成体マウス脳半球の異なる解剖領域からミクログリアを分離するためのプロトコルを提供し、続いて全長転写物の深い単一細胞RNAシーケンシングのための半自動化ライブラリ製剤を提供する。この方法は、健康と疾患におけるミクログリアの機能的不均一性を解明するのに役立ちます。
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この記事について
サマリー
要約
中枢神経系の常駐マクロファージとして、ミクログリアは脳の発達と恒常性を積極的に制御し、その機能不全がヒト疾患を駆動する可能性がある。恒静性ミクログリアの分子シグネチャや、環境刺激に応じた遺伝子発現の変化を明らかにするために、かなりの進歩が見られた。単一細胞ゲノム方法論の出現と成熟により、異種ミクログリアは、異なる発達および病理学的条件において果たす多様な役割の根底にある可能性がますます認識されています。このような不均一性のさらなる解剖は、目的の所定の領域からミクログリアを効率的に分離することによって達成され、続いて個々の細胞の敏感なプロファイリングが行われる。ここでは、単一の成人マウス脳半球における異なる脳領域からのミクログリアの迅速な分離のための詳細なプロトコルを提供する。また、プレートベースのディープシングルセルRNAシーケンシングにこれらのソートミクログリアを使用する方法も示します。この方法の適応性を他のシナリオに議論し、大規模な研究に対応するためのシステム改善のためのガイドラインを提供する。
概要
ミクログリアは、全神経細胞の5%−10%を表し、中枢神経系(CNS)1全体に散在するマクロファージである。血液脳関門の背後で保護され、健康な成人の脳の典型的なミクログリアは、急速に拡張し、毛陰腫のニューロンや他のグリア細胞と相互作用するために後退する多くの微細なプロセスを含んでいます。ミクログリアはまた、特定の発達段階の間、または傷害および疾患1、2、3、4における免疫上の課題に関連する貪食性形態を採用することができる。最近のエキサイティングな発見は、ミクログリアが脳由来または病理学的シグナルに対して決して受動的な傍観者ではなく、脳の発達と恒常性を制御する上で極めて重要な役割を果たすことを明らかに示している。ミクログリアのより多くの機能が解明されるにつれて、TREM2のような多くの神経変性疾患リスク遺伝子がミクログリア5、6、7によって主にまたは排他的に発現されることを示したヒト遺伝学研究によって興奮がさらに促進される。
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プロトコル
げっ歯類に関するすべての手順は、スタンフォード大学のガイドラインに準拠し、国および州の法律およびポリシーに準拠しています。すべての動物の手順は、スタンフォード大学の実験動物ケアに関する行政パネルによって承認されました.
注:すべてのソリューションおよびバッファー構成は、材料の表に記載されています。
1. 細胞分離の日の準備
- 培地A(50mL)、磁気活性化細胞選別(MCS)緩衝液(30mL)、FACS緩衝液(25mL)、リン酸緩衝生理食塩水(PBS;30mL)、DNase(320μL)、およびRNase阻害剤(30°L)の氷上で冷却します。
注:ここで提供される体積は、単一のマウス脳半球の4つの脳領域(例えば、皮質、小脳、海馬および線条体)からミクログリアを分離するのに十分である。より多くの組織を使用する場合はスケールアップします。 - 4つのきれいな2 mLダウンスホモジナイザーを氷の上に置き、DNaseの80°L(12,500単位/mL)と5μLのRNase阻害剤を持つ培地Aの2 mLを各Dounceホモジナイザーに加えます。ピストンを15 mLチューブで冷やします。
- 組織採取のための脳領域を持つ4つの6 cmペトリ皿にラベルを付け、氷の上の各皿に冷たい媒体....
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結果
このプロトコルは、1人の成人の浸透した脳半球において異なる脳領域からミクログリアを分離およびソートする方法を記述し、続いてscRNA-seqを行う。私たちは、単一の細胞懸濁液を作成するために、またミクログリアを豊かにするための最初のステップとして、ドーニングを使用しています。不十分または過度の実行は、収量を減少させます。さらに、大人のマウスの脳はミエリンの高レベルを含み、適切に除去されない場合は、並べ替え効率と収量を減らすこともできます。そこで、抗体染色を行う前に、トリパンブルーと血球計を用いて顕微鏡下で細胞懸濁液を調べ、ミエリン除去の収率、細胞生存率及び有効性(ステップ4.9)を推定した(図1)。この時点での総細胞数は、皮質の場合は 30,000 を超え、他の組織の場合は 5,000 を超える必要があります。細胞の90%以上は、ミエリンの破片をほとんど持って生きられるはずです。
私たちは、典型的にはCD45低およびCD11b陽性であるミクログリア(または骨髄細胞)をソートするためにFACSマシンを使用します。少なくとも皮.......
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ディスカッション
ミクログリアは、CNSの他の細胞タイプと積極的に相互作用し、環境刺激に非常に敏感です。単離過程における炎症反応および遺伝子発現の異常変化を最小限に抑えるために、このプロトコルは以前に公開された方法9から合理化され、ミクログリアを単一マウス脳半球の複数の領域から並列に分離するのに適している。組織および試薬は冷温に保たれ、実験は限られた組織サイズに基づいて少ないワッシュおよびより少ない試薬とタイムリーに(解剖から選別まで約3.5時間)行われる。機械的解離は、ミクログリア9、18にほとんど損傷や活性化を引き起こしながら、ニューロンや他のグリア細胞を除去することができるので、酵素消化などの他の均質化方法をドーニングすることを選択します。しかし、過度のドーニングはミクログリアの収率を低下させる可能性があるため、避けるべきです。機械的解離およびビーズベースのミエリン除去の後、FACSソートは、古典的な炎症遺伝子の最小発現に基づいてミクログリアへの活性化が少なく、例えば、Tnf、Il1b.......
