マウス骨格筋移植からの原発性筋芽生の単離と分化

Summary

ミオブラストは、多核化ミオチューブと最終的に骨格筋筋筋筋繊維を形成するために分化する前駆細胞を増殖させる。ここでは、若年成人マウス骨格筋からの原発筋芽生の効率的な単離および培養のためのプロトコルを提示する。この方法は、培養中の筋肉細胞の分子的、遺伝的、代謝的研究を可能にする。

Abstract

原発性筋芽生児は、骨格筋の未分化増殖前駆体である。彼らは培養し、筋肉の前駆体として研究したり、筋肉の発達の後の段階に区別するように誘導することができます.ここで提供されるプロトコルは、若い成人マウス骨格筋移植から筋芽細胞の高増殖集団の単離および培養のための堅牢な方法を説明する。これらの細胞は、異なるマウスモデルの骨格筋の代謝特性の研究、ならびに外因性DNAによるトランスフェクションやウイルス発現ベクターによるトランスダクションなどの他の下流アプリケーションの研究に有用である。これらの細胞の分化および代謝プロファイルのレベルは、暴露の長さ、および筋芽細胞分化を誘導するために使用される培養物の組成に依存する。これらの方法は、マウス筋細胞代謝ex vivoの研究のための堅牢なシステムを提供する。重要なのは、生体内モデルとは異なり、ここで説明する方法は、高いレベルの再現性で拡張および研究できる細胞集団を提供する。

Introduction

多くの場合、全体的な代謝健康の指標として引用されているが、複数の研究は、高齢者のボディマス指数(BMI)が一貫して死亡率の高いリスクと関連付けられていないことを示しています。現在までに、この集団における死亡率の低下と一致することが示された唯一の因子は、筋肉^量1の増加である。筋肉組織は、体内のインスリン感受性細胞の最大の供給源の1つを表し、したがって、全体的な代謝恒常^性2の維持に重要である。運動による骨格筋組織の活性化は、局所インスリン感受性と全体的な代謝^健康3の両方の増加に関連している。生体内モデルでは、筋肉の生理学と統合された代謝に対する筋肉機能の影響を研究するために不可欠であるが、ミオチューブの一次培養は、動物研究の複雑さを軽減する扱いやすいシステムを提供する。

出生後の筋肉に由来する筋芽生性は、非常に再現性の高い方法で多数の治療と成長条件の影響を研究するために使用することができます。これは長い間認識されており、筋芽生性分離および培養のためのいくつかの方法が説明されています^4,5,6,7<....

Protocol

このプロトコルは、スクリプス研究の動物ケアガイドラインに従っています。

1. 筋肉組織移植の収集と処理

1. 解剖の前日、すべての解剖装置(鉗子、かみそり刃、はさみ)を殺菌し、必要なすべての媒体を準備する:リン酸緩衝生理食べ物(PBS)、MBめっき媒体(DMEMの12.5 mL、HAMS F12の12.5 mL、熱不活性化された胎児の20 mL)血清(FBS)、羊水培地サプリメント5mL、およびコーティング溶液(DMEMの24mL、HAMS F12の24mL、コラーゲン1.7mL、マトリゲル1mL)。
2. 解剖の日は、解剖する各筋肉のためのコーティング溶液で1 6cmの皿を塗ります。各プレートの表面に2mLのコーティング溶液を加え、表面に均一なコートを作成するために穏やかに振り、1時間4°Cでプレートをインキュベートします。
3. プレートからコーティング溶液を取り出し、ストック溶液に戻します。
   注:コーティング溶液は、最大6ヶ月間再利用することができ、4 °Cで保存する必要があります。
4. 2 mLのPBSでプレートを2回すすいで、バインドされていないコラーゲンとマトリゲルを除去します。
5. 解剖の間に37°C組織培養インキュベーターにプレートを置きます。
6. ビニール袋または滅菌15センチの皿に厚い吸収性紙の2-3枚を置くことによって湿った部....

Results

提供されたプロトコルのセクション1に従って、標準的な光顕微鏡の下で見える移植所から出てくる一次細胞を得るべきである(図2)。異種細胞集団は、各筋肉組織の切除から成長し、周囲に見られる。筋芽生は、小さく、丸く、明るい球として表示されます。プロトコルのセクション2に続いて、組織の移植から筋芽細胞の早期収穫が得られ、これは少数の細胞を含み、不均一になる(図3)。プロトコルのセクション3は、(トリプシンではなく)PBSで早期収穫を通過することを説明し、これはさらに培養するための筋芽生の比較的純粋な集団を提供する。プロトコルのセクション4に従って、さらなる実験操作のために完全に分化されたミオチューブが得られます。筋芽細胞の分化は通常4〜6日かかり、その間に細胞の形態は単一の円形球から細長い、融合された、長い多核繊維に変化する(図4)。プロトコルのセクション5に続いて、酸素消費量および細胞外酸性化

