組織レベルの力学を制御するための準拠基板上のヒト胚性幹細胞コロニーの幾何学的パターン化

サマリー

細胞外マトリックスリガンドは、ポリアクリルアミドヒドロゲル上にパターン化することができ、準拠基板上の閉じ込められたコロニーにおけるヒト胚性幹細胞の培養を可能にする。この方法は、トラクション力顕微鏡と生化学アッセイと組み合わせて、組織形状、細胞発生力、および運命指定の相互作用を調べることができます。

要約

ヒト胚性幹細胞は、胚発生時の一次胚層形成に対応する細胞運命仕様の自己組織化パターンにより、インビトロでモルフォゲンに応答するユニークな能力を示す。したがって、これらの細胞は、初期の人間の発達を駆動するメカニズムを調べる強力なツールを表します。我々は、コロニーの幾何学と機械的環境の両方を制御する準拠基板上の閉じ込められたコロニーにヒト胚性幹細胞を培養する方法を開発した。胚発生の根にはこの方法の主な特徴は、細胞の付着を促進するために表面に細胞外マトリックスリガンドの定義されたパターンを有するポリアクリルアミドヒドロゲルを生成する能力である。これは、所望の幾何学的パターンを持つステンシルを製造し、これらのステンシルを使用してガラスカバーリップ上の細胞外マトリックスリガンドのパターンを作成し、重合中にポリアクリルアミドヒドロゲルにこれらのパターンを移すことによって達成される。この方法はまた牽引力顕微鏡と互換性があり、ユーザーが限られたコロニー内の細胞発生力の分布を測定し、マッピングすることを可能にする。標準的な生化学的アッセイと組み合わせることで、これらの測定値を使用して、初期のヒト開発時の運命の仕様と形態形成における機械的手がかりの役割を調べることができます。

概要

ヒト胚性幹細胞(HESC)は、再生医療や組織工学の応用に大きな期待を寄せています。これらの細胞の多能性の性質は、それらに任意の成人細胞タイプに分化する能力を与える。hESCの運命を特定の細胞型に導く上で大きな進歩がなされているが、組織全体や器官de novo^{1、2、3、4}を生成することは非常に困難なままである。 ⁵.これは、大部分は、ヒトの発達中にこれらの組織の形成を駆動するメカニズムの限られた理解に起因する。この知識のギャップを埋めるために、近年、胚幹細胞6、7、8、9を用いて初期胚とその後の発達段階をモデル化する方法が数多く出現^{している。 ,10,11,12,13}.

第1hESC^ライン14の導出直後に、HESCから形成された胚体体が3つの一次生殖^層6の細胞を自発的に産生することができることが実証された。しかし、胚体の大きさと形態に対する本質的な制御の欠如のために、生殖層の組織は有意に変化し、初期胚の組織と一致しなかった。さらに最近では、Warmflashらは、マイクロパターニングを介してガラス基板上のHESCのコロニーを閉じ込める方法を開発し、^{コロニー8}のサイズと形状に対する制御と一貫性を提供した。初期の開発における重要な形態原であるBMP4の存在下で、これらの限定コロニーは、一次胚芽層を表す運命に対する仕様の再現可能なパターンを自己組織化することが可能であった。これは、原発性生殖層が確立されるメカニズムを研究するための有用なモデルを提供したが、運命指定のパターンは、胚形成時に観察された組織および形態形成と正確に一致^{しなかった15。}初期胚発生のより忠実な要約は、マトリ^ゲル11の3次元細胞外マトリックス(ECM)にHESCを埋め込むことによって達成され、HESCが自己組織化し、モデル化する能力に関するこれまでで最も強力な証拠を提供した。胚発生の初期段階は生体内である。しかし、この方法は一貫性のない結果をもたらし、自己組織化と運命指定の根本的なメカニズムを明らかにするために使用できる多くのアッセイと互換性がありません。