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開示事項
著者たちは何も開示する必要はない。
謝辞
私たちは、このプロトコルの開発中に彼らの助けをマリコL.ベネット、リアナニコールボナンノ、およびスパイロスダルマニスに感謝します。また、スタンフォード・シェアドFACS施設、特にメレディス・ウェグラーツとリサ・ニコルズに感謝します。スタンフォード・プロテイン・アンド・核酸施設(PAN)のヤン・トラン、マイケル・エッカートが撮影を大いにサポート。この作品は、JPB財団とヴィンセント・J・コーツ財団が出資しています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 5 M Betaine | Sigma-Aldrich | Cat# B0300-5VL | |
| 10 mM dNTP mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# R0192 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15575020 | |
| 10X Hanks'Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | Cat# 14185-052 | |
| 1 M HEPES | Thermo Fisher Scientific Cat | # 15630080 | |
| 1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix | Kapa Biosciences | Cat# KK2602 | |
| 5 mL 丸底ポリスチレンチューブ、セルストレーナーキャップ付き | Corning | Cat# 352235 | |
| AATI、高感度 NGS フラグメント解析キット (1 bp –6,000 bp) | Advanced Analytical | Cat# DNF-474-1000 | |
| ウシ血清アルブミン | Sigma Aldrich | Cat# A8806 | |
| DNase I | Worthington | Cat# LS002007 | ワーキングソリューション:12500 units/ml |
| DTT, Molecular Grade | Promega | Cat# P1171 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# 4456740 | |
| ウシ胎児血清 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | カタログ# 10437-028 | |
| イルミナXTインデックスキット v2 セットA (96インデックス) | イルミナ | カタログ# FC-131-2001 | |
| イルミナXTインデックスキット v2 セットB (96インデックス) | イルミナ | カタログ# FC-131-2002 | |
| イルミナXTインデックスキット v2 セットC (96インデックス) | ミナ | カタログ# FC-131-2003 | |
| イルミナXTインデックスキット v2 セットD (96インデックス) | イルミナ | Cat# FC-131-2004 | |
| エキソヌクレアーゼ ラムダ (5 U/μl) | New England BioLabs | Cat# M0262S | |
| Mouse Fc block | BD Pharmingen | Cat# 553142 | |
| Myelin removal beads | Miltenyl Biotec | Cat# 130-096-433 | |
| Nextera XT DNA Sample Prep Kit | Illumina | Cat# FC-131-1096 | |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Cycles) | Illumina | Cat# 20024907 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 70011044 | |
| PCRClean DX beads | Aline Biosciences | Cat# C-1003-50 | |
| ヨウ化プロピジウム | Thermo Fisher Scientific | Cat# P3566 | 染色: 1:1000 |
| 量子ビット dsDNA HS アッセイキット | Thermal Fisher Scientific | Cat# Q32851 | |
| ラットモノクローナル抗マウス/ヒト CD11b, Brilliant Violet 421 (クローン M1/70) | BioLegend | 猫#101236;RRID: AB_11203704 | 染色: 1:300 |
| ラットモノクローナル抗マウス CD45, PE/Cy7 (クローン 30-F11) | Thermo Fisher Scientific | Cat# 25-0451-82;RRID: AB_469625 | 染色: 1:300 |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara Bio | Cat# 2313B | |
| SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl) | Clontech | Cat# 639538 | 5x First Strand buffer |
| Oligonucleotides | |||
| 0.1 μM ISPCR Oligo: 5' - AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3' | (Picelli et al., 2014) | ||
| Oligo-dT30VN primer: 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3' | (Picelli et al., 2014) | ||
| TSO 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3' ("r" は forribobases で、"+" は LNA 塩基用)( | Picelli et al., 2014) | ||
| Solutions | |||
| FACS緩衝液 | レシピ:滅菌ろ過された1% FBS、2 mM EDTA、25 mM HEPES含有1X PBS | ||
| MCS緩衝液 | レシピ:滅菌ろ過された0.5% BSA、2 mM EDTA含有1X PBS | ||
| Medium A | レシピ:15 mM HEPES、0.5% グルコース含有、フェノールレッド | ||
| <およびストロング>プレート | |||
| 384ウェル Rigi-Plate PCR Microplates, Axygen Scientific | VWR | 89005-556 | |
| ハードシェル 96-well PCR プレート | バイオ・ラッド | HSP9631 | |
| Others | |||
| Dumont #55 鉗子 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dounce ホモジナイザー, 2 ml | ウィートン | ||
| 大型空捺 | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| 大型セレクションカラム | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| QuadroMACS セパレーター | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RNAzap | サーモフィッシャーサイエンティフィック | AM9780 | |
| ストレーナー(70 μm) | Falcon | 352350 | |
| Equipment | |||
| BD FACSAria II | BD Biosciences | http://www.bdbiosciences.com/ | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| フラグメントアナライザー | Agilent | 5300 | |
| Mosquito HTS ナノリットルピペッティングロボット | TTP Labtech | https://www.ttplabtech.com/ | |
| Qubit 4 蛍光光度計 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | Q33226 |
参考文献
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Li, Q., et al. Developmental Heterogeneity of Microglia and Brain Myeloid Cells Revealed by Deep Singl....
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再版と許可
