方法論記事

緑膿菌におけるフレーム内遺伝子欠失変異体の生成と感染の単純マウスモデルにおける毒性減衰の試験

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DOI：

10.3791/60297

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2020年1月8日

 ,  , 
1Progenesis Technologies, LLC, 2Department of Biomedical Sciences, Pediatrics, Joan C. Edwards School of Medicine at Marshall University

この記事について

サマリー

ここでは、市販品に対する米国食品医薬品局(FDA)承認の大腸菌と比較して、緑膿菌の遺伝子組み換え株の減衰を評価する感染のマウスモデルの簡単かつ再現性の高いプロトコルについて説明する。

要約

微生物は遺伝的に汎用性が高く多様であり、多くの市販品やバイオ医薬品の主要な供給源となっています。これらの製品のいくつかは、生物によって自然に生産されますが、他の製品は、生産の収量を増加させるために生物の遺伝子工学を必要とします。大腸菌のアビドロン酸株は、伝統的にバイオ医薬品を生産するための好ましい細菌種であった;しかし、大腸菌が生産しにくい製品もある。したがって、他の細菌種のアビトリュント株は、いくつかの市販品の生産に有用な代替手段を提供することができる。緑膿菌は、大腸菌に代わる適切な代替を提供できる一般的でよく研究されたグラム陰性細菌である。しかしながら、P.アルギノーサは日和見ヒト病原体である。ここでは、pEX100T-NotIプラスミドを用いた逐次ゲノム欠失を介してP.アルギノーサの非病原性株を生成するために使用できる手順を詳述する。この方法の主な利点は、マーカーフリー株を生成することです。この方法は、市販品の製造のための高度に減衰したP.アルギノーサ株を生成するために、または他の特定の用途のための株を設計するために使用され得る。我々はまた、大腸菌のFDA承認BL21株と比較して遺伝子操作された株の減衰をテストするために検証された試験株の腹腔内注射を介して細菌全身感染の単純かつ再現可能なマウスモデルを記述する。

概要

緑膿菌は、ヒト、特に免疫不全において生命を脅かす疾患を引き起こす可能性のある日和見細菌病原体である。P.エルギノーサの病原性は、プロテアーゼおよびリポ多糖を含む多くの毒性因子の発現、ならびに保護バイオフィルム1を形成する能力に起因する。病原性因子を産生し、ヒトに疾患を引き起こす能力のために、P.アルギノーサを使用して市販品を安全上の懸念を提示する。大腸菌の非病原性株は、伝統的に人間の使用のためのバイオエンジニアリング医療および商業製品に使用されてきました。しかし、大腸菌が作るのが難しい製品もあれば、封入体に包装されている製品も多く、抽出に手間がかかるものもあります。特定の製品を作り、分泌する能力を持つ操作された細菌株は、分泌が収率を増加させ、精製プロセスを容易にする可能性が高いので、非常に望ましいです。したがって、細菌の他の種の非病原性株(例えば、より多くの分泌経路を利用する種)は、大腸菌に有用な代替手段を提供し得る。我々は最近、生物の病原性及び毒性が高く減衰するP.アルギノーサ、PGN5の株の開発を報告した2.重要なことに、この株はまだ多糖アルギン酸塩を大量に生成し、P.エルギノーサバイオフィルムの商業的に興味深い成分である。

PGN5株....

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プロトコル

動物実験を開始する前に、使用するプロトコルは、機関動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認されなければなりません。記載されたプロトコルの承認は、マーシャル大学(ハンティントン、WV、米国)のIACUCを通じて得られました。

1. プラスミドデザイン

  1. pEX100T-NotIプラスミドを用いて遺伝的欠失を生成するために、所望の欠失配列を横切るDNAの領域をクローン化し、プラスミドのNotI制限部位に挿入する。プラスミド挿入物は、標的欠失配列の下流約500ヌクレオチドに直接隣接する標的配列の上流に約500ヌクレオチドを含むべきである。さらに、挿入には、5' および 3' の端に NotI 認識シーケンス (GCGGCCGC) が含まれている必要があります (図 1B)。

2. プラスミド製剤

  1. オプション 1: 従来のクローン作成手順を利用します。PCRを使用して目的の遺伝子の上流および下流のゲノム領域を増幅し、続いてクロスオーバーPCR9、10が生成されたフラグメントに結合し、PCR産物およびプラスミドのエンドヌクレアーゼ消化を制限し、ライゲーション

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結果

図2に示すように、標的ゲノム欠失は、目的領域を増幅する特定のプライマーを有するコロニーPCRを用いて確認することができる。ゲノム欠失を伴うコロニーは、野生型コロニーに比べてPCRバンドサイズが短くなります。10-12コロニーのPCRスクリーンは、通常、標的欠失を運ぶ少なくとも1つのコロニーを検出するのに十分である。画面の複数のラウンド後に削除が検出されない場合は、コンジュゲーションから手順を繰り返します。それでも削除が失敗する場合は、プラスミド挿入物をシーケンシング、再設計、または削除が致死的であることを確認する必要があります。PCRを介した遺伝子欠失の検証に際して、シーケンシングによる欠失を確認する。得られた株は、逐次ゲノム修飾を生成する手順を繰り返し行って行われ得る。

図3に示すように、P.アルギノーサPGN5(.......

