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方法論記事

再生軸切除における微小外科ラミネクトミーによる挫傷脊髄損傷

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DOI:

10.3791/60337

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2019年10月20日

 ,  ,  , 
1Department of Clinical Medicine, Aarhus University, 2Department of Neurosurgery, Aarhus University Hospital

この記事について

サマリー

この原稿は、再生軸術(Ambystomaメキシコ)に制御された鈍いと鋭い脊髄損傷を外科的に与えるプロトコルを提示する。

要約

本研究の目的は、アクソロトル(Ambystomaメキシコ)において、標準化され、再現可能な再生性鈍い脊髄損傷モデルを確立することです。ほとんどの臨床脊髄損傷は、高エネルギー鈍い外傷として起こり、挫傷を誘発する。しかし、軸次脊髄のほとんどの研究は、鋭い外傷で行われています。したがって、本研究は、より臨床的に関連する再生モデルを作り出すことを目指している。ほぼすべての組織を再生する彼らの印象的な能力のために、アキセロチルは再生研究のモデルとして広く使用され、脊髄損傷(SCI)研究で広く使用されています。このプロトコルでは、アキソロチルはベンゾカイン溶液中の浸漬によって麻酔される。顕微鏡下では、角切開は後肢にちょうどコーダルのレベルで両側に行われます。この切開から、紡錘のプロセスを解剖し、露出することができる。鉗子およびはさみを使用して、脊髄を露出させる2レベルの線膜切開術が行われる。シリンダー内の落下ロッドからなるカスタム外傷装置が構築され、この装置は脊髄に挫傷を誘発するために使用される。切開は縫合され、動物は麻酔から回復する。外科的アプローチは脊髄を露出することに成功した。外傷機構は、組織学、MRI、および神経学的検査によって確認された脊髄への挫傷を引き起こす可能性がある。最後に、脊髄は傷害から再生する。プロトコルの重要なステップは、脊髄に損傷を与えることなく、脊椎プロセスを除去することです。この手順では、安全な手順を確保するためのトレーニングが必要です。さらに、創傷閉鎖は、切開時に皮膚に不必要な損傷を与えないという大いに依存する。プロトコルは、12匹の動物の無作為化研究で行った。

概要

本研究の全体的な目標は、軸次(Ambystomaメキシコ)に鈍い鋭いSCIを与え、再生性脊髄損傷モデルを作り出すための制御された再現性の顕微鏡的方法を確立することであった。

SCIは、レベルおよび程度に応じて、膀胱および腸制御障害1、2、3と共に四肢に神経障害を与える重篤な状態である。ほとんどのSCIは、交通事故などの高エネルギー鈍い外傷の結果であり、4、5を落ちる。鋭い怪我は非常にまれです。したがって、最も一般的なマクロスコピック傷害タイプは挫傷である。

哺乳動物中枢神経系(CNS)は非再生組織であり、したがってSCIに続く神経組織の回復は6、7、8と見られる。一方、一部の動物は、CNS組織を含む組織を再生する興味深い能力を有する。これらの動物の一つは、アクソロトルです。それは再生生物学の研究で広く使用され、脊髄再生に興味がある、脊椎動物9、10、11、12である。

アクソロtlにおけるほとんどのSCI研究は、尾全体の切断または脊髄9、10、11、12の大部分の切断のいずれかとして行われる。最近、臨床状況をより良く模倣する鈍い傷害13に関する新しい研究が発表された。軸次における完全な付属切断は完全な再生をもたらすのに対し、一部の非切断ベースの再生現象は、臨界サイズ欠陥(CSD)14、15に依存する。これは、重大なしきい値を超える傷害が再生成されないことを意味します。臨床翻訳値が高い再生モデルを開発するために、本研究では、2mm鈍い外傷がCSD限界を超えるかどうかを調べた。

この方法は、小動物モデル、特にアクソロトルで脊髄再生に取り組んでいる研究者に関連しています。さらに、標準的な実験装置を使用して、一般的に小動物での使用に適した鈍い外傷機構を開発する方法を示すので、より一般的な関心があるかもしれません。

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プロトコル

動物の倫理的使用に関する適用されるすべての制度および政府の規制は、この研究の間に従われました。この研究は、デンマーク動物実験検査官による承認ID:2015-15-0201-0061の下で行われました。動物はメキシコアキゾロツ(アンビストマメキシコ、平均体重±STD:12.12g±1.25g)であった。

