Method Article

異なる均質化法を通じてマウス脳/脊髄から取り出された複数の細胞型の同時フロー細胞特性評価

DOI:

10.3791/60335

⸱

November 19th, 2019

 ,  ,  , 
1Dana-Farber/Boston Children's Cancer and Blood Disorders Center, 2Harvard Medical School

In This Article

Summary

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マウスの脳や脊髄から取り出した異なる細胞の種類を同時に同定するためのフローサイトメトリー法を提示する。この方法は、神経変性疾患における純粋な細胞集団を単離または特徴付けたり、ウイルスベクターまたはナノ粒子の生体内投与を標的とする細胞の程度を定量化するために利用され得る。

Abstract

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ウイルスベクターおよびナノマテリアル科学の最近の進歩は、中枢神経系(CNS)を調査または操作するための新しい最先端のアプローチの道を開きました。しかし、これらの技術のさらなる最適化は、体内のウイルスベクターまたはナノ粒子の投与におけるCNSおよび細胞特異的ターゲティングの程度の迅速かつ合理化的な決定を可能にする方法から利益を得るであろう。ここでは、フローサイトメトリーの高スループットと多重化機能を利用して、マウス脳または脊髄から分離された異なる細胞サブタイプ、すなわちミクログリア/マクロファージ、リンパ球、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ニューロンおよび内皮細胞を簡単に定量することを可能にするプロトコルを提示する。このアプローチを適用して、細胞収率、生存率、組成の観点から2つの組織均質化方法間の重要な違いを強調する。これにより、対象のセルの種類と特定のアプリケーションに応じて最適な方法を選択するようにユーザーに指示できます。この方法は、組織が単細胞懸濁液を生成するために均質化されているので、解剖学的分布の分析には適さない。しかし、それは生存可能な細胞と組み合わせることができ、それは、純粋な細胞集団に由来する一次培養の確立から、神経変性疾患の文脈でよく定義された細胞サブタイプに対する遺伝子発現解析や生化学的または機能的アッセイに至るまで、神経科学者の手でツールのレパートリーを拡大することができるいくつかのアプリケーションのための道を開く、細胞ソートと組み合わせることができます。

Introduction

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遺伝子および薬物送達技術(ウイルスベクターやナノ粒子など)は、神経変性疾患で変化した特定の分子経路に関するより良い洞察を得るために、および革新的な治療アプローチの開発のために適用することができる強力なツールとなっています。これらのツールの最適化は、定量化に依存します: (1) 管理の異なる経路上の CNS の浸透の程度と (2) 特定の細胞集団のターゲティング.組織学的解析は、通常、異なるCNS領域および異なる細胞型にわたって蛍光レポーター遺伝子または蛍光タグ付きナノ粒子を可視化するために適用され、特定の細胞マーカー4、5に対する免疫染色によって同定される。このアプローチは、投与された遺伝子または薬物送達ツールの生体分布に関する貴重な情報を提供しますが、(1)組織固定、凍結保存またはパラフィン埋め込みおよびスライスが必要なため、この技術は時間がかかり、手間がかかがあります。(2)特定の細胞マーカーの染色は、時には抗原検索を必要とする;(3)蛍光顕微鏡による取得は、通常、同じ実験内の限られた数の異なるマーカーの分析を可能にする。(4)画像処理により、目的の信号を適切に定量化できるようにする。

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Protocol

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ここで説明するすべての方法は、ダナ・ファーバー癌研究所(プロトコル番号16-024)の制度動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認されています。

1. 実験に必要なソリューションの準備

  1. 10x HBSSを滅菌水で希釈して、1xハンクのバランスのとれた塩溶液(HBSS)を調製します。氷の上で溶液を事前に冷やします。各サンプルには少なくとも25mLの溶液が必要です。
  2. 10x滅菌HBSS 1:10と密度勾配培地(すなわち、Percoll)を混合して等張性パーコール溶液(IPS)を調製します。氷の上で冷やす前に。
    注:IPSは4 °Cで最大30日間保存することができます。
  3. フローサイトメトリー(FACS)ブロッキング(BL)溶液(1%ウシ血清アルブミン[BSA]、リン酸緩衝生理食塩水[PBS]中の5%ウシウシ血清[FBS])を調製する。氷の上で冷やす前に。

2. 心内灌流と組織解剖による動物安楽死

注:8週齢のC57BL/6Jマウスは、どちらかの性別で、実験に用いた。PBS溶液による灌流は、組織消化を進める前に、臓器からの血液汚染を排除するために行われる。

  1. ケタミン/キシラジン(90−200 mg/kgケタミン、10 mg/kgキシラジン)の混合物を使用してマウスを麻酔す....

