NEMOのIKK結合ドメインの生産・結晶化・構造決定

Summary

X線結晶学によるNEMOのIKK結合ドメインの構造決定のためのプロトコルについて説明する。この方法には、タンパク質発現、精製および特性評価、ならびに結晶最適化を成功させるための戦略および非結合形態のタンパク質の構造決定が含まれる。

Abstract

NEMOは、キナーゼIKKαおよびIKKβとIKK複合体を組み立てすることにより、NF-κB経路において重要な役割を果たす足場タンパク質である。活性化時に、IKK複合体は、NF-κB核転移および標的遺伝子の活性化につながるIκB分子をリン酸化する。NEMO/IKK相互作用の阻害は、NF-κB経路活性の変調のための魅力的な治療パラダイムであり、NEMOを阻害剤の設計および発見の標的としている。NEMO阻害剤の発見と最適化のプロセスを容易にするために、我々は、アポ形態および小分子量阻害剤に結合しながら、アポ形態のタンパク質の構造決定を可能にするNEMOのIKK結合ドメインの改良された構築物を設計した。ここでは、NEMOのIKK結合ドメインの設計、表現、構造特性評価に利用する戦略を紹介する。タンパク質は大腸菌細胞で発現し、変性条件下で可溶化し、3つのクロマトグラフィー工程を経て精製される。構造決定用結晶を得るためのプロトコルについて議論し、データ取得・分析戦略について説明する。プロトコルは、NEMOと低分子阻害剤の複合体の構造決定に広い適用性を見出す。

Introduction

NF-κB経路は、サイトカイン、微生物産物およびストレスを含む様々な刺激に応答して活性化され、炎症および免疫応答を担う標的遺伝子の発現を調節し、細胞死または生存および増殖¹を担う。炎症性および自己免疫疾患および癌^{2、3、4、5を}含む病理は、経路の過活性化と相関しており、これはNF−κB活性の変調を新しい治療法^の開発のための主要な標的としている^6、7である。

特に正規のNF-κB経路は、非正規経路と区別され、リンパ有機生起とB細胞活性化を担い、前者の足場タンパク質NEMO(NF-κB必須変調器⁸⁾への依存によって、キナーゼIKKαおよびIKKβを有するIKK複合体の集合体に対する。IKK複合体は、分解を標的とするIκBα(κBの阻害剤)のリン酸化を担い、遺伝子転写¹の核に転移するNF-κBダイマーを解放し、したがってNF-κB活性を調節する阻害剤の開発のための魅力的な標的である。

本研究では、NeMOとIKKβの間のタンパク質間相互作用の特性評価に焦点を当て、IKK複合体形成の低分子阻害剤の開発に向けたNEMOを標的としています。NEMOの最小結合ドメインは、IKKβを結合するために必要とされ、残基44〜111を包含し、その構造は、IKKβ配列701〜7459に対応するペプチドと複合体で決定されている。NEMOとIKKβは、NEMOダイマーが拡張相互作用インタフェースを備えた細長い開いた溝にIKKβ(701-745)の2つのヘリックスを収容する4ヘリックスバンドルを形成します。IKKβ(734-742)はNEMO結合ドメイン(NBD)とも呼ばれ、2つの必須トリプトファン(739,741)がNEMOポケット内に深く埋め込まれる結合のための最も重要なホットスポットを定義します。複雑な構造の詳細は、NEMOを標的とする低分子阻害剤の構造ベースの設計と最適化に役立ちます。同時に、小分子またはペプチドの結合が、結晶中に観察されるように、長いIKKβ(701-745)の結合によって引き起こされる完全な立体構造変化(すなわち、NEMOコイルコイルダイマーの広範な開口部)をNEMOで再現することは困難であり、そして、低分子阻害剤に結合した非結合NEMOまたはNEMOの構造は、より良い標的を表し得る。