1. 準備

  1. 麻酔用のアクソロトルを準備します。
    1. 高品質の非化学的に処理された水道水を使用してください。使用できない場合は、40% ホルトフレーターのソリューションを使用します。
    2. エチル4-アミノベンゾエート(ベンゾカイン)を3mLのアセトンに200mg溶解する。この溶液を水道水1Lまたはホルトフレーターの40%溶液に溶かします。
  2. 外科テーブルとしてステレオ顕微鏡の下に置かれる標準的なペトリ皿(直径100のmm)を使用する。ペトリ皿に外科織物布を置きます。
    注:外科区域としてペトリ皿を使用することは外科区域によって動き、それに触れることなく動物の回転を可能にし、外科の間に脊柱の安定性を保障する。
  3. すべての滅菌マイクロ手術器具(すなわち、はさみおよび解剖鉗子)を準備する。

2. 麻酔

  1. 深く安定した麻酔を確保するために、約45分間ベンゾカイン溶液を入れた容器にアクソロトルを入れます。
    注:ベンゾカインの所定の濃度は、アキソロツのすべてのサイズで麻酔を引き起こす。
  2. 30-45分以内に全身麻酔の兆候を確認してください。これらは、ギルの動き、右の反射、または触覚または痛みを伴う刺激(つま先ウェブの穏やかなつまみ)への応答の完全な欠如が含まれます。
  3. 麻酔を維持するために、麻酔液に濡らされたペーパータオルで動物を包みます。皮膚およびエラが湿った状態に保たれることを保つために外科処置の間にこれらの溶液を定期的に湿らせる。
  4. 新鮮な水道水を含む容器に入れて手術後に回復します。1時間16以内に、ギルの動きや右反射を取り戻すなどの回復の兆候を観察します。

3. マイクロ外科ラミネクトミー

注:ラミネクトミーは立体顕微鏡下で行われる。

  1. 動物をペトリ皿の上の傾向のある位置に置きます。しっぽが露出できるようにペーパータオルで包みます。
    注:ペーパータオルはプロシージャを通して安定性を保障するために優秀である。
  2. 後肢を識別します。最初の切開は、彼らにちょうどカウドを作ります。
    1. マイクロシサーのペアで、脊椎プロセスの骨の顕著が感じられるまでキールから垂直切開を行います。
      注:これらは繊細な皮膚に損傷を与えやすいので、鉗子でキールや皮膚をつかむときは非常に注意してください。
    2. 切開部が尾の幅全体を通過できるように、カットを横に伸ばします。
    3. 鉗子で紡錘のプロセスをつかみ、右の深さを保障する。
    4. 両側の脊椎プロセスの下に垂直切開部を1mm延長します。
  3. 動物を片側に置き、下記の通り腹部および水平切開を行う。
    1. 一対のマイクロシサーで、垂直切開の腹部点から始まり、動物の体重10〜20gの水平切開を約15mmにする。大きな動物の切開を長くし、小さい動物の場合は短くする。
    2. はさみを使用して、椎体柱が中間線で感じられるまで、水平切開を通して中間的に解剖する。
    3. 動物の反対側で手順 3.3、3.3.1、および 3.3.2 を繰り返します。
  4. 両側から深い中間平面で解剖した後、中線を通して解剖し、それによって2つの水平切開を接続する。
    1. テールとキールのフリーピースを片側に移動し、スピンプロセスを公開します(図1)。
    2. 濡れたペーパータオルでテールピースを固定します。
  5. 外科医の非支配的な側面に直面して頭部と再び傾向のある位置に動物を置きます。
    1. 鉗子のペアで、後肢にちょうどオードの脊椎プロセスをつかみ。動物の頭の方に向かって穏やかなリフトを適用します。
    2. 一対のマイクロシサーのブレードをプロセスの周りに水平に置き、そっと切ります。プロセスの上昇は脊髄を露出させる今取除かれることを保障する。
    3. ちょうど取り外されたプロセスに向きを取り除き、手順3.5.1と3.5.2を繰り返すだけのスピンプロセスをつかみ、繰り返します。
      注:これは、2つの椎体レベルに対応する露出した脊髄を残す必要があります。ラミネクトミーを行う場合、白色泡分泌がしばしば現れる。脊髄は、中線に沿って走る血管と共に、その独特の輝きによって容易に識別される。
    4. 動物の大きさによっては、露出面積が十分に広くない場合があります。2組の鉗子を使用して、脊髄の両側の下線をつかみ、穏やかな動きでこれらを横にねじります。