これらの既存の方法とそれぞれの限界を考えると、我々は初期胚の細胞外環境をモデル化する条件下で定義された幾何学のhESCコロニーを再現可能に培養する方法を開発しようとした。これを達成するために、我々は、基板の機械的特性を制御するために、調整弾性のポリアクリルアミドヒドロゲルを使用しました。胃の胚に原子力顕微鏡を用いて、エピブラストの弾力性は数百個のパスカルから数キロパスカルまで及ぶことがわかった。そこで、hESCコロニーの基板として機能するために、この範囲で弾力性のあるポリアクリルアミドヒドロゲルの生成に焦点を当てました。我々は、コロニーの幾何学を堅牢に制御するために、ポリアクリルアミドヒドロ^ゲル7、9上でHESCを培養するための以前の方法を変更した。我々は、以前に報告^された16のように、マイクロファブリファリングステンシルを介してガラスカバーリップ上のECMリガンド、すなわちマトリゲルを最初にパターン化することによってこれを達成しました。その後、重合中にポリアクリルアミドヒドロゲルの表面にパターン化されたリガンドを移す新しい技術を設計した。ここで説明する方法は、所望の幾何学的パターンでシリコンウェーハを製造するためにフォトリソグラフィーを使用し、ポリジメチルシロキサン(PDMS)でこれらの幾何学的特徴のスタンプを作成し、これらのスタンプを使用してステンシルを生成することを含みます。最終的には、ガラスカバーの表面にリガンドのパターニングを可能にし、ポリアクリルアミドに転送します。

初期胚の機械的環境を要約することに加えて、ポリアクリルアミドにhESCコロニーを閉じ込め、我々の前の^方法9で報告したように、牽引力顕微鏡(TFM)を用いて細胞発生力の測定を可能にする。簡単に言えば、蛍光ビーズはポリアクリルアミドに埋め込まれ、受託マーカーとして使用することができる。細胞発生力は、パターン基板にHESCを播種した後のこれらのビーズの変位をイメージングすることによって計算される。さらに、得られた牽引力マップは、免疫染色などの従来のアッセイと組み合わせて、閉じ込められたhESCコロニーにおける細胞発生力の分布が下流シグナリングを調節または調節する方法を調べることができます。これらの方法は、現在見過ごされている初期の胚発生時に、機械的な力が細胞運命仕様のパターン化において重要な役割を果たしていることを明らかにすることを期待する。

プロトコル

HESCの使用に関してここに記載されているすべての方法は、カリフォルニア大学サンフランシスコ校のヒトゲームテ、胚および幹細胞研究(GESCR)委員会によって承認されています。

1. 幾何学的特徴を持つシリコンウェーハの準備

1. 目的のジオメトリ フィーチャを持つフォトマスクを作成します。コンピュータ支援の製図ソフトウェアを使用して、機能を設計します。負のフォトレジストで使用するには、機能を不透明にし、マスクの残りの部分を透明にします。
   注:直径18mmのカバーリップにパターニングする場合は、各実験条件の特徴を10 x 10 mmの領域にグループ化し、ステップ3で生成されたステンシルがカバースリップに収まるようにします。
2. 100 mm シリコンウエハに負のフォトレジストをスピンコートします。フォトレジストデータシートを使用して、スピンの速度と長さを決定し、100~250 μmのフィルム厚さを生成します。
   注: フィルムの厚さは、ステンシルの高さに対するパターンの幅の縦横比が可能な限り 1:1 に近くなるように調整する必要があります。ただし、100 μm の最小厚さは、より少ないものでも簡単に引き裂く繊細なステンシルを生成することをお勧めします。
3. 製品データシートに従ってフォトレジストを処理します。これは通常、ソフトベーク、マスクアライナーのフォトマスクによるUV露出、露出後のベーク、開発、およびハードベークを伴います。一例として、このプロトコルで使用されるウェーハを処理するために使用される手順を表1に概説する。
   注: シリコンウェーハは壊れやすいため、取り扱いには注意が必要です。一度生成されると、ウエハは損傷していない限り繰り返し使用することができます。

