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方法論記事

異なる均質化法を通じてマウス脳/脊髄から取り出された複数の細胞型の同時フロー細胞特性評価

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DOI：

10.3791/60335

⸱

2019年11月19日

 ,  ,  , 
1Dana-Farber/Boston Children's Cancer and Blood Disorders Center, 2Harvard Medical School

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

マウスの脳や脊髄から取り出した異なる細胞の種類を同時に同定するためのフローサイトメトリー法を提示する。この方法は、神経変性疾患における純粋な細胞集団を単離または特徴付けたり、ウイルスベクターまたはナノ粒子の生体内投与を標的とする細胞の程度を定量化するために利用され得る。

要約

ウイルスベクターおよびナノマテリアル科学の最近の進歩は、中枢神経系(CNS)を調査または操作するための新しい最先端のアプローチの道を開きました。しかし、これらの技術のさらなる最適化は、体内のウイルスベクターまたはナノ粒子の投与におけるCNSおよび細胞特異的ターゲティングの程度の迅速かつ合理化的な決定を可能にする方法から利益を得るであろう。ここでは、フローサイトメトリーの高スループットと多重化機能を利用して、マウス脳または脊髄から分離された異なる細胞サブタイプ、すなわちミクログリア/マクロファージ、リンパ球、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ニューロンおよび内皮細胞を簡単に定量することを可能にするプロトコルを提示する。このアプローチを適用して、細胞収率、生存率、組成の観点から2つの組織均質化方法間の重要な違いを強調する。これにより、対象のセルの種類と特定のアプリケーションに応じて最適な方法を選択するようにユーザーに指示できます。この方法は、組織が単細胞懸濁液を生成するために均質化されているので、解剖学的分布の分析には適さない。しかし、それは生存可能な細胞と組み合わせることができ、それは、純粋な細胞集団に由来する一次培養の確立から、神経変性疾患の文脈でよく定義された細胞サブタイプに対する遺伝子発現解析や生化学的または機能的アッセイに至るまで、神経科学者の手でツールのレパートリーを拡大することができるいくつかのアプリケーションのための道を開く、細胞ソートと組み合わせることができます。

概要

遺伝子および薬物送達技術(ウイルスベクターやナノ粒子など)は、神経変性疾患で変化した特定の分子経路に関するより良い洞察を得るために、および革新的な治療アプローチの開発のために適用することができる強力なツールとなっています。これらのツールの最適化は、定量化に依存します: (1) 管理の異なる経路上の CNS の浸透の程度と (2) 特定の細胞集団のターゲティング.組織学的解析は、通常、異なるCNS領域および異なる細胞型にわたって蛍光レポーター遺伝子または蛍光タグ付きナノ粒子を可視化するために適用され、特定の細胞マーカー4、5に対する免疫染色によって同定される。このアプローチは、投与された遺伝子または薬物送達ツールの生体分布に関する貴重な情報を提供しますが、(1)組織固定、凍結保存またはパラフィン埋め込みおよびスライスが必要なため、この技術は時間がかかり、手間がかかがあります。(2)特定の細胞マーカーの染色は、時には抗原検索を必要とする;(3)蛍光顕微鏡による取得は、通常、同じ実験内の限られた数の異なるマーカーの分析を可能にする。(4)画像処理により、目的の信号を適切に定量化できるようにする。

フローサイトメトリーは、非常に特異的な蛍光マーカーを利用して、表面または細胞内抗原の発現に基づいて細胞懸濁液中の異なる細胞表現型の迅速な定量的評価を可能にするだけでなく、機能的測定(例えば、アポトーシスの速度、増殖、細胞周期分析など)を可能にする広く使用されている技術となっています。蛍光活性化細胞選別による細胞の物理的分離も可能であり、さらなる下流用途(例えば、細胞培養、RNAseq、生化学的分析など)6、7、8。