4. 挫傷型損傷の導入 (図2)

  1. 動物を傾向のある位置に置いてください。
  2. ペトリ皿を使用して、動物を外傷ユニットに移します。
  3. アシスタントに脊髄の懐中電灯を照らして下さい。
  4. 挫傷部ユニットシリンダーを、ユニットのマイクロアジャスターを使用して、露出した脊髄の上に置きます。シリンダーを通して目指せ
  5. シリンダーがラミネーと水平になるまで下げます。
  6. 落下ロッドを電磁石に取り付けます。目的の落下高さ調整シリンダーを外傷単位に置きます。
  7. 落ちる棒をシリンダーに置きます。
    注:盲目の研究のために、外科医は今動物が傷害または偽の外科グループに割り当てられるかどうか知らずに部屋を出るべきです。
  8. 電磁石の電源を切れロッドは露出した脊髄に落ちる。
  9. 高さ調整ネジを使用して、脊髄からロッドを持ち上げます。
  10. 顕微鏡で脊髄を見て怪我を確認します。負傷した部位は暗く見え、中線血管からの出血が明らかになるだろう。

5. 鋭い怪我の紹介

注:3.5.4 以降でこれらの手順を実行します。

  1. マイクロシサーのペアで完璧な垂直カットで脊髄をカットします。
  2. 本体の片側に2mmのカットを繰り返します。
    注:脊髄の取り除かれた部分の長さは、研究要件に応じるように調整することができる。しかし、2mmのカットは10に再生成可能になります。
  3. カットが完了していることを確認します。完了すると、脊柱管の腹部部分に沿って削り取るはさみの刃を感じます。
  4. 脊髄の2mm片を脊柱管から持ち上げます。

6. 外科的創傷の閉鎖

  1. 動物を手術台に戻す。盲目の研究では、脊髄が外科医に見えないようにキールの位置を変更します。
  2. 動物を傾向のある位置に置いてください。
    1. 水平切開の最も因性部分から10.0ナイロン縫合糸の配置を開始します。傷を1つの層で閉じます。
      注:壊死を引き起こすので、あまりにもきつく皮膚を把握しないでください。
    2. 切開部の垂直部に向かって作業します。
    3. 角度に達したときは、ペトリ皿を回し、他の水平切開を縫合します。
    4. 垂直切開部に縫合糸を設定します。
    5. ここで皮膚が保持することができないので、キールの最上部に縫合糸を配置しないでください。

7. 動物を麻酔薬を含まないソリューションに戻す

  1. 動物と一緒にペトリ皿を持ち上げ、深さわずか5cmの淡水に非常に穏やかに沈め、動物を滑らせます。
    注:浅い水深は動物が呼吸するために表面に泳ぐことを試みないことを保障する。
  2. 最初の週に水を交換しないでください。
  3. 動物に餌を与えるときは、食べ物が動物の頭の近くに置かれていることを確認してください。
    注:これらの措置の目的は、最初の週の間にできるだけ多くの動きを避けることです。

8. 術後超音波

  1. 麻酔の終了前に、高周波超音波システムを使用して、SCIサイトの3次元画像の構築に使用できる傷害の画像を取得します。
  2. トランスデューサをマイクロマニピュレータに取り付け、好ましくは遠隔ジョイスティックで管理する。
  3. 麻酔薬を麻酔液で満たされた小さな容器に、麻酔動物をその傾向のある位置に沈めます。
    注:スキャンシーケンス中の動きを避けるために、ミニチュアサンドバッグやその他の機器で動物を固定します。
  4. トランスデューサの先端を動物の長さの軸に合わせ、動物の後肢の後ろのキールからわずか数ミリ上になるまでベンゾカイン溶液に沈みます。
  5. SCI サイトを識別します。
    注:損傷部位はSCIの真上に欠落している脊椎プロセスが欠落しているので容易に認識できる。
  6. 超音波設定を調整して画像を最適化します。SCI サイトがイメージの中央にあることを確認します。視野(画像深度、深度オフセット、画像幅)を調整して、SCI部位と隣接する正常な組織をカバーします。画像のコントラストを最適化するには、2 次元ゲインを調整します。
  7. 電子的に操作されたマイクロマニピュレータを使用してSCIサイト全体に超音波トランスデューサをスイープすることにより、複数の矢状断面スライス位置でSCIサイトを覆うBモード画像を取得し、スライス間隔を持つ連続したスライスを使用します。50 μm. フレームレートが約50フレーム/秒、トランスデューサ周波数が40MHzの500フレームを含むシネ画像を取得します。
    注:このセットアップには、リモート ジョイスティックによって管理される電子マイクロマニピュレータが必要です (ステップ 8.2)。
  8. スキャンシーケンスを終了した後、ステップ7に戻ります。