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Results

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マウスの脳と脊髄に適用される2つの異なる均質化方法(DH対PD)を比較し、下流のアプリケーションに適した異なる生存細胞タイプを取得する際の効率をテストしました。そのために、ミクログリア、リンパ球、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、内皮を含む異なるCNS細胞型を特徴付けるように設計された9色フローサイトメトリーパネルを利用しました。

脳および脊髄組織を異なるマウスから取り出し(n≥6)、縦方向に2つの半分に分割し、Dounceホモジナイザー(DH法)を用いて機械的破壊を適用するか、またはパパイン(PD法)に基づく市販のNTDKを用いて穏やかにミンチおよび消化した酵素を用いて並行して処理した(図1A)。破片除去後、脳または脊髄からの細胞をそれぞれ1/10または1/2−1/5に希釈し、トリパンブルーでノイバウアーチャンバーで細胞収率および生存率を決定した(図1B,C)。DH法は、全体的に.......

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Discussion

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ここでは、マウス脳および脊髄からの最も関連性の高いCNS細胞の共精製および同時フローサイトメトリック分析のためのプロトコルについて説明する。従来、組織学的解析は、CNS5、13におけるナノ粒子の分布またはウイルスベクターの伝達効率を記述するために適用されてきたが、病理学または薬理学的治療14の間に特定の細胞型で起こる形態学的および分子変化に関する洞察を提供する。しかし、組織学はプロセス性に欠けており、同時に分析できるマーカーの数が限られているため、同じ組織学的サンプル内の複数の特徴を包括的に検査することはできません。当社のアプローチは、従来の組織学的分析を補完するものであり、複数の下流アプリケーション(ソート、一次培養、生化学的または次世代シーケンシング分析)と組み合わせることで、個々のサンプルから得られる情報のコンパイルを拡大することができます。ただし、このアプローチの成功に重大な影響を与える可能性があるため、以下に示す主な要因を考慮する必要があります。

    .......

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Disclosures

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著者たちは何も開示する必要はない。

Acknowledgements

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この研究は、ボストン小児病院のスタートアップ資金によってA.B.、ALSA助成金nrに資金提供されました。17-IIP-343からM.P.、および筋萎縮性側索硬化症研究プログラムを通じて国防次官補室賞No.W81XWH-17-1-0036 から M.P.DFCIフローサイトメトリーコアの技術サポートを認めます。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10X HBSS (カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウムフリー)Gibco14185-052
70 mm Cell StrainerCorning431751
ACSA/ACSA2 抗マウス抗体Miltenyi Biotec130-117-535APC 標識
ウシ血清アルブミンSigma AldrichA9647-1KG
CD11b ラット抗マウス抗体Invitrogen47-0112-82APC-eFluor 780 標識
CD31 ラット抗マウス抗体BD Bioscience562939BV421 標識
CD45 ラット抗マウス抗体Biolegend103138Brilliant Violet 510 標識
CD90.1/Thy1.1 ラット抗マウス抗体Biolegend202518PE/Cy7 標識
CD90.2/Thy1.2 ラット抗マウス抗体Biolegend1005325PE/Cy7 標識
コニカルチューブ (15 mL)CellTreat229411
コニカルチューブ (50 mL)CellTreat229422
Dounce Tissue Grinder set (乳鉢と乳棒 A および B を含む)Sigma-AldrichD9063-1SET
Fc (CD16/CD32) ブロックラット抗マウス抗体BD Pharmingen553142
ウシ胎児血清ベンチマーク100-106
神経組織解離キット (P)Miltenyi Biotec130-092-628
O4 抗マウス/ラット/ヒト抗体Miltenyi Biotec130-095-895ビオチン結合
パーコールGEヘルスケア10266569無菌試薬として販売
パーコールシグマ65455529滅菌試薬(無菌性が必要なアプリケーションに使用する)
Percoll PLUSSigmaGE17-5445-01量のエンドトキシン
ストレプトビジンInvitrogenS3258Alexa Fluor 680 コンジュゲート
微を含む

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Deverman, B. E., Ravina, B. M., Bankiewicz, K. S., Paul, S. M., Sah, D. W. Y. Gene therapy for neurological disorders: progress and prospects. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (9), 641-659 (2018).
  2. Teleanu, D., Negut, I., Grumezescu, V., Grumezescu, A., Teleanu, R. Nanomat....

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