2. カバースリップの準備

1. 酸洗浄された「トップ」カバースリップの調製
   1. 直径18mm#1厚みをガラスペトリ皿に入れます。カバースリップの適切な数は、料理のサイズに依存します。100ミリメートルの皿のために、一度に50〜100カバースリップを準備します。このセクションの残りの部分を通して与えられた容積量は100のmm皿に相当する。
   2. ペトリ皿に1M HClの20 mLを追加し、そっと皿を振ってカバースリップを分散させます。すべてのカバーリップが水没していることを確認し、カバースリップの間から気泡を放出します。穏やかな揺れで室温で一晩インキュベートします。
      注意: HCl は酸性で腐食性があります。HCl を使用する場合は、注意が必要です。
   3. 料理からHClをデカント。20mLの超純水を加え、10分間ゆっくり振って洗い流し、水を捨て、合計5回の洗浄を繰り返します。
   4. 最終洗浄を廃棄した後、100%エタノールの20 mLを皿に加えます。鉗子を使用して、カバースリップを個別に取り外し、2枚のフィルターペーパーの間に並べて乾燥させます。
   5. 乾燥したカバーリップを密閉容器に保管します。酸洗浄カバーリップは、事前に調製し、ほこりのない状態で1ヶ月以上保存することができます。
2. グルタルアルデヒド活性化「ボトム」カバースリップの調製
   注: 追加の詳細^{については、}前の方法を参照してください^7,9.
   1. 直径18mm#1厚みをペトリ皿に入れます。
   2. ペトリ皿に0.2 M HClの20 mLを追加し、そっと皿を振ってカバースリップを分散させます。すべてのカバーリップが水没していることを確認し、カバースリップの間から気泡を放出します。穏やかな揺れで室温で一晩インキュベートします。
   3. 料理からHClをデカント。20mLの超純水を加え、10分間ゆっくり振って洗い流し、水を捨て、合計5回の洗浄を繰り返します。
   4. 最後の洗浄を廃棄した後、0.1 M NaOHの20 mLを追加し、カバースリップを分散し、水没するために穏やかに振ります。室温で1時間の穏やかな揺れでインキュベートします。
   5. 料理からデカントナオ。20mLの超純水を加え、10分間ゆっくり振って洗い流し、水を捨て、合計5回の洗浄を繰り返します。
   6. 最後の洗浄を廃棄した後、3-アミノプロピルトリメトキシシランの1:200希釈の20 mLを超純水で加え、ゆっくりと振ってカバースリップを分散させ、水没させます。室温で1時間または一晩振って、穏やかな振り付けでインキュベートします。
      注意:3-アミノプロピルトリメトキシシランは可燃性であり、皮膚刺激を引き起こす可能性があります。取扱い、適切なPPEを着用し、現地の処分規則に従って廃棄物を廃棄する。
   7. 希釈した3-アミノプロピルトリメトキシシラン溶液を皿からデカントする。20 mLの超純水を加え、10分間ゆっくり振って洗い流し、水を捨て、合計5回の洗浄を繰り返します。先に進む前にすべての 3- アミノプロピルトリメオキシシランを削除することが重要です。.
   8. 最終洗浄を廃棄した後、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に70%グルタルアルデヒドの1:140希釈の20 mLを加え、カバーリップを分散して水没させるために穏やかに振ります。室温で1時間または一晩振って、穏やかな振り付けでインキュベートします。
      注意:70%グルタルアルデヒドは有毒であり、皮膚刺激を引き起こす可能性があります。取扱い、適切なPPEを着用し、現地の処分規則に従って廃棄物を廃棄する。
   9. 希釈されたグルタルアルデヒド溶液を皿からデカントします。20mLの超純水を加え、10分間ゆっくり振って洗い流し、水を捨て、合計5回の洗浄を繰り返します。
   10. 最終洗浄を廃棄した後、100%エタノールの20 mLを追加します。鉗子を使用して、カバースリップを個別に取り外し、2枚のフィルターペーパーの間に並べて乾燥させます。
   11. 乾燥したカバーリップを密閉容器に保管します。グルタルアルデヒド活性化カバースリップは、事前に調製し、最大6ヶ月間保存することができます。