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結果

プロトコルの目的は、モーターと感覚機能を損傷に麻痺させるSCIを生成することです。アクソロトルは再生能力があるので、数週間以内に機能を回復し、研究者は短い期間でCNS再生を研究することを可能にします。

全ての動物に45分間麻酔を与え、早期回復のエピソードは経験されなかった。すべての動物は1時間以内に回復し、次の週13、16で麻酔による損傷の兆候を示さなかった。

ラミネクトミーは全ての動物で成功した。しかし、脊柱管の幅の解剖学的変化は、鉗子を使用して運河の広がりと一部の個体のねじれを求めた。さらに、一部の個体の残留ラミナエは落下ロッドが目標に達するのを防ぎ、したがって、外科医が残留骨および顕著からフィールドをきれいにすることが不可欠である。

切開部を閉じることは、特に研究のパイロット段階でいくつかの困難に関連していました。キールの上部の縫合糸は保持されず、不...

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ディスカッション

脊髄への損傷のリスクは重要であるため、プロトコルの重要なステップは、必要に応じて脊椎プロセスを除去し、脊柱管への骨のアクセスを広げることです。プロトコルで述べたように、最初に最も頭蓋プロセスを削除することを強くお勧めします。これは、より多くのコードプロセスがはさみによって打たれから脊髄を保護することを意味します。十分な外科的アクセスを確保することをお勧めします, あまりにも小さすぎな原発切開を作ることを意味.また、鉗子で何かをつかむとき、適用される引きの方向は常に考慮されなければならない。脊髄から緩やかな引き離しを適用すると、把握が失敗し、器具のスリップが発生した場合に保護されます。

アクソロトルの外科的処置は他の動物と変わらない。しかし、特定の重要な違いは、主に動物の組織組成および大きさに起因する存在する。アクソロトルキールの皮膚は非常に壊れやすく、逆説的に切開中に与えられた小さな損傷に対してうまく治癒しない。損傷は縫合を実質的に複雑にするので、特に一次切開部に注意する必要があります。非常に若いアキソロチルの骨は非常に柔らかいです。これは、多くの場合、基本的な解剖学的鉗子が骨除去...

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開示事項

著者は何も開示していない。

謝辞

MRIプロトコルの開発とプロジェクト全体のセットアップに関する専門知識と時間を持つオーフス大学のマイケル・ペダーセン。ピーター・アガー,オーフス大学,MRIプロトコルの開発に関する専門知識と時間を述べています。STEFFen Ringgard, オーフス大学 MRI プロトコルの開発に関する専門知識と時間.アクソロトールのSCIモデルの開発は、A.P.モラー・マースク財団、リスフォート財団、リレックス財団、ELRO財団によって親切にサポートされました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
25 gカスタム落下ロッドカスタムホームメイド
30 mmPVCパイプカスタムホームメイド
アセトンシグマ-アルドリッチ67-64-1プロパノン
ウーパールーパー(Ambystoma mexicanum)Exoterra GmbHN / A12-22 cmおよび10 g - 80 g、すべての株(野生型、メラノイド、白、アルビノ、GFP付きトランスジェニックホワイト)
ベンゾカインSigma-Aldrich94-09-7エチル 4-アミノ安息香酸
Electromagetカスタムホームメイド
Excel 2010マイクロソフトN/AExcel 2010 以降
ImageJ国立衛生ImageJ 1.5e 以降。Rasband、W.S.、ImageJ、米国国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州、米国、https://imagej.nih.gov/ij/ 年、1997-2016。
Kimwipes
顕微手術器具N/AN/A鉗子やハサ
MS550s富士フイルム、VisualsonicsMS550s40 MHz中心周波数、トランスデューサ
MS700富士フイルム、VisualsonicsMS70050 MHz中心周波数、トランスデューサ
ペトリ皿任意のメーカー
柔らかい布N/AN/A約70 x 55 cm2 例:ふきん 実
体顕微鏡
Vevo 2100富士フイルム、VisualsonicsVevo 2100高周波超音波装置
研究所 ミ

参考文献

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