小脳(図3C)、下垂体(図
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ディスカッション
BBBは、緊密な、付着物、"ペグソケット"-接合、およびCNS恒常性2、3、19に不可欠な接着プラークの洗練されたアーキテクチャによって結合された脳微小血管系内皮細胞のユニークな特性を含む。内皮細胞特性は、ペリサイトおよび周囲のアストログリア末脚注プロセス2、3、19によって誘導および維持される。BBB微小血管系は、極性(すなわち、発光またはアブルミナル内皮細胞表面に局在するタンパク質の非対称発現パターン)20を表示する。これは一時的にBBBを定義するかもしれませんが、実際には神経科学の中で最も謎めいた概念の一つです。例えば、NVU内の地域的、性別、年齢差は、CNSの地域的な脆弱性を外傷、毒性、感染、炎症に対して説明する.......
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開示事項
著者たちは何も開示する必要はない。
謝辞
クルーズ・オレンゴ博士は、カリフォルニア大学デービス獣医学部スタートアップファンドの支援を受けました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 10X PBS | ThermoFisher | BP39920 | ブロッキングおよび抗体希釈剤に使用されます。 |
| 20% PFA | 電子顕微鏡科学 | 15713-S | 固定剤として使用 (4% PFA) |
| 70,000 MW デキストラン | ミリポア シグマ | 9004-54-0 | MV-2 溶液に使用 |
| アドソン鉗子 | ファイン サイエンス ツール (FST) | 11006-12 | 筋肉と皮膚の除去に使用 |
| アドソン鉗子、学生品質 | FST | 91106-12 | 上記と同じだが、より安価な |
| ウシ血清アルブミン(BSA) | ミリポアシグマ | A7906-100G | MV-3溶液、ブロッキングおよび抗体希釈剤に使用 |
| コーニング100 μm セルストレーナー | ミリポアシグマ | CLS431752-50EA | |
| コーニング 70 μm セルストレーナー | ミリポアシグマ | CLS431751-50EA | |
| コーニング デスクワーク 低結合チップ | ミリポアシグマ | CLS4151 | 以下と同じですが、安価です。 |
| カルトレックスポリ-D-リジン | R&D | 3439-100-01 | スライドコーティングに使用 |
| ロバ抗ヤギ IgG-ALEXA 555 | サーモ | A21432 | 二次抗体として使用。1:200の推奨希釈。 |
| ロバ抗マウスIgG-ALEXA 488 | Thermo | A21202 | 二次抗体として使用します。1:200の推奨希釈。 |
| ロバ抗ウサギIgG-ALEXA 488 | Thermo | A21206 | 二次抗体として使用されます。1:200の推奨希釈。 |
| ロバ抗ウサギIgG-ALEXA 647 | Thermo | A31573 | 二次抗体として使用します。1:200の推奨希釈。 |
| ロバ抗ラットIgG-DyLight 650 | モ | SA5-10029 | 二次抗体として使用されます。1:200の推奨希釈。 |
| 二重突きティッシュピック | FST | 18067-11 | 髄膜および脈絡叢の除去に使用 |
| デュモン #3c 鉗子 | FST | 11231-20 | より繊細で、および/または小さな CNS 組織の取り扱いに使用 (下垂体など) |
| デュモン #7 鉗子 | FST | 11274-20 | CNS tisssue 解剖および取り扱いに使用 |
| デュモン #7 鉗子、学生 | FST | 91197-00 | 上記と同じ安い |
| ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention Tips | Eppendorf | 22493008 | 上記のヒントよりも品質が良い(より高価)。 |
| 極細グレーフ鉗子、鋸歯状 | FST | 11151-10 | 骨の除去に使用 |
| 細かいはさみ、鋭い | FST | 14060-09 | 豚とマカクの硬膜嚢 |
| ガラス乳棒の除去に使用 1.5mLマイクロ遠心チューブティッシュグラインダーホモジナイザー、10チャン | バイオサイエンス株式会社(eBay) | GP1.5_10 | 小さな獣医の視床下部と下垂体に使用されます。 |