3. ECMリガンドをパターン化するためのステンシルの生成

1. ポリジメチルシロキサン(PDMS)中間スタンプの生成
   1. PDMSベースとPDMS硬化剤を10:1比で混合します。よく混ぜる。
      注:PDMSの最初のアプリケーションのために、100ミリメートルの皿を埋めるためにPDMSの約100グラムを準備します。その後のアプリケーションでは、シリコンウェーハの特徴が配置されている皿の中心からのみPDMSを取り外し、20〜30gの新しいPDMSを準備します。
   2. 30〜60分間、またはすべての気泡が除去されるまで、デシケータでPDMS混合物を脱気します。
   3. ステップ1から修正されたシリコンウェーハをプラスチック製の100mm皿に入れます。ゆっくりと均等にウェーハの表面にPDMS混合物を注ぎます。作業面の皿をタップして、ウエハの表面から気泡を放出します。
   4. PDMS混合物を10分間ウェーハの上に注いだり、すべての気泡が取り除かれるか、またはPDMSの表面に来るまでドガ。
   5. 2時間70°CでPDMSを焼く. 室温に冷却することができます。
   6. メスまたはボックスカッターを使用して、幾何学的特徴を含む皿の中心からPDMSのセクションを切り取ります。
   7. PDMSを約10 x 10 mmの正方形に切り、それぞれが単一の実験条件の特徴を含む。これらは、プロトコルの後続のステップで「スタンプ」と呼ばれます。
2. PDMS のフラット スラブの生成
   1. PDMSベースとPDMS硬化剤を8:1比で混合します。使用する100mm皿ごとに約20gを用意します。よく混ぜる。
   2. 30〜60分間、またはすべての気泡が除去されるまで、デシケータでPDMS混合物を脱気します。
   3. ゆっくりと均等にきれいな100ミリメートルの皿にPDMSを注ぎます。作業面の皿をタップして、気泡を放出します。
   4. 2時間70°CでPDMSを焼く. 室温に冷却することができます。
   5. 皿からPDMSを取り除きます。皿の底に接触していたPDMSの表面が上を向いているのを反転します。
   6. ステップ 3.1 で生成されたスタンプごとに、PDMS の 15 x 15 mm 四方を切ります。これらは、プロトコルの後続のステップで「フラットスラブ」と呼ばれます。
3. ステンシルの生成
   1. 150 mm 皿の蓋に PDMS の平らなスラブを配置するか、その他の平らな面を配置して取り扱いを容易にします。スラブ間の十分な間隔を確保します(例えば、150 mm皿の場合は、9つの平らなスラブを均等な間隔で配置します)。
   2. ステップ 3.1 で生成された各スタンプを PDMS のフラット スラブに反転し、スタンプ上のフィーチャが PDMS のフラット スラブと接触するようにします。鉗子でスタンプの上部をそっと押して、接触を確実にします。
   3. PDMSスタンプ/スラブを持つ蓋を皿のベースに持ち、蓋が斜めに置きまわるのを注意深く支えます。これは次のステップの紫外線硬化性ポリマーのウィッキングを助ける。
   4. 各スタンプ/スラブペアの上部インターフェースにUV硬化ポリマーを小さな滴を置きます。ポリマーは、重力によって支援され、表面張力によって2つの間に邪悪になります。
      注:多くの異なるUV硬化性ポリマーは、このプロトコルで動作する可能性があります。私たちは、次の特性のためにノルランド光学接着剤74を選択しました: i) 紫外線への露出時の高速硬化, ii) 硬化時にPDMSスタンプから簡単に取り外す, iii) ガラスカバーへの堅牢な接着は、手動圧力でスリップします.
   5. ポリマーが完全に邪悪になったら、作業面にスタンプ/スラブペアで蓋を平らに置きます。各スタンプ/スラブインターフェイスの残りの3つの側面のそれぞれにUV硬化性ポリマーを小さな滴を置きます。
   6. 200 μL ピペットチップを使用して、スタンプ/スラブインターフェイスのエッジの周りにポリマーの滴を接続します。これにより、ステップ 4 でリガンド ソリューションを保持する境界線が作成されます。
      注: スタンプの端の周りにポリマーを加工する場合は注意が必要です。スタンプ/スラブインターフェイスが破壊されると、ポリマーはフィーチャーの下にウィックし、ステンシルが正しく形成されません。
   7. スタンプ/スラブペアをUV殺菌ボックスに慎重に入れます。無菌の「Str」電源設定を使用し、10分間露出します。
   8. UV殺菌ボックスからスタンプ/スラブペアを取り外します。2組の鉗子を使用して、UV硬化性ポリマーから形成された平らなスラブとステンシルを押しながら、PDMSスタンプを静かに取り外します。
   9. 鉗子を使用して、ステンシルを慎重に取り外し、PDMSの平らなスラブに接触していた表面が上を向くように反転します。
      注:ステンシルはデリケートです。特に最初にPDMSから取り外す間は、引き裂かないように注意してください。
   10. 反転したステンシルをUV殺菌ボックスに戻します。無菌の「Str」電源設定を使用し、3分間露出します。