IKK結合ドメインを包含する全長NEMOおよび小型切り捨てコンストラクトは、X線結晶学および核磁気共鳴(NMR)法¹⁰を介した非結合形態の構造決定に対して難解であることが証明されており、NEMOのIKK結合ドメインの改良版を設計するよう促した。実際、非結合形態のNEMO(44-111)は部分的に折り畳まれ、立体構造交換を受けるので、IKKβの結合親和性を保ちながら、その二量体構造、コイルコイルの折り畳み、安定性を安定させる設定を行っています。タンパク質のN-およびC末端に理想的な二量体コイルコイルシーケンス¹¹の3つのヘプタドを加え、一連の4点突然変異を加えることで、完全に二量体化された構造であるNEMO-EEAAを生成し、コイル状のコイルに折り畳まれ、全長^NEMO12で観察されたナノモル範囲に対するIKK結合親和性を検出した。さらなる利点として、コイルコイルアダプタ(GCN4シーケンスに基づく)が結晶化を促進し、最終的には分子置換によるX線構造決定に役立つことを期待しました。コイルコイルアダプタは、安定性を高め、溶液挙動を改善し、三量体コイルおよび抗体断片^13、14に対する結晶化を促進するために同様に利用されている。NEMO-EEAAは、クリーバ可能なヒスチジンタグを有する大腸菌細胞から容易に発現および精製され、可溶性であり、安定した二量体コイルコイルに折り畳まれ、1.9Åへの回折で容易に結晶化される。GCN4の順序付けられたコイルコイル領域の存在は、GCN4¹⁵の既知の構造を用いた分子置換によるNEMO-EEAAの結晶からのデータのフェージングをさらに助けることができる。

アポ-NEMO-EEAAで得られた結果を考えると、ここで説明するプロトコルは、NEMO阻害の要件を理解し、初期リード阻害剤の構造ベースの最適化を高い親和性に理解することを目的として、小型ペプチド(NBDペプチドなど)または低分子阻害剤の存在下でNEMO-EEAAの結晶化にも適用できると考えています。多くのコイルコイルドメイン¹⁶の可塑性および動的性質を考えると、コイルコイルアダプタの使用は、構造決定を支援する上でより一般的な適用性を見つけることができる。

Protocol

1. 結晶学のためのコンストラクトの設計

1. N末端ヘキサヒスチジンタグおよびプロテアーゼ切断部位を含むT7プロモーターを用いて大腸菌中で発現するためのベクターにおいて、前の出版物¹²のようにNEMO-EEAAの配列をクローン化する。
   注:このプロトコルでは、N末端ヘキサヒスチジンタグとタバコエッチングウイルス(TEV)切断部位¹⁰を含むように改変されたベクターを使用した。このベクターは、タンパク質結晶化のためのHisタグの切断を容易にし、所望のタンパク質配列の開始前にGSW残基の短い延長のみを残します。これが派生したベクトルと代替ベクトルが[材料の表]に一覧表示されます。このプロトコルでは、元のNEMO(44-111)配列に対するその後の改変が段階的に導入され、前の¹⁰に記載したように、側向き突然変異誘発を用いた。当初は、理想的なコイルコイルアダプタ(少なくとも3つのヘプタドの長さ)をN端子またはC端子端またはその両方に付加したNEMOコイルコイルダイマーの安定化を試みました。二重コイルコイルは、以前の結晶化試験から最も有望であり、その後、前の¹²に記載したように結晶化を改善するために変異を導入して改変された。

2. 彼の₆タグ付きNEMO-EEAAの大規模な表現

1. コンストラクトを BL21(DE3) コンピテントセルに変換します。セルグリセロールストックとして-80°Cで保管してください。
2. 1 日目 – セルスターター培養を準備します。125 mLエルレンマイヤーフラスコに、素晴らしいブロス溶液20mLとアンピシリンの100 mg/mLストックの20 μLを追加します。細胞グリセロールストックのいくつかのマイクロリットルを追加します(ベクターで変換されたBL21(DE3)有能な細胞の-80°C貯蔵から)。
3. 10 mLスターター培養物を37°、220rpm(約15時間)で一晩振る。
4. Day 2 – スターターから、テリフィックブロスの250 mLでOD₆₀₀ = 0.1に希釈します。100 μg/mLの最終濃度にアンピシリンを加えます。OD₆₀₀ = 0.8-1.0 に拡張します。
   1. イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を500μMに加え、37°Cで4時間成長させます。
   2. 4時間後の誘導培養物の_OD600を測定し、培養物は_OD600=6〜10に達する必要がある。