| ヤギ抗CXCL12、ビオチン化 | PeproTech | 500-P87BGBT | すべての検体からCNS微小血管に対する一次抗体として使用されます。推奨希釈:1:20。 |
| ヤギ反JAM-B | R&D | AF1074 | 神経炎症を評価するための一次抗体として使用されます。推奨濃度:5 μg/mLです。 |
| ヤギ抗マウスIgG-ALEXA 488 | Thermo | A11001 | 二次抗体として使用されます。1:200の推奨希釈。 |
| ヤギ抗マウスIgG-ALEXA 555 | Thermo | A21424 | 二次抗体として使用されます。1:200の推奨希釈。 |
| ヤギの抗PDGFR&β; | R&D | AF1042 | すべての検体からCNS微小血管の一次抗体として使用。推奨濃度:5 μg/mLです。 |
| ヤギ抗ウサギ IgG-ALEXA 555 | Thermo | A21249 | 二次抗体として使用されます。1:200の推奨希釈。 |
| ヤギ抗ウサギIgG-DyLight 488 | Thermo | 35552 | 二次抗体として使用されます。1:200の推奨希釈。 |
| ヤギ抗ラットIgG-DyLight 650 | Thermo | SA5-10021 | 二次抗体として使用されます。1:200の推奨希釈。 |
| Graefeの鉗子、曲げられた先端、1X2歯 | FST | 11054-10 | HBSSのナイロン フィルター網の保持および振とうのための使用 |
| カルシウムおよびマグネシウムが付いている1X緩衝液 | コーニング | 21-022-CM | MV-1解決 |
| HEPESの使用、1M液体緩衝器 | コーニング | 25-060-CI | MV-1解決 |
| ソレクチンGS-IB4-Biotin-XX | のために使用される サーモフィッシャーサイエンティフィック(熱) | I21414 | マメ科植物Griffonia simplicifoliaから単離された糖タンパク質は、内皮細胞glycocalysxのD-ガラクトシル残基に結合します。鳥類およびブタの中枢神経系微小血管に使用されます。推奨濃度:5 μg/mLです。 |
| LaGrange はさみ、鋸歯状 | FST | 14173-12 | 頭蓋骨解剖および椎弓切除術に使用されます(ブタとマカクを除く) |
| Millicell EZ スライド 8 ウェルユニット | ミリポアシグマ | PEZGS0816 | |
| マウス抗 CLDN5 | サーモ | 35-2500 | すべての検体から中枢神経系微小血管の一次抗体として使用されます。推奨濃度:5 μg/mLです。 |
| マウス抗GGT1 | Abcam | ab55138 | すべての検体からCNS微小血管の一次抗体として使用されます。推奨濃度:5 μg/mLです。 |
| マウス抗ヒトCD31 | R&D | BBA7 | 霊長類中枢神経系微小血管の一次抗体として使用されます。推奨濃度:16.5 μg/mLです。 |
| マウス抗NFM | Thermo | RMO-270 | すべての検体からCNS微小血管の一次抗体として使用されます。推奨濃度:5 μg/mLです。 |
| マウス抗抗体 - SMA | Thermo | MA5-11547 | すべての検体からCNS微小血管に対する一次抗体として使用されます。1:200の推奨希釈。 |
| ナイロンフィルターネット、ロール | ミリポアシグマ | NY6000010 | レーザーカットされた直径13mmのフィルターネットディスク。小さな獣児の視床下部と下垂体に使用されます。 |
| ナイロンフィルターネット、25mm | ミリポアシグマ | NY2002500 | 視床下部と下垂体を除くほとんどの小さな脊椎動物のCNS組織に使用されます。マカクザルやブタの視床下部や下垂体に使用されます。 |
| ナイロンフィルターネット、47 mm | ミリポアシグマ | NY2004700 | 視床下部と下垂体を除く、マカクとブタの中枢神経系組織に使用されます。 |
| ProLong Gold 退色防止試薬 DAPI | ThermoFisher | P36935 | スライドのカバースリップに使用します。 |
| Rabbit anti-AQP4 | Millipore Sigma | A5971 | すべての検体からCNS微小血管に対する一次抗体として使用されます。1:200の推奨希釈。 |
| ウサギ抗LSR | ミリポアシグマ | SAB2107967 | すべての検体からCNS微小血管に対する一次抗体として使用されます。推奨濃度:5 μg/mLです。 |