4. カバースリップにECMリガンドをパターン化する

1. 酸洗浄カバースリップにステンシルを押す
   1. ステンシルごとに酸洗ったカバースリップを1枚の洗浄済みの実験室フィルムの上に置きます。
   2. 鉗子を使用して、慎重に各ステンシル、フラットサイドダウン、酸洗いカバースリップの上に置きます。フィーチャがカバースリップの中央に配置されます。
   3. 各ステンシルの上に小さな実験室フィルムを置きます。ステンシルとカバースリップの間に強い接触を作成するために、ステンシルをしっかりと均等に押し下げます。
      注:これは重要なステップです!ステンシルの表面全体をしっかりと押します。十分な接触が作成されないと、リガンド溶液がステンシルとカバースリップの間に漏れ出し、パターニングが失敗します。オプション:ステンシルとカバースリップとの間の十分な接触を確認するために、各ステンシルの表面に超純粋な滅菌水のピペット100 μLをピペットし、室温でインキュベートする。1時間後、漏れが起きないか確認します。正常に接着されたステンシルから水を吸引し、進みます。
2. ステンシルカバーの表面を洗浄するプラズマは、親水性を高めるためにスリップ
   1. ステンシルでカバースリップをプラズマクリーナーに入します。30sの高出力プラズマを適用します。
3. ECMリガンド溶液の調製
   注:可能であれば、すべての後続の手順は、滅菌条件で完了する必要があります。
   1. 無菌100mM HEPES、100 mM NaCl、pH 8.0溶液を氷の上に置きます。氷が冷えたら、マトリゲルとコラーゲンを加えて、それぞれ225 μg/mLと25 μg/mLの濃度を達成します。オプション: トラブルシューティングまたはリガンドビジュアライゼーションの場合は、リガンド溶液に蛍光タグ付きリガンドを含めます。
      1. 注: この方法では、異なる ECM リガンドを使用できます。異なるリガンドの場合、理想的な濃度、インキュベーション時間、およびインキュベーション温度を決定するために追加の最適化が必要になる場合があります。詳細については、ディスカッション セクションを参照してください。
   2. 各ステンシルの表面にリガンド溶液をピペット。10 x 10 mm の正方形スタンプから作成されたステンシルの場合は、ステンシルごとに 100 μL を適用します。
   3. ステンシル フィーチャの気泡を確認します。必要に応じて、細かい鉗子または2 μLピペットチップを使用して、フィーチャーから気泡を除去します。
      注:これは重要なステップです!気泡がカバースリップの表面に閉じ込められたままの場合、リガンドは表面に吸入せず、結果として生じるパターンは不完全になります。
   4. ステンシルカバーをリガンドで皿に入れ、実験室フィルムで包み、一晩4°Cでインキュベートします。