Discussion

骨格筋は、代謝恒常^性11の確立と維持のために不可欠である。筋肉生理学の研究は、特に人間の研究の場合には、個々の変動、ならびにサンプルを得ることの困難によって複雑である。培養された原発性筋管は、カルシウム恒常^性12、損傷した筋肉^組織5の再生、^運動13に応答する代謝変化を含む筋肉生理学の多くの特徴を要約することが示されている。糖尿病などの疾患に起因する代謝の変化¹⁴.マウスからの筋芽細胞および筋管の一次培養は、よく定義された遺伝子操作を有する筋肉細胞の研究を可能にし、ヒトの筋肉生検に由来する筋管の研究を補完^{する12,15 、16}.したがって、マウス原発性筋芽細胞および筋管の単離および培養のための方法は、筋肉細胞機能ex .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<ストロング>コーティング液:
DMEM	Gibco	10569010	使用前に必ずゲンタマイシン(1:1,000容量)を追加してください; 24 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	使用前に必ずゲンタマイシン(1:1,000容量)を追加してください; 24 mL
Collagen Life	Technologies	A1064401	1.7 mL
Matrigel	Fisher	CB40234A	1 mL
<強>めっき媒体:
DMEM	Gibco	10569010	使用前に必ずゲンタマイシン(1:1,000容量)を添加してください; 12.5 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	使用前に必ずゲンタマイシン(1:1,000体積)を添加してください; 12.5 mL
熱不活化 FBS	Life Technologies	16000044	20mL;通常のFBSとして購入でき、40°Cに置くことで熱不活性化できます。C ウォーターバス 20 分間
Amniomax	Life Technologies	12556023	5 mL
筋芽 培地:
DMEM	Gibco	10569010	使用前に必ずゲンタマイシン (1:1,000 容量) を追加; 17.5 mL
HAMS F12	ロンザ	12-615F	使用前に必ずゲンタマイシン (1:1,000 容量) を追加; 17.5 mL
加熱不活化FBS	Life Technologies	16000044	10 mL; 通常の FBS として購入でき、40 °C に入れることで熱不活化できます。20分間のCウォーターバス
Amniomax	Life Technologies	12556023	5 mL
Differentiation Media:
DMEM	Gibco	10569010	使用前に必ずゲンタマイシン(1:1,000容量)を追加してください; 24 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	使用前に必ずゲンタマイシン(1:1,000容量)を追加してください; 24 mL
ヒート不活化ウマ血清	Σ	H1138	1.5 mL
インスリン-セレン-トランスフェリン	ライフ テクノロジー	41400045	0.5 mL
<ストロング>その他の材料:
PBS	ギブコ	14040133
ゲンタマイシン	シグマ	G1397
TrypLE	ギブコ	12604013
DMSO	シグマ	472301	細胞を凍結するための筋芽細胞培地に 10% DMSO として調製
鉗子	任意の
かみそりの刃	任意の
はさみ	任意の
ワットマン紙	VWR	21427-648
60 mm プレート	VWR	734-2318
10 cm プレート	VWR	25382-428 (CS)
T25 フラ	スコ サーモフィッシャー	156367
T75 フラスコ	サーモフィッシャー	156499
遠心チューブ (15 mL)	BioPioneer	CNT-15
<ストロング>酸素消費率:
タツノオトシゴ XFe96 アナライザー	アジレント	タツノオトシゴ XFe96 アナライザー	酸素消費率を測定するために使用される器械は細胞外媒体の酸性化によって読み出
タツノオトシゴ XFe96 FluxPak	Agilent	102416-100	96井戸の版 XFe96 分析装置
タツノオトシゴ XF 細胞水戸のストレス テスト キット	アジレント	103015-100	供給者から購入することができます 一度 アッセイが確立される; いくつかの推奨事項は
、タツノオトシゴ XF パルミテート-BSA FAOの基質の下にリストされています	Agilent	102720-100	の部品は、アッセイが確立されると、他の供給者から購入することができます;いくつかの推奨事項は、
脂肪酸酸化の測定のための	パルミチン酸	シグマ	P5585-10G
脂肪酸酸化の測定のための	カルニチン	シグマ	C0283-5G
脂肪酸酸化の測定のための	エトモキシル	シグマ	E1905
BSA	Sigma	A7030	、脂肪酸酸化の測定に使用するための制御またはパルミチン酸との結合に使用されます