| Rabbit anti-NG2 | Millipore Sigma | AB5320 | すべての検体からCNS微小血管に対する一次抗体として使用されます。1:200の推奨希釈。 |
| ウサギ抗OSP | Abcam | ab53041 | すべての検体からCNS微小血管の一次抗体として使用されます。推奨濃度:1 μg/mLです。 |
| ウサギ抗VE-Cadherin | Abcam | ab33168 | すべての検体からCNS微小血管に対する一次抗体として使用されます。推奨濃度:5 μg/mLです。 |
| Rabbit anti-ZO-1 | Thermo | 61-7300 | すべての検体から中枢神経系微小血管に対する一次抗体として使用されます。推奨濃度:5 μg/mLです。 |
| ラット抗CD31 | Becton Dickinson | BD 550274 | マウス中枢神経系微小血管の一次抗体として使用されます。推奨濃度:5 μg/mLです。 |
| ラット抗GFAP | Thermo | 13-0300 | すべての検体からCNS微小血管に対する一次抗体として使用されます。1:200の推奨希釈。 |
| ラット抗VCAM-1 | Becton Dickinson | BD 553329 | 神経炎症を評価するための一次抗体として使用されます。推奨濃度:5 μg/mLです。 |
| 滅菌リンガー液、フロッグ | アルドンコーポレーション | IS5066 | アンフィビア麻酔に使用 |
| ストレプトアビジン-ALEXA 555 | サーモ | S32355 | ビオチン化一次抗体を標識するための二次抗体として使用されます。1:500の推奨希釈。 |
| Streptavidin-ALEXA 647 | Thermo | S32357 | ビオチン化一次抗体を標識するための二次抗体として使用されます。1:500の推奨希釈。 |
| 外科用ハサミ、シャープ | なFST | 14002-12 | 筋肉や皮膚の除去に使用 |
| 外科用ハサミ、シャープな鈍い | FST | 14001-16 | 斬首に使用(ブタとマカクを除く) |
| Swinnex フィルターホルダー、13mm | ミリポアシグマ | SX0001300 | レーザーカットで修正。小さな獣児の視床下部と下垂体に使用されます。 |
| Swinnexフィルターホルダー、25mm | ミリポアシグマ | SX0002500 | レーザーカットで変更。視床下部と下垂体を除くほとんどの小さな脊椎動物のCNS組織に使用されます。マカクザルやブタの視床下部や下垂体に使用されます。 |
| Swinnexフィルターホルダー、47mm | ミリポアシグマ | SX0004700 | レーザーカットで変更。視床下部と下垂体を除く、マカクとブタの中枢神経系組織に使用されます。 |
| Triton X-100 | ThermoFisher | 50-165-7277 | ブロッキングおよび抗体希釈剤に使用されます。 |
| Wheaton 120 Vac オーバーヘッドスターラー | VWR (サプライヤー DWK Life Sciences) | 62400-904 (DWK #903475) | 視床下部と下垂体を除く 55 mL の組織グラインダーを備えたマカクとブタの CNS 組織に使用されます。 |
| PTFE乳棒、10 mL | VWR(サプライヤーDWKライフサイエンス) | 14231-384(DWK#357979) | 視床下部と下垂体を除くほとんどの小さな脊椎動物CNS組織で使用されるウィートンポッター-エルヴェイェムティッシュグラインダー。マカクザルやブタの視床下部や下垂体に使用されます。 |
| PTFE乳棒、55 mL | VWR(サプライヤーDWKライフサイエンス) | 14231-372(DWK #357994) | 床下部と下垂体を除くマカクとブタのCNS組織に使用されます。 |
参考文献
- Bundgaard, M., Abbott, N. J. All vertebrates started out with a glial blood-brain barrier 4-500 million years ago. Glia. 56, 699-708 (2008).
- Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a020412(2015).
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