5. リガンドをポリアクリルアミドゲルに移す

1. 各カバースリップからリガンド溶液とステンシルを除去する
   1. ステンシルの表面からリガンド溶液を吸引します。リガンド溶液は4°Cで回収・保存し、最大1ヶ月間再利用できます。
   2. 鉗子を使用して、洗い出す無菌PBSを含む皿にステンシルでカバースリップを簡単に沈める。
   3. 簡単に洗うために無菌PBSの第二の皿にステンシルでカバースリップを浸します。
   4. カバースリップの表面からステンシルを取り外します。カバースリップを壊さない場合は注意してください。
   5. カバースリップを超純粋な滅菌水を含む皿に簡単に沈め、PBSの洗い流しから塩を取り除きます。余分な水を拭くために繊細なタスクワイプにカバースリップの端をタップします。
   6. 窒素などの不活性ガスの下でカバースリップを乾燥させます。カバースリップの下側にマークを付けて、この時点から向きを前方に追跡します。パターン化された側面を上向きに保つように注意してください。
   7. ステンシル化されたカバースリップごとに、手順 5.1.1 から 5.1.6 を繰り返します。
2. パターンカバースリップを使用したポリアクリルアミドヒドロゲルの製造
   注:追加の^詳細7、9すべてのキャップホルダー、チューブ、およびスペーサーを殺菌するために使用されるすべてのキャップホルダー、チューブ、およびスペーサーを一晩10%漂白剤で洗浄し、漂白剤を除去するために少なくとも5回水で洗い流し、前の方法を参照してください。70%のエタノールで簡単に洗浄します。使用前に乾燥させる生殖不能のバイオセーフティキャビネットに繊細なタスクワイプにすべての部分を置きます。
   1. 所望のヒドロゲル弾性を得るためにポリアクリルアミド溶液を調製する(表2)。蛍光微小球とペルスルフェートカリウム(PPS)を除くすべての成分を一緒に混合します。
      注:毎回新鮮な1%のペルサルフェート溶液を準備します。
   2. ポリアクリルアミド溶液、微小球、PPSを真空下の別々のチューブで30分間脱気します。
   3. パターン化されたカバースリップごとに、上部に配置されたスペーサー(外径18mm、内径14mm)で、グルタルアルデヒド活性「ボトム」カバースリップを準備します。
   4. 脱気後、簡単に微小球を超音波処理し、ポリアクリルアミド溶液に適切なボリュームを追加します。上下にピペッティングして混ぜ合わせ、気泡を発生させないように注意してください。簡単に超音波。
   5. ポリアクリルアミド溶液に適切なPPSのボリュームを追加します。ピペット上下に液を混ぜて、気泡を導入しないように注意してください。
      注:PPSを追加した後、ポリアクリルアミドが重合する前に、ステップ5.2.6から5.2.11を完了するために迅速に作業します。
   6. ピペット75-150 μL(スペーサーの厚さに応じて)を各グルタルアルデヒド活性化カバースリップの中心に。
   7. 鉗子を使用して、パターン化されたリガンドがポリアクリルアミド溶液に直面するように、各グルタルデヒド活性化カバースリップにポリアクリルアミドとスペーサーを置きます。十分なポリアクリルアミド溶液を添加した場合、表面張力は2つのカバーリップの間にポリアクリルアミドをウィックし、気泡が存在しません。
   8. 各ポリアクリルアミド「サンドイッチ」をピックアップし、慎重に余分なポリアクリルアミド溶液をウィックする繊細なタスクワイプに側面に触れます。
   9. 各ポリアクリルアミド「サンドイッチ」を15mL円錐形底管と互換性のあるねじ付きキャップホルダーに慎重に入れます。向きは、グルタルアルデヒドカバースリップの底部がキャップホルダーの底部に接触し、パターン化されたカバースリップが上部にあるようなものでなければなりません。
   10. 各キャップホルダーに15mLの円錐形底管をねじ込み、ポリアクリルアミド「サンドイッチ」を所定の位置に保持します。チューブは漏れを防ぐためにタイトにする必要がありますが、オーバー締め付けやカバースリップを割らないように注意してください。
   11. 室温で10分間200 x gのスイングバケツの管のポリアクリルアミド「サンドイッチ」を遠心分離します。遠心分離機からチューブを取り外し、チューブラックに入れ、完全な重合を確保するためにさらに50分間向きを維持します。蛍光微小球の漂白を防ぐために箔で覆ったままにしておきます。
       注: このメソッドを使用して TFM を実行する場合は、遠心分離が重要です。遠心力は、すべての微小球を単一の平面に移動し、最終的にはヒドロゲルの表面のすぐ下になります。これは、セル生成の牽引応力の計算に使用される微小球変位のイメージングに最適です。TFMを実行しない場合、微小球はポリアクリルアミド溶液から取り除くことができ、重合は遠心分離なしでベンチトップで起こりうる。
   12. 重合されたポリアクリルアミド「サンドイッチ」をチューブから取り除き、100mmの皿にPBSに沈みます。実験室用フィルムで包み、室温で3時間、または4°Cで一晩インキュベートします。
3. 播種細胞用パターンゲルの調製
   1. メスと鉗子を使用して、PBSに沈んだままの間、パターン化されたカバースリップとスペーサーをポリアクリルアミド「サンドイッチ」から慎重に取り除きます。パターン化されたリガンドは、重合中にポリアクリルアミドに移され、カバースリップを取り除いた後に残ります。ポリアクリルアミドゲルは、グルタルアルデヒド活性化カバースリップに付着したままになります。
      注:これは重要なステップです!ポリアクリルアミドは、カバースリップを除去しながらPBSに沈めなければならないか、リガンドパターンが破壊されます。
   2. 各カバースリップをパターン化されたポリアクリルアミドをキャップホルダーに入します。カバースリップの上と、スペーサーが置かれたポリアクリルアミドの周りにガスケット(外径18mm、内径14mm)を置きます。キャップホルダーに15mmのコニカルボトムチューブをねじ込み、下部にパターン化されたポリアクリルアミドで井戸を形成します。これらのアセンブリは容易な処理のための標準的な12ウェル版の井戸に合う。
   3. ウェルアセンブリに500 μLのPBSを加えて各ゲルを洗浄します。室温で10分間、穏やかな揺れでインキュベートします。PBS を取り外し、合計 3 回の洗い流しを 2 回繰り返します。
   4. 最終的なPBS洗浄の後、500 μLのノックアウトDMEM培温をゲルに加え、一晩37°Cでインキュベートします。ゲルは、細胞を播種する前に最大5日間培った培養物で37°Cに保つことができます。
   5. 細胞を播種する前日に、完全なKSR培養物のノックアウト-DMEMを交換し、一晩37°Cでインキュベートする。

6. パターンゲル上のHESCの培養

注:TFM後の免疫染色のサンプルを修正する場合は、細胞を播種する前に、ストレスのない微小球位置の画像を撮ります。この場合、蛍光タグ付きリガンドは、種まき前に細胞の最終的な位置が知られ、それらの領域で微小球を画像化できるように、ステップ4.3.1で使用する必要があります。