3. 彼の₆タグ付きNEMO-EEAAの精製

1. スピンセル培養は3,800xgで4°Cで20分間ダウンする。
2. 細胞ペレットを保存し、培地を廃棄します。
   注:細胞ペレットは、後で精製するために、この時点で-20°Cで保存し、保存することができます。
3. 20 mMトリス、150 mM NaCl、10 mM イミダゾール、2 mM MgCl 2、0.5 mMフニルメチルスルホニルフッ化物、2 mM ジチオスライトール(DTT)、およびベンゾナーゼヌクレアーゼの3μLを含む40 mLのリシス緩衝液中の細胞を再サスペンドする。
   注:ニッケル固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー(IMAC)カラムは2mM DTTと互換性があります。あるいは、0.2mMトリス(2-カルボキセチル)ホスフィン(TCEP)を利用することができる。
4. 再懸濁した細胞を20〜25mLのアリコートに分割する。
5. フランス語プレス(おおよその圧力25,000 psi)を使用して細胞をリスし、アリコート(コールドルーム)ごとに2〜3回繰り返す。
   注:または、細胞は超音波処理によってリンパを得ることができる(このプロトコルではテストされていない)。
6. 8Mの最終濃度に細胞リサートに尿素を加え、最低2時間または一晩までロッキングプラットフォーム上でインキュベートすることができます。これおよび以下のすべての精製工程は、透析を除き、室温で行うことができる。
7. 3日目 – 超遠心管にリサートを転送し、重量のバランスを取り、リサートがチューブを少なくとも充填するチューブを確保します。125,000 x gでリサートを25°Cで45分間回転させます。カラムに積み込むために100 mLビーカーに上清をデカントします。
   メモ:4°Cで遠心分離すると尿素がクラッシュします。
8. 高速液体クロマトグラフィーシステムでは、5 mL/分で25 mLの超純速_H2Oを搭載したIMAC 5 mLカラムからエタノールを除去し、 続いて、20 mMトリス、150 mM NaCl、500 mM イミダゾール、2 mM DTT、pH 8.0、25 mL の結合バッファー(20 mM トリス、150 mM NaCl、10 mM イミダゾール、2 mM DTT、8 MM)を含む溶出バッファーが続きます。
9. 尿素インキュベーターをIMACカラムに3mL/minでロードし、流れを集める。3 mL/min のバインド バッファを使用して、10 列のカラムの列を洗浄します。
10. 20 mM トリス、150 mM NaCl、10 mM イミダゾール、2 mM DTT、pH 8.0 を含む 20 カラムボリュームのリフォールディングバッファ付きカラムを3 mL/minで洗浄することにより、カラム上にNEMO-EEAAコンストラクトをリフォールザします。
11. NEMO-EEAAの勾配溶出を12列の体積勾配にわたって10~500mMのイミダゾールで行い、分画集板(1mL画分)ですべての溶出物を収集します。
12. 2つのカラムボリュームに対して500 mMイミダゾールで溶出を続け、収集を続けます。
13. ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)-分画のポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)を実行し、溶出画分中のNEMO-EEAA存在を決定します。
    注:我々は10%アクリルアミド、MESバッファを使用しました。
14. 純粋な標的タンパク質を含むプール分画。
15. ブラッドフォードアッセイ¹⁷によってタンパク質濃度を測定する。
    注:これは、タグ切断のためのプロテアーゼの量を推定するために必要です。