組織均質化は、信頼性が高く再現性のある下流フローサイトメトリック評価を可能にするために、単一細胞懸濁液を得るために必要な重要なステップです。成人脳組織均質化には、主にミクログリア細胞9、10、11を単離することを目的として、異なる方法が記載されている。それらは、(1)ダウンスホモジナイザー(DH)を介して粉砕またはせん断力を使用してニッチから細胞を分離し、比較的均質化された単一細胞懸濁液を形成する機械的解離の2つの主要なカテゴリーに分類することができ、 (2)酵素消化は、トリプシンまたはパパインなどのタンパク質分解酵素の存在下で37°Cでのミンチ組織塊のインキュベーションに依存し、細胞外マトリックスの分解を支持し、かなり均質化された細胞懸濁液12を作成する。

どの方法が利用されているかに関係なく、組織均質化後に精製工程を行い、密度勾配の遠心分離を通してミエリンを除去するか、磁気選択9、12を経下流アプリケーションに移すことをお勧めします。

ここでは、パパイン消化(PD)に基づく組織処理方法を説明し、続いて密度勾配を精製し、マウス脳または脊髄から生存可能な異種細胞懸濁液を時間感受性の方法で得るように最適化し、フローサイトメトリーに適した。さらに、9色のフローサイトメトリーパネルと、我々は、異なるCNS集団、生死細胞または緑色蛍光タンパク質やロダミン色素などの蛍光レポーターのための陽性の同時判別を可能にするために実験室で採用したゲーティング戦略を説明します。このフローサイトメトリック分析を適用することにより、異なる細胞の生存率および異なる細胞タイプの収率の保存の観点から、組織処理の異なる方法、すなわちPD対DHを比較することができる。

本明細書で提供される詳細は、目的の特定の細胞タイプと下流分析(例えば、温度感受性)に基づいて、フローサイトメトリーパネルで使用する均質化プロトコルと抗体の組み合わせに関する決定を指示することができますアプリケーション、特定の蛍光マーカーの追跡、インビトロ培養、機能分析)。

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プロトコル

ここで説明するすべての方法は、ダナ・ファーバー癌研究所(プロトコル番号16-024)の制度動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認されています。

1. 実験に必要なソリューションの準備

  1. 10x HBSSを滅菌水で希釈して、1xハンクのバランスのとれた塩溶液(HBSS)を調製します。氷の上で溶液を事前に冷やします。各サンプルには少なくとも25mLの溶液が必要です。
  2. 10x滅菌HBSS 1:10と密度勾配培地(すなわち、Percoll)を混合して等張性パーコール溶液(IPS)を調製します。氷の上で冷やす前に。
    注:IPSは4 °Cで最大30日間保存することができます。
  3. フローサイトメトリー(FACS)ブロッキング(BL)溶液(1%ウシ血清アルブミン[BSA]、リン酸緩衝生理食塩水[PBS]中の5%ウシウシ血清[FBS])を調製する。氷の上で冷やす前に。

2. 心内灌流と組織解剖による動物安楽死

注:8週齢のC57BL/6Jマウスは、どちらかの性別で、実験に用いた。PBS溶液による灌流は、組織消化を進める前に、臓器からの血液汚染を排除するために行われる。

  1. ケタミン/キシラジン(90−200 mg/kgケタミン、10 mg/kgキシラジン)の混合物を使用してマウスを麻酔する。マウスを背面に置き、各四肢をサポートまでテープで留める。離脱反射を確認して、麻酔の十分な深さを確認します。
  2. 胸骨を露出させるために胸部入口のレベルで中線の皮膚切開を行う。鉗子を使用して胸骨の先端をつかみ、リブケージの両側に1cmの切開を行います。最後に横隔膜を切り取り、胸骨を広く開いて心臓を可視化します。
  3. 鉗子を使用して心臓を右心室で穏やかにつかみ、中線まで持ち上げて胸から少し出す。
  4. 左心室の先端、大直田に向かって23Gの蝶の針を挿入し、しっかりと保持します。
  5. 1x PBS で灌流を開始します。はさみを使用して右のオーリクルを貫通し、排煙が循環を終了できるようにします。PBS の流量を 3 mL/min に設定し、1x PBS の少なくとも 15 mL でパーフューズを設定して、組織が明確であることを確認します。
    注:肝臓と腸間膜血管のブランチングは良好な灌流の兆候です。必要に応じて、心臓から出る体液が血液を取り除くまで、予備の体積を増やすことができ、その時点でフラッシュラインを停止できる。
  6. 灌流後、脊髄から脳を切り離し、はさみと鉗子で頭蓋骨から脳を取り除く。解剖中の可視性と制御を高め、毛髪汚染物質を持ち越さないようにするために毛皮を取り外します。PBSで満たされた3 mLシリンジを使用して、脊髄をカラムから洗い流します。
  7. 氷冷1x HBSSの2 mLをプレフィルした6ウェルマルチウェルプレートの井戸に各組織を移し、消化するまで氷の上に保ちます。
  8. 脳と脊髄を縦線に沿って2つの半分に分けます。
    注:各組織の半分が均質化され(以下のセクションを参照)、フローサイトメトリック解析が可能です。残りの半分は、代替分析のための異なる処理に割り当てることができます(例えば、組織学のためのパラホルムアルデヒド固定溶液に浸漬)。