1. 前述^の9のようにパターン化されたポリアクリルアミドゲルに播種する前に、条件付きKSR培養物でマトリゲルコーティングされたプレート上で調製されたストックhESC培養および二次フィーダーフリー培養物を維持する。
   注:4 ng/mL基本線維芽細胞増殖因子(bFGF)を補充したKSR培地中に照射マウス胚線維芽細胞を培養することにより、条件付きKSR培地を生成する。24 時間ごとにメディアを収集して交換します。
2. HESC からメディアを吸引します。ノックアウトDMEMメディアで簡単に洗浄します。10 μM Y27632(Rhoキナーゼ阻害剤)を添加した0.05%トリプシン-EDTAを加え、37°Cで5〜10分間インキュベートする。
3. トリプシンを阻害するために血清で培った培体を追加します。ゆっくりとメディアを吸引し、細胞を除去するために皿の上にピペット。ピペッティングを緩やかに続けて、すべてのセルを削除し、セル クラスタを単一のセルに分離します。
4. 細胞懸濁液と遠心分離機を200 x gで3分間回収します。
5. 上清を吸引し、洗浄するKSRメディアの同等のボリュームでペレットを再中断します。遠心分離機 200 x gで 3 分。
6. 上清を吸引し、10 ng/mL bFGFおよび10 μM Y27632を補充した条件付きKSR培中のペレットを再中断する。
7. 血球計で細胞を数え、細胞懸濁液をmL当たり30万細胞の濃度に調整する。各パターンゲル(ゲル当たり150,000細胞)に細胞懸濁液のピペット500μL。
8. 播種後3時間、ピペットを使用して各ゲルからメディアを慎重に吸引し、10 ng/mL bFGFおよび10 μM Y27632を補充した新鮮な条件付きKSR培ならびにを交換する。これは、ポリアクリルアミドのパターン化された領域に付着しなかった余分な細胞を除去する。
   注:これは重要なステップです!この段階では、細胞はパターン化されたリガンドに緩やかに付着する。セルを切り離さない場合は、メディアをスワップする場合は注意が必要です。後続の手順では、各メディア スワップに対して均等な注意を払う必要があります。
9. 播種後24時間、ピペットを使用してメディアを注意深く吸引し、10 ng/mL bFGFおよび5 μM Y27632を補充した条件付きKSR培ブレンと交換する。
10. 播種後48時間、ピペットを使用して慎重にメディアを吸引し、10 ng/mL bFGFを補充した条件付きKSRメディアと交換する。これにより、培剤からRhoキナーゼ阻害剤が除去され、実験は播種後72時間の翌日に開始することができる。

7. TFMの実行

1. 必要に応じて、所望の実験条件下で前述^の9としてTFMを実行する。
2. ストレスのない微小球位置を細胞の播種前に画像化した場合は、ストレスを受けた微小球位置を取った後に細胞を固定し、免疫染色を行い、高い牽引力と低い牽引力の領域に対する目的のタンパク質の局在化を決定する。

結果

準拠基板上の制御された幾何学のコロニーでHESCを培養しようとする主な課題は、基板の表面にECM-リガンドの均質なパターンを生成することです。この方法で提示される戦略は、最初にガラスカバースリップの表面に所望のパターンを生成し、その後、ゲルの重合中にポリアクリルアミドヒドロゲルの表面にそのパターンを転送することを含みます(図1)A.したがって、ヒドロゲルの重合およびパターンの転写に進む前に、ガラスカバースリップの表面に所望のパターンが正常に作成されることを確認することが重要である(図1B)。ポリアクリルアミドに移された蛍光リガンドパターンのイメージングに基づいて、リガンドはポリアクリルアミドの表面の単一の平面にのみ存在するように見えるが、我々はこの層の厚さを正確に特徴付けなかった。ガラスカバースリップのパターン生成に続いて観察される2つの一般的なタイプの欠陥があり、それぞれに独自のエラー...