4. 彼の₆タグの切断と精製

1. TEV:NEMO-EEAAタンパク質の1:10重量比でTEVを追加し、His₆タグを切断します。TEVプロテアーゼを社内で精製した。
   メモ:完全な切断に必要なTEVの量、時間、温度を個別に最適化します。
   1. Express TEVプロテアーゼは、BL21(DE3)-RIL細胞におけるS219V変異体¹⁸と、先に説明したように精製する^19.ステップ2で説明したように細胞を短時間成長させ、フランスのプレスによってlyseし、IMACカラムを用いて精製する。25 mM リン酸ナトリウムバッファー、pH 7.8、150 mM NaCl、1 mM EDTA、2 mM DTT、20% v/v グリセロールに最終タンパク質を保存します。
2. 20 mMトリスの4 L、150 mM NaCl、2 mM DTT、pH 8.0でサンプルを一晩(約15時間)透析し、切断を可能にし、その後の精製のために試料から余分なイミダゾールを除去する。
3. 4日目 – 透析からサンプルを削除します。TEV切断からサンプルのSDS-PAGEゲルを実行して、切断が完了したことを確認します。
4. 高速液体クロマトグラフィーシステムでは、5 mL/minで25 mLの超純速_H2Oを搭載したIMAC 5 mLカラムからエタノールを除去し、 続いて、20 mMトリス、150 mM NaCl、500 mM イミダゾール、2 mM DTT、pH 8.0、次いで20 mMトリス、150 mM NaCl、10 mM イミダゾール、2 mM DTT、pH 8.0 を含む溶出バッファーの 25 mL が続きます。
5. TEV切断NEMO-EEAAでカラムを1 mL/分でロードします。切断されたNEMO-EEAAは、フロースルーで溶出します:96ウェル画分収集プレート(1 mL画分)で収集します。20 mM トリス、150 mM NaCl、10 mM イミダゾールの 5 つのカラム ボリュームのカラムを 1 mL/min で洗浄し、分数収集プレートで収集し続けます。
6. 溶出TEVとアンリーブ彼の₆-NEMO-EEAAは20 mMトリス、150 mM NaCl、500 mMイミダゾール、2 mM DTT、pH 8.0、50 mLフラスコで溶出を収集します。
7. フロースルー分数のSDS-PAGEゲルを実行して、切断されたNEMO-EEAAの存在を決定します。
8. 切断されたNEMO-EEAAコンストラクトを含むプールフロースルー分画は、攪拌セル濃縮器を用いて5mLに濃縮した。膜分子量カットオフ(MWCO)=3kDa。
9. 3 kDa MWCO膜を使用して、20 mMトリスの2 L、100 mM NaCl、2 mM DTT、pH 8.0 2時間の透析バッファーを、一晩透析用の新鮮な透析バッファーの2L(約15時間)に4°Cで変えます。
10. Day 5 – サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)16 mm x 60 cmカラム(34 μm平均粒径)に透析用サンプルを5mLロードし、2mMトライで1mL/分、100 mM NaCl、2 mM DTT、pH 8.0で1mL/分で。サンプルボリュームに応じて、追加の列を繰り返します。
11. 二量体NEMO-EEAAに対応する分数をプールします。
    注:NEMO-EEAAは、二量体コイルコイルの細長い性質のために、より大きな分子量タンパク質に対応する60-65 mLの間で溶出します。
12. 攪拌細胞濃縮器とMWCO=3kDa膜を113μM(1.65mg/mL)の最終濃度に使用して濃縮する。
13. アリコートタンパク質を4°Cで保存します(1ヶ月以上安定)。

5. スパースマトリックススクリーニング

注:このプロトコルは、市販の画面を使用して結晶化試験を行い、結晶化ロボットを使用して座りドロップ実験を設定します。クリスタル画像はイメージャーによって自動的に収集されます。