3. 脳と脊髄の酵素消化

注:このセクションで説明するボリュームは、半分の脳または脊髄の消化のために十分です。

  1. はさみを使用して、組織を1-2mmの厚さにミンチします。
  2. 1000°Lピペットの先端をはさみで切り、組織片の回収を可能にするのに十分な大きさにします。ピペットチップを1x HBSSで事前にすすします。次に、ピペットを使用して、15 mL円錐状チューブに細分化された組織を含むHBSS溶液の2 mLを移します。
    メモ:ピペット先端の事前すすりは、先端の内側のティッシュピースの粘着性を防ぐために重要です。
  3. 氷冷1x HBSSの追加の2 mLで井戸を洗浄し、組織片を含む対応する15 mL円錐形チューブに溶液を移します。
  4. 各サンプルを4°Cで250 x gで5分間遠心分離します。
  5. 神経組織解離キットの酵素ミックス1を調製する(NTDK;材料表)酵素Pの50μLをサンプルあたり1900μLの緩衝液Xと混合することにより。温かい酵素は、水浴中の37°で1を混合する。酵素の完全な活性化を可能にするために、使用前に少なくとも10分間37°Cで酵素ミックス1をインキュベートする。
  6. 15mL円錐管から上清を吸引し、各サンプルに1.95mLの酵素ミックス1を加える。穏やかに渦をしてペレットが再懸濁していることを確認します。
  7. 37°Cで15分間、ホイールまたはシェーカーのサンプルをインキュベートします。
  8. 一方、10μLの酵素Aとサンプル当たり20μLの緩衝液Yを混合することにより、NTDKの酵素ミックス2を調製する。水浴中の37°Cで溶液を事前に温めます。
  9. 酵素ミックス1によるインキュベーションの終了時に、各試料に30μLの酵素ミックス2を加える。
  10. 1x HBSSでプリリンスされた1000 μLピペットチップで上下にピペットを取り込んでサンプルを軽く混ぜます。
  11. 37°Cで15分間、ホイールまたはシェーカーにサンプルをインキュベートします。
  12. インキュベーション後、各チューブに10mLの氷冷1x HBSSを加えて、酵素ミックス1と酵素ミックス2を不活性化します。
  13. 各サンプルを4°Cで320 x gで10分間遠心分離します。
  14. 上清を捨てる。氷冷1x HBSSを各チューブに7mLの最終容積まで加え、ボルテックスによってペレットを穏やかに再懸濁します。
  15. 破片の取り外しについては、セクション 5 に進みます。

4. 脳と脊髄の機械的均質化

注:このセクションで説明するボリュームは、半分の脳または脊髄の均質化に十分です。このセクションで説明するプロトコルは、以下で説明するユーザーのニーズに応じて、セクション 3 で説明する方法の代替方法として使用できます。