ディスカッション

長く詳細なプロトコルを簡素化するために、この方法は、1)ガラスカバースリップ上のECMリガンドのパターンを生成する、2)ゲルの重合時にポリアクリルアミドヒドロゲルにパターンを移す、および3)上のhESCのシードという3つの重要な段階で構成されています。パターン化されたヒドロゲル。これらの 3 つの段階のそれぞれで考慮する必要がある重要な手順があります。ガラスカバースリップに高忠実度のパターンを生成するためには、ステンシルをカバースリップにしっかりと押し付けてリガンド溶液の漏れを防ぐ必要があり、ステンシルの表面にリガンド溶液を追加した後、すべての気泡を除去する必要があります(図 1C)。リガンド溶液がカバースリップとの接触不良のためにステンシルを通って漏出した場合、リガンドはポリアクリルアミドヒドロゲルの全表面に移され、hESCは所望のコロニー形状に限定されない(図4C)。パターン化されたリガンドをポリアクリルアミドに移す際の最も重要なステップは、すべて...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.05% トリプシン	Gibco	25300054
100 mm ガラス ペトリ皿	フィッシャー サイエンティフィック	08-747B
100 mm プラスチック ペトリ ディッシュ	ッシャー サイエンティフィ	ック FB0875712
15 mL 円錐底チューブ	コーニング	352095
150 mm プラスチック ペトリ ディッシュ	ッシャー サイエンティフィック	FB0875714
18 mm直径 #1 カバーガラス	Thermo Scientific	18CIR-1
2% bisacrylamide	Bio-Rad	161-0142
3-aminopropyltrimethoxysilane	ACROS Organics	313251000
40% アクリルアミド	Bio-Rad	161-0140
アルミ箔	Fisher Scientific	01-213-100
塩基性線維芽細胞成長因子	Sigma-Aldrich	F0291
漂白剤	Clorox	N/A
遠心分離機 スイングバケット付き	エッペンドルフ	22623508	モデル: 5804 R
コラーゲン	コーニング	354236
デシケーター	フィッシャー・サイエンティフィック	08-642-7
エタノール	フィッシャー・サイエンティフィ	AC615095000
胎児ウシ血清	Gibco	16000044
蛍光マイクロスフェア	サーモサイエンティフィック	F8821
鉗子(カバースリップ用)	フィッシャーサイエンティフィック	16-100-122
鉗子(ウエハー用)	フィッシャーサイエンティフィック	17-467-328
ゲルホルダー	N/A	N/A	ゲルホルダーはカスタム3Dプリントで、CAD図面はご要望に応じてご利用いただけます
グルタルアルデヒド	フィッシャーサイエンティフィ	50-261-94
HEPES	サーモサイエンティフィック	J16926A1
ホットプレート	フィッシャーサイエンティフィック	HP88854100
塩酸	フィッシャーサイエンティフィック	A144S-500
イソプロピルアルコール	フィッシャーサイエンティフィ	A416-500
キムワイプ (デリケートタスクワイプ)	Kimberly-Clark Professional	34120
ノックアウト血清交換	Gibco	10828028
Knockout-DMEM	Gibco	10829018
Mask aligner (フォトリソグラフィー用)	Karl Suss America, Inc.	カール・サス MJB3 マスクアライナー
マトリゲル	コーニング	354277
牽引力用顕微鏡	ニコン	N/A	モデル:エクリプス TE200 U
電動ポジショニングステージ	Prior Scientific	N/A	モデル:HLD117
窒素ガス	エアガス	NI 250
ノーランド 光学接着剤 74 (UV硬化型ポリマー)	ノーランド製品	NOA 74
Oven	Thermo Scientific	PR305225G
Parafilm (laboratory film)	Fisher Scientific	13-374-12
PDMS (Sylgard 184)	Fisher Scientific	NC9285739
Photomask	CAD/Art Services, Inc.	N/A	フォトマスクはカスタムメイドです。ご要望に応じて利用可能なデザインのCAD図面
プラズマクリーナー	フィッシャーサイエンティフィック	NC9332171
ガスケット用プラスチック	マリアンシカゴ	HT6135
スペーサー用プラスチック	TAPプラスチック	N / A	ポリカーボネートシート、.01インチ厚
塩化カリウム(PBS用)	フィッシャーサイエンティフィック	P217-500
リン酸カリウム一塩基性(PBS製造用)	フィッシャーサイエンティフィック	P285-500
過硫酸ポタッシウム	ACROS有機	424185000
メス	ッシャーサイエンティフィック	14-840-00
シリコンウェーハ	電子顕微鏡科学	71893-06	タイプP、3インチ、シリコンウェーハ
塩化ナトリウム(PBS製造用)	フィッシャーサイエンティフィック	S271-1
水酸化ナトリウム	フィッシャー・サイエンティフィック	S318-100
リン酸ナトリウム二塩基性二水和物(PBS製造用)	フィッシャー・サイエンティフィック	S472-500
SU8-3050 フォトレジスト	マイクロケム	SU8-3000
SU8-Developer	MicroChem	Y020100
TEMED	Bio-Rad	161-0800
UV 滅菌ボックス	Bio-Rad	N/A	Bio-Rad GS Gene Linker UV Chamber
Y27632 (Rho kinase inhibitor)	StemCell Technologies	72304