1. 市販の疎マトリックススクリーン(材料表参照)を用いて、2滴蒸気拡散(リザーバー溶液)用の2滴チャンバー結晶化板の各96ウェルに疎マトリックス溶液のピペット60μLを使用する。
2. ロボットドロップセッターを使用して、100 nLのタンパク質溶液を1.65 mg/mLで1:1の比率で分配し、200 nLの最終容積に対してドロップ1のリザーバ溶液を1:1の比率で分配します。次いで、134 nLの貯留液を用いたタンパク質溶液の66nLを、ドロップ2(1:2比)で200nLの最終体積に対して行った。
3. 分配直後に3インチ幅のシールテープを使用してプレートを密封します。
   注:2-3分以上大気にさらされたまま放置すると、ドロップが乾燥します。
4. トレイを結晶化イメージャーの貯蔵庫に20°Cで保管し、2日後から自動的に収集した画像を確認して結晶の存在を確認する。
   注:結晶化スクリーニングは、コンストラクト最適化と並行して進行しました。以下の条件で形成された初期結晶(材料表に記載された商業スクリーン):a)0.1 Mトリス、pH 8.0、30%v/vポリエチレングリコール(PEG)MME 550、5%ポリγグルタミン酸、200-400 kDa低分子量ポリマー(PGA -LM);b) 0.1 M トリス, pH 7.8, 20% w/v PEG MME 2k, 5% PGA-LM;c) 0.1 M トリス, pH 7.8, 20% w/v PEG 3350, 5% PGA-LM.疎マトリックススクリーン結晶は格子均一性が悪い。したがって、クロス偏極イメージングを使用すると、見えなさそうになります。UVイメージングを使用して、結晶にタンパク質が含まれていることを確認します。最終的な回折品質結晶を得るためには、以下の種子ストック生成工程が必要である。

6. 種子ストック生成

注:0.1 MトリスpH 8.0、5%PGA-LM、3.6%w/v PEG 20kで種子生成用の結晶を再現的に得ます。しかし、結晶は高いモザイク性を示し、この段階でのデータ収集には適していません。

1. 種子生成用キットを使用して、結晶が存在する滴全体をピネリングして種子ストックを準備し、提供されたバイアルに50μLの結晶化条件溶液を入れた。
2. 3分間の種子ストックをボルテックス、20sオンと10sオフを脈動。
3. 1:10で連続的に希釈種子ストックは1:10,000まで増分します。すべての希釈液を4°Cで保管し、さらに使用します。

7. ファインスクリーン

1. トリス、PGA-LM、およびPEGの条件を変えた細かいスクリーンを設計する。個々のトレイの PEG 長さを変更します。
   注:NEMO-EEAAの構造決定に利用された結晶を製造した微細スクリーンは、以下の条件を採用しました: 0.1 M Tris pH 8;PGA-LM は列 1 ~ 12 で 8 ~ 0% の変化を示しました。行A-Hは異なるPEDをスクリーニングし、濃度は列1~12で次のように変化する。A: PEG 200 (0 -40% v/v);B: PEG 400 (0-40% v/v);C: PEG MME 500 (0-40% v/v);D: PEG 1000 (0-30% w/v);E: PEG 3350 (0-30% w/v);F: PEG 6k (0-30% w/v);G: PEG 10k (0-20% w/v);H: PEG 20k (0-20% w/v)結晶は良好なH4(5.45%w/v PEG 20k、5.8%w/v PGA-LM)で現れました。このプロトコルでは、タンパク質結晶学スクリーンビルダー液体ハンドラを使用してスクリーンを構築しました。
2. 1:1,000種子希釈の1:25体積比でタンパク質ストックをシードします。
   注:NEMO-EEAAの濃度はわずかに低下しますが、結晶は依然として形成されます。
3. 1:10,000 種希釈、同じ 1:25 体積比を使用して手順 2 を繰り返します。
4. ドロップセッターを使用して、1.65 mg/mLでタンパク質溶液の100 nLを分配し、1:1,000希釈して1:1,000の種子ストックを1:1の割合に分け、200 nLの最終容積をドロップ1でリザーバー溶液と1:1の比率にします。ドロップ 2 に対して繰り返しますが、シード ストックの希釈を 1:10,000 とします。
5. 分配直後に3インチ幅のシールテープを使用してプレートを密封します。
   注:2-3分以上大気にさらされたまま放置すると、ドロップが乾燥します。
6. トレイをイメージャーストレージに20°Cで保管し、2日後に収集した画像に結晶の有無を確認します。
7. クロス偏光子で結晶の均一性を確認し、次のトレイを設定する単一の条件を選択します。