  1. 氷の上にセットされたDounceティッシュグラインダー(材料のテーブル)のガラスモルタルを事前に冷やします。
  2. モルタルに3mLの予冷済み1x HBSSを加えます。
  3. 6ウェルプレートのウェルからガラスモルタルに組織(脳または脊髄)を移し、1x HBSSに浸漬し、モルタルの底部に座っていることを確認します。
  4. 10ストロークの害虫Aで組織を穏やかに粉砕し、続いて10ストロークの害虫B.均質化ミックスを新しい15 mL円錐チューブに移します。
  5. 予め冷めた1x HBSSを使用してチューブを10mLの最終容積に充填し、4°Cで320 x gで10分間遠心分離機を使用します。
  6. 上清を吸引し、7 mLの最終容積まで各チューブに氷冷1x HBSSを加え、ボルテックスによってペレットを穏やかに再懸濁します。
  7. 破片の取り外しについては、セクション 5 に進みます。

5. デブリ除去

注:未消化組織とミエリン鞘を主成分とする破片の除去は、その後のフローサイトメトリック分析のために組織ホモジネートの効率的な染色を可能にする重要なステップです。

  1. 70μmの細胞ストレーナーを通して各サンプルを濾過し、未消化組織チャンクを除去します。これらのサンプルは、その後のステップに影響を与える可能性のある未消化神経断片または髄質を含む可能性が高いので、脊髄組織を扱う場合、このステップは特に重要です。
  2. 各サンプルチューブの最終体積が7mLであることを確認します。そうでない場合は、7 mLまでの氷冷1x HBSSで満たします。
  3. 各サンプルに3mLのプレチルドIPSを加え、最終濃度30%の密度勾配培地を含む溶液の最終体積を10mLにします。サンプルを穏やかに渦巻き、それらが均一に混合されていることを確認します。
  4. 18°Cで700 x gで15分間の遠心分離サンプルを行い、遠心分離機の加速度を7、ブレーキを0に設定します。
    注:遠心分離には約30分かかります。
  5. 遠心分離機からサンプルを繊細に取り除く。
    メモ:破片とミエリンで構成された白っぽいディスクは、溶液の表面に浮かんで見える必要があります。ペレット(目的の細胞を含む)は、チューブの下部に表示する必要があります。
  6. 慎重に破片のすべての白っぽいディスクを吸引し、その後、上清の残りの部分は、ペレットを外さないようにしてください。誤って解き放つリスクを避けるために、約100μLの溶液を細胞ペレットの上に置きます。
  7. FACS BLを1mL加え、1000 μLピペットチップで上下にピペットを取り替えてペレットを再サスペンドし、サンプルを1.5 mLチューブに移します。
  8. 室温(RT)で450 x gで5分間遠心分離機。
  9. 上清を穏やかに吸引し、下流解析と互換性のある適切なバッファーでペレットを再サスペンドします(複数の細胞タイプのフローサイトメトリック評価に使用されるプロトコルについてはセクション6を参照)。

6. 複数の細胞型のフローサイトメトリック評価のための染色

  1. FACS BLの350°Lでステップ5.9で得られたペレットを再サスペンドし、最終濃度5μg/mLで各サンプルにFcブロックを追加します。
    注:サンプルの少なくとも100°Lは、信頼性の高い分析を可能にするために十分な細胞を処理するために、1つの染色に使用する必要があります。
  2. 染色を進める前に、4°Cで10分間サンプルをインキュベートします。
  3. 表1に記載の抗体ミックスを調製する。
  4. 各チューブに抗体ミックスを加え、5°の渦を加え、暗闇の中で4°Cで15分間サンプルをインキュベートします。
  5. 各チューブ、渦、遠心分離機に1mLのPBSを加え、RTで450 x gで5分間追加します。
  6. 一方、表1に従ってストレプトアビジンミックスを調製する。
  7. 上清を廃棄し、ステップ6.6で調製したストレプトアビジンミックスでペレットを再サスペンドする。各サンプルについて、ステップ6.4の染色に使用したものと同じボリュームを使用します。
  8. 5s用渦と暗闇の中で4°Cで10分間サンプルをインキュベートする。
  9. 各チューブ、渦、遠心分離機に1mLのPBSを加え、RTで450 x gで5分間追加します。
  10. 上清を廃棄し、FACS BLでペレットを再サスペンドします。
  11. 各サンプルに7-アミノ-アクチノマイシンD(7-AAD)溶液を加えます。ステップ6.10で調製したサンプルの300μLごとに、7-AADの5μLを使用します。
  12. 細胞フルオリメトリック分析まで、サンプルを暗闇の中で4°Cで保存します。サンプル調製から16時間以内に分析を行い、細胞生存率を60%保証します。