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ディスカッション

pEX100T-Not1プラスミドは、マーカーフリーでフレーム内の逐次ゲノム欠失の効率的なメディエーターです。減衰した毒性に対する細菌株を工学的に行う場合、点突然変異を発生させるのではなく、遺伝子配列全体を欠失すると、毒性表現型への復帰の可能性が減少する。さらに、各病原性遺伝子欠失は、さらに病原体を減衰させ、減衰の安定性を強化する。

この方法は、プラスミド挿入物の設計を改変するだけで、点突然変異や挿入などの欠失以外のゲノム修飾を生成するためにも使用できる。これらのタイプの修飾は、例えば、改変代謝を有する細菌を工学するための遺伝子欠失全体よりも有用である可能性がある。逐次ゲノム修飾は、研究および産業における特定の目的に合わせてデザイナー細菌株を生成する大きな可能性を有する。細菌における所望のマーカーフリーゲノム修飾を生成する他の方法は、15、16、17、18に記載されている。<.......

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開示事項

著者のホンウェイ・D・ユーは、創世記テクノロジーズ合同会社の最高科学責任者兼共同創設者です。

謝辞

この研究は、国立衛生研究所(NIH)助成金R44GM113545およびP20GM103434によって支えられた。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
フラットキャップ付き0.2 mLThermoScientificAB-0620via Fisher Scientific
1 mL SyringeBD22-253-260via Fisher Scientific
1.5 mL 使い捨てポリスチレンキュベットフィッシャーサイエンティフィ14955127
1.5 mL 微量遠心チューブフィッシャーサイエンティフィック05-408-129
2.0 mL 極低温バイアルコーニングフィッシャーサイエンティフィック
430659 27GニードルBD14-821-13Bフィッシャーサイエンティフィ
50mLチューブ経由フィッシャーサイエンティフィック05-539-13
アキュブロック デジタルドライバスラブネットNC0205808ッシャーサイエンティフィック
ベンチトップ遠心分離機5804Rエッペンドルフ経由 04-987-372ッシャーサイエンティフィック
卓上型微量遠心分離機Sorvall75-003-287via Fisher Scientific
キャビネット インキュベーターVWR1540
カルベニシリン二ナトリウム塩フィッシャーサイエンBP2648250
培養試験管、ポリスチレンフィッシャーサイエンティフィック14-956-6Dvia フィッシャーサイエンティ
ディポーザブル接種ループッシャーサイエンティフィック22-363-597
Dneasy UltraClean Microbial Kit (50)Qiagen12224-50または推奨方法/ベンダー
E.Z.N.A. Cycle Pure Kit (50)Omega bio-tekD6493-01または推奨方法/ベンダー
EcoRI-HF、制限 endonucleaseNew England BioLabsR3101L
エレクトロポレーションキュベットブルドッグ バイオNC0492929via FisherScientific
FastLink II DNAライゲーションキットEpicentre TechnologiesLK6201Hvia Fisher Scientific
Gentamycin SulfateFisher ScientificBP918-1
GlycerolFisher ScientificBP229-4
GoTaq G2 Colorless Master MixPromegaM7833via Fisher Scientific
Isothesia IsofluraneHenry Scheinアニマルヘルス29405
IVIS Lumina XRMS Series III In Vivo Imaging SystemパーキンスとエルマーCLS136340
カナマイシン一硫酸塩フィッシャーサイエンティフィックBP906-5
LE アガロースGenemate3120-500via フィッシャーサイエンティフィ
ルリアブロスDifco240230via フィッシャーサイエンティフィック
マイクロパルサーエレクトロポレーターBioRad1652100
Noble agar, ultrapureAffymetris/USBAAJ10907A1via Fisher Scientific
NotI-HF, restriction endonucleaseNew England BioLabsR3189
One Shot TOP10 Electrocomp E. coliInvitrogenC404052via Fisher Scientific
Phosphate buffered saline powderSigmaP3813-10PAKSigma-Aldrich
Prism 7GraphPadhttps://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
Pseudomonas isolationagar Difco292710via Fisher Scientific
Pseudomonas isolationブロスアルファ バイオサイエンスP16-115カスタムメイド バッチ
QIAprep スピン ミニプレップ キット (250)Qiagen27106または優先方法/ベンダー
振とうインキュベーターニューブランズウィック サイイノーバ 4080200 rpm
SimpliAmp サーマル サイクラーアプライド バイオシステムA24811
スキム ミルクディフコDF0032-17-3経由フィッシャーサイエンティフィック
スモールプレート (外径 100 x 10 mm)フィッシャーサイエンティフィックFB0875713
SmartSpec Plus 分光光度計Bio-Rad170-2525または推奨メソッド/ベンダー
ショ糖フィッシャーサイエンティフィックS5-500
つまようじ、丸型 ダイヤモンドまようじの任意のブランド、オートクレーブ済み
TOPO TA クローニングキット、シーケンシング用Invitrogen45-0030
XAF-8 麻酔システムフィルターパーキンス&エルマー118999
XGI 8 ガス麻酔システムキャリパー ライフサイエンス/Xenogen
チューブ ック 経由のック経由 フィフィ経由ティフィック フィック フィック クタイエント つ

参考文献

  1. Gellatly, S. L., Hancock, R. E. Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses. Pathogens and Disease. 67 (3), 159-173 (2013).
  2. Valentine, M. E., et al. Generation of a highly attenuate....

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PCRpEX100T NotI

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