8. データ収集用結晶の生成

1. クロス偏極画像で分析した均一な結晶を生み出したトリス、PGA-LM、PEG条件を中心にシングルコンディションスクリーンを設計し、最大の結晶を実現します。
   注:これらの条件からの結晶は、形状が不規則であり、主に長方形の薄いシートです。これは、結晶のエッジが明確に定義され、可能な限り最大の厚さを有する条件を選択することが重要です。
2. 20mLの結晶化条件を手で作ります。
3. マルチチャンネルピペットを使用して、2滴室、96ウェル結晶化プレートで2滴室で井戸あたり60°Lを分配し、落下蒸気拡散を座って下ろします。
4. ステップ 6.2 の説明に従ってシードストックを準備します。
5. ステップ6.3に記載の方法でタンパク質を分配する。
6. 分配直後に3インチ幅のシールテープを使用してプレートを密封します。
   注:2-3分以上大気にさらされたまま放置すると、ドロップが乾燥します。
7. 20°Cのイメージャーにトレイを保管し、毎日クリスタルの存在を確認してください。
8. 結晶のクロス偏極画像で格子状の均一性を確認し、データ収集用の結晶を選択します。

9. 凍結保護剤の決定

1. クライオプロテク剤をテストするには、結晶化条件に対応するストック溶液を作成しますが、各成分の濃度は30%、20%、10%、5%高く含まれています。凍結保護剤の容積を加えると、結晶化条件と同じ成分の最終濃度が得られます。
   注:0.1 Mトリス結晶化条件の体積で30%濃度でクライオプロテクタントをテストするには、クライオプロテクラントを追加する前に、0.143 M Trisの原液から始めます。
2. クライオ試薬キットから、結晶化条件原液の70%にクライオ条件の体積で30%を混合し、元の結晶化条件で30%のクライオプロテク剤の最終濃度を有することにより、クライオプロテクタント試験用のサンプルを10μL作成します。よく混ぜる。
   1. 10°Lピペットを使用して、5°Lの試験凍結保護溶液を取り、ピペット先端を液体窒素に突っ込みます。氷が観察された場合は廃棄します。
   2. すべての凍結保護剤を30%でテストします。成功した解決策については、20%、クライオプロテクターの10%と5%でプロセスを繰り返します。
   3. クライオプロテクタントの割合が最も小さいクライオプロテクタント溶液を利用して、結晶が存在するテストドロップに0.5μLの溶液を追加します。顕微鏡で観察し、無期限でない場合は、状態で結晶が持続する時間を与えます。
      注:これらの結晶はテスト専用であり、廃棄されます。NEMO-EEAAの場合、12%1,2-プロパンジオールは最適な凍結保護溶液です。12%は、約100nLの結晶滴に添加すると、1,2-プロパンジオールの1,2-プロパンジオールのおよその最終濃度が10%の希釈を占めます。

10. クリスタルループ

1. ループ結晶は、シンクロトロンに出荷の1-2日前に。
   注:結晶は直径約60〜100μmになります:0.05 - 0.10 mmループはループに最適です。
2. 井戸の上からテープを切りなさい。
3. 12% 1,2-プロパンジオール凍結保護剤を含む結晶化溶液を0.5μLを井戸に直接加えます。
   注:1,2-プロパンジオールの最終濃度は、100nLの滴溶液による希釈(蒸気拡散による初期200nLからのおおよその滴体積減少)により、約10%になりました。
4. 井戸から結晶をループします。
   注:結晶は、多くの場合、井戸の底に成長しますが、ループから穏やかなナッジで外れます。いったん外れたら、ループ。
5. クライオループを含む結晶を液体_N2に浸したパックに保存する。
6. これらのパックは、シンクロトロンでのX線回折の出荷の準備ができるまで、デュワーフラスコの液体N₂に保管してください。

11. データ収集

1. X線回折データを収集します。このプロトコルでは、AMXビームライン(ID:17-ID-1)、ナショナルシンクロトロン光源IIを使用します。
   注: データはサイト上で収集されましたが、リモートで収集できます。クロス偏極画像で格子均一性を示した結晶の領域でデータを収集する。結晶がゴニオメータ内で回転している間、データ収集が結晶の「貧弱な」領域を伴わないように、ループ内に結晶を配置します。最良の解像度を提供したデータは、約5 x 5 μmのサイズの結晶の延長の端に集まりました。ラスタリングを使用して^、20を収集する結晶上の最適なエリアを識別します。