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結果

マウスの脳と脊髄に適用される2つの異なる均質化方法(DH対PD)を比較し、下流のアプリケーションに適した異なる生存細胞タイプを取得する際の効率をテストしました。そのために、ミクログリア、リンパ球、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、内皮を含む異なるCNS細胞型を特徴付けるように設計された9色フローサイトメトリーパネルを利用しました。

脳および脊髄組織を異なるマウスから取り出し(n≥6)、縦方向に2つの半分に分割し、Dounceホモジナイザー(DH法)を用いて機械的破壊を適用するか、またはパパイン(PD法)に基づく市販のNTDKを用いて穏やかにミンチおよび消化した酵素を用いて並行して処理した(図1A)。破片除去後、脳または脊髄からの細胞をそれぞれ1/10または1/2−1/5に希釈し、トリパンブルーでノイバウアーチャンバーで細胞収率および生存率を決定した(図1B,C)。DH法は、全体的に...

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ディスカッション

ここでは、マウス脳および脊髄からの最も関連性の高いCNS細胞の共精製および同時フローサイトメトリック分析のためのプロトコルについて説明する。従来、組織学的解析は、CNS5、13におけるナノ粒子の分布またはウイルスベクターの伝達効率を記述するために適用されてきたが、病理学または薬理学的治療14の間に特定の細胞型で起こる形態学的および分子変化に関する洞察を提供する。しかし、組織学はプロセス性に欠けており、同時に分析できるマーカーの数が限られているため、同じ組織学的サンプル内の複数の特徴を包括的に検査することはできません。当社のアプローチは、従来の組織学的分析を補完するものであり、複数の下流アプリケーション(ソート、一次培養、生化学的または次世代シーケンシング分析)と組み合わせることで、個々のサンプルから得られる情報のコンパイルを拡大することができます。ただし、このアプローチの成功に重大な影響を与える可能性があるため、以下に示す主な要因を考慮する必要があります。

    ...

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開示事項

著者たちは何も開示する必要はない。

謝辞

この研究は、ボストン小児病院のスタートアップ資金によってA.B.、ALSA助成金nrに資金提供されました。17-IIP-343からM.P.、および筋萎縮性側索硬化症研究プログラムを通じて国防次官補室賞No.W81XWH-17-1-0036 から M.P.DFCIフローサイトメトリーコアの技術サポートを認めます。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10X HBSS (カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウムフリー)Gibco14185-052
70 mm Cell StrainerCorning431751
ACSA/ACSA2 抗マウス抗体Miltenyi Biotec130-117-535APC 標識
ウシ血清アルブミンSigma AldrichA9647-1KG
CD11b ラット抗マウス抗体Invitrogen47-0112-82APC-eFluor 780 標識
CD31 ラット抗マウス抗体BD Bioscience562939BV421 標識
CD45 ラット抗マウス抗体Biolegend103138Brilliant Violet 510 標識
CD90.1/Thy1.1 ラット抗マウス抗体Biolegend202518PE/Cy7 標識
CD90.2/Thy1.2 ラット抗マウス抗体Biolegend1005325PE/Cy7 標識
コニカルチューブ (15 mL)CellTreat229411
コニカルチューブ (50 mL)CellTreat229422
Dounce Tissue Grinder set (乳鉢と乳棒 A および B を含む)Sigma-AldrichD9063-1SET
Fc (CD16/CD32) ブロックラット抗マウス抗体BD Pharmingen553142
ウシ胎児血清ベンチマーク100-106
神経組織解離キット (P)Miltenyi Biotec130-092-628
O4 抗マウス/ラット/ヒト抗体Miltenyi Biotec130-095-895ビオチン結合
パーコールGEヘルスケア10266569無菌試薬として販売
パーコールシグマ65455529滅菌試薬(無菌性が必要なアプリケーションに使用する)
Percoll PLUSSigmaGE17-5445-01量のエンドトキシン
ストレプトビジンInvitrogenS3258Alexa Fluor 680 コンジュゲート
微を含む

参考文献

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