12. X線データ処理

1. XDS IDXREF プログラムを使用してデータセットを最高解像度に処理し(1.8 Å)、スペース・グループ、ユニット・セル、および溶媒含有量を判別します。
2. XDS INTEGRATION プログラムを使用してデータを統合します。
3. STARANISO サーバを使用した XDS XSCALE プログラムからのプロセススケーリング強度は、データの回折限界サーフェスに対して I/σI カットオフ平均 1.2 を使用します。
   注: データは真の楕円体では切り取りません。1.2 カットオフの I/σI を超えるすべてのデータを保持します。球面の完全性のために計算されたデータに関する統計は、非球面の切り捨てのために不十分になります。楕円形の完全性は88%で、それぞれa*、b*、c軸に沿って1.88Å、2.10 Å、2.55 Åの最高解像度でした。

13. 構造ソリューション

1. PHENIX²²でMRage²¹を用いた分子置換の探索モデルとしてGCN4(PDB:4DMD)15のX線構造を利用する。4DMD構造はMRageで「アンサンブル」として定義され、MRageソリューションはNEMO-EEAAのN端子コイルコイルアダプタに対応する構造部分を構築し、検索モデルに相同化し、ダイマー内の両方のチェーンを構築しました。
   注: PHASER で異方性補正をオフにするか、データがさらにスケールバックされます。
2. PHENIXと手動建物(2F_o-F_cおよびF_o-F_cマップを使用して、Coot²⁴で)でオートビルド²³の連続ラウンドを使用して、構造の残りの部分を構築します。
3. 2F_o-F_cおよび F_o-F_cマップに基づいて、残基がまだ残基を手動でモデルに構築するには、Coot²⁴を使用します。
   注:最後の段階では、各モノマーに対して4つのN末端残基と4つのC末端残基を構築しました。サイドチェーンの配置も必要に応じて手動で調整されました。
4. PHENIXと構造の10%の省略を使用してコンポジット省略マップを計算します。

14. 構造の改良

1. PHENIXリファインで構造を絞り込みます。バルクソルベントと立体化学の重みに対して最初の絞り込みを実行し、RMSbond および RMSangle の制約をそれぞれ 0.01 および 1.0 に緩和します。個々の B 因子、TLS パラメータ、および占有率の改良を続行します。

Results

NEMOのIKK結合ドメインのクローニング、発現および精製。
この研究では、回折品質の結晶を製造したNEMO-EEAA(図1A)の最終配列を得るために、N-およびC末端におけるコイルコイルアダプタの添加、変異C76A、C95Sおよび変異E56A、E57Aを含むすべての中間構造の発現および特性評価に関与した。図1Bは、図1Cのスキームに記載されているように、精製手順全体を通して収集されたサンプルのSDS-PAGEゲルを示す。タンパク質は大腸菌で過剰発現され、SDS-PAGEゲル上の14 kDa MW重量マーカー(レーン3、収穫時に採取され、8M尿素で補うLaemmliサンプルバッファーに分解された細胞)でバンドとして現れる。タンパク質は、最初のIMACカラムの後に純粋に表示され、SDS-PAGEゲル(レー...

Discussion

非結合形態でのNEMOの結晶化の試みは、IKK結合ドメインを包含する全長タンパク質およびいくつかの切り捨て構築物を使用する試みを含め、失敗した。循環二色性によるNEMOのIKK結合ドメイン(残基44-111)の生物物理学的特徴は、NMR分光法および蛍光異方性が、IKKβと結合できるが、結晶化^9、10に適さない立体構造の状態で存在することを示した。当社のアプローチは、より安定した、折り畳まれた、ネイティブのような立体構造を採用したNEMOのIKK結合ドメインの構築を工学的に行い、結晶化を妨げる柔軟性を排除しました。理想的なコイルコイルドメインアダプタは、NEMO(44-111)配列のN-およびC末端に融合し、天然NEMOの二量体コイルコイルフォールドを安定化し、結晶化^を促進するという利点を提供する。一連のタンパク質構築物の挙動は、SDS-PAGEを介して各ステップで監視され、サイズ排除クロマトグラフィー、円形二色性、蛍光異方性およびNMR分光法、前に説明

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
20% w/v &γ;-PGA (Na+ form, LM)	分子寸法	MD2-100-150	NEMO-EEAA
3.5 kDa MWCO 透析膜	スペクトル/POR	132724	イミダゾールの透析除去用
アミコン攪拌細胞	ミリポーズシグマ	UFSC 05001	タンパク質濃度
塩化アンモニウム	ミリポア	ΣG8270	最小限のメディアラベリング用
ベンゾナーゼヌクレアーゼ	ミリポアシグマ	9025-65-4	核酸の消化用
BL21-CodonPlus (DE3)-RIL コンピテントセル	Agilent Technologies	モデル:	230245 TEV 発現
CryoPro	Hampton Research	HR2-073	クライオプロテクタントキット
D-グルコース (デキストロース)	ミリポアシグマ	A9434	用最小限のメディアラベリング
Difco Terrific Broth	ThermoFisher	DF043817	培養成長用
Dithiothreitol > 99%	Goldbio	DTT25	ジスルフィドの還元用
大腸菌: Rosetta 2 (DE3)	Novagen	71400-3	非標識 NEMO-EEAA
Formulator	Formulatrix		液体ハンドラー/スクリーンビルダー
HCl –1.0 M Solution	Hampton Research	HR2-581	NEMO-EEAA
HiLoad 16/600 Superdex 75 pg	GE Healthcare	28989333	サイズ排除精製用
HisTrap HP 5 mL カラム	GE ヘルスケア	17524802	His-tagged NEMO-EEAA
HT 96 MIDAS	分子寸法	MD1-59	NEMO-EEAAのスパースマトリックススクリーニング用
HT 96 モルファイアス	分子寸法	MD1-46	NEMO-EEAAイミダゾールのスパースマトリックススクリーニング用
	サーモフィッシャー	288-32-4	ヒストラップカラムからの溶出用
イソプロピル-β-D-チオガラクトシ	ド ゴールドバイオ	I2481C5	培養物の誘導用
MRC2結晶化プレート	ハンプトンリサーチ	HR3-083	結晶化プレート
NT8 - ドロップセッター	Formulatrix		結晶化
pET-16b	ミリポアシグマ	69662	NEMO-EEAA
pET-45b	ミリポアシグマ	71327	NEMO-EEAA
フェニルメチルスルホニルフッ化物	サーモフィッシャー	36978	プロテアーゼの阻害用
カーボネートボトル 超遠心分離機ロータータイプ45で使用するTi	Beckmann Coulter	339160	超遠心分離機のびん
ポリエチレン グリコール 20,000	ハンプトンの研究	HR2-609
pRK793 (TEV)	Addgene	プラスミド 8827	TEVの生産のため
QuikChange XL II	Agilent Technologies	200522	サイト指向の突然変異誘発
必要なキャップ アセンブリ:	ベックマン・コールター	355623	Ultracenttrifuge ボトルキャップ
ROCK IMAGER	Formulatrix		結晶化イメージャー
シードビーズキット	ハンプトンリサーチ	HR2-320	シード生成
塩化ナトリウム ≥ 99%	ミリポア シグマ	S9888	精製溶液の緩衝用
TCEP (トリス (2-カルボキシエチル) ホスフィン塩酸塩)	Goldbio	TCEP1	還元剤
バークレースクリーン	リガク	MD15-Berekely	NEMO-EEAAのスパースマトリックススクリーニング用
PGAスクリーン	分子寸法	MD1-50	NEMO-EEAAの微細スクリーン結晶化用
トリス – 1.0 M Solution	Hampton Research	HR2-589	NEMO-EEAA
Ultrapure Tris Buffer (powderフォーマット)	サーモフィッシャー	15504020	精製溶液の緩衝用
尿素	サーモフィ	ッシャー29700	NEMO-EEAAの変性用