3次元スフェロイド培養からの幹様細胞の分離

ヒト前立腺には、分泌機能を有する明るい上皮と、その根底にある基底細胞と、異常な神経内分泌細胞成分が含まれています。上皮細胞は、この場合、生体内で比較的静止している前立腺幹細胞の稀な集団から生成され^、生涯を通じて腺恒常性を維持するための修復システムとして作用する。多くの進歩にもかかわらず、前立腺幹細胞の同定および機能的単離は、この分野における主要な課題であり続ける。幹細胞バイオマーカーは、フローサイトメトリーと組み合わせた細胞表面マーカーベースの方法論を含む、幹細胞研究^2、3、4に一般的に使用される。しかしながら、濃縮および単離の結果は、マーカーの組み合わせおよび抗体特異性^5、6の機能として大きく異なり、単離された細胞の同一性に関する疑問を提起する。幹細胞様細胞濃縮のためのもう一つの広く用いられているアプローチは、三次元(3D)回転楕円体培養^物2、3、4である。常駐幹細胞はニッチ拘束を伴う生体内で比較的静止しているが、それらは3Dマトリックス培養(対称と非対称の両方)で細胞分裂を受け、系統コミットメント^7、8に向けて急速に再生する幹細胞および前駆細胞の両方を生成する。形成された回転楕円体は、初期段階および後期前駆細胞を含む系統コミットメントの様々な段階で幹細胞と前駆細胞の両方を含む異種混合物である。したがって、スフェロイド全体を用いたアッセイは幹細胞を排他的ではなく、独特の幹細胞特性の同定は決定的ではない。したがって、前立腺幹細胞を識別し、娘の前駆体から分離するアッセイを作成することが重要です。この目的に向かって、現在のプロトコルの目標は、ヒト前立腺組織からの幹細胞の効率的な同定と単離を可能にするアッセイシステムを確立し、その生物学的機能の堅牢な下流分析を行うことです。

長期5-ブロモ-2'-デオキシウリジン(BrdU)標識保持は、その長期倍増時間^9、10に基づいて幹細胞のインビボおよびインビトロ系統トレースに広く使用されている。本明細書に記載される前立腺幹細胞同定および単離のための現在のアプローチは、混合上皮集団内の相対的な静止特性および標識保持特性に基づいている。さらに、不死鎖DNA仮説に基づいて、幹細胞のみが非対称細胞分裂を受けることができる。幹細胞は、古い親のDNAを含む娘細胞を表し、コミットされた娘細胞である前駆細胞は、新たに合成されたDNAを受け取ります。上記のユニークな幹細胞特性は、一次培養における親幹細胞におけるBrdU標識を行い、3Dアンカーフリー回転楕円体培養への転写時にBrdU-ウォッシュアウト後にそのラベルを追跡するために利用される。一次前立腺上皮細胞の大部分は、2D培養において基底および通過増幅表現型を保持する一方で、3Dシステム^3、12への転移時に対応する培養媒体を有するスフェロイドまたは完全に分化したオルガノイドの形成によって証明されるように、多能性幹細胞の補充および維持の稀な集団もある。現在のプロトコルでは、HPrEC前立腺回転楕円体またはプロスタスフィアベースのBrdU、CFSE、またはファーレッド保持アッセイを使用し、続いて蛍光活性化細胞選別(FACS)を使用して、単一細胞レベル¹³でスフェロイド中の標識保持幹細胞を同定する。

重要なことに、系統へのコミットメントを有する前駆細胞と比較して、早期スフェロイド内の標識保持細胞の幹細胞特性をさらに確認した。これらには、幹細胞不斉分裂、インビトロ回転楕円体形成能および生体内組織再生能、オートファジー活性の上昇、増強リボソーム生体形成および代謝活性の低下が含まれる。続いて、RNAAseq分析を行った。標識保持スフェロイド細胞において微分発現した遺伝子は、ヒト前立腺幹細胞の新規バイオマーカーとなる可能性が認められた。この回転楕円体ベースの標識保持アプローチは、少数の癌幹細胞を同様に同定する癌検体に適用され得^る。以下に提示する、ヒト原発性前立腺上皮細胞(HPrEC)を例に用いたプロスタスフィアベースの標識保持アッセイである。

すべての細胞処理および媒体調製物は、クラスIIの生物学的安全キャビネット(BSC)の無菌技術で行われるべきである。

1. 2DにおけるHPrEC細胞の培養と維持

1. 2.5 μg/cm 2フィブロネクチン溶液の2mLを室温(RT)で一晩コートします。溶液を吸引し、培養皿をBSCで45分間空気乾燥させ、フィブロネクチンコーティングされた培養料理を4〜4週間保存することができます。
2. 前立腺上皮細胞増殖培地(例えばPrEGM)の9mLをフィブロネクチンコーティングされた100mm培養皿に加え、37°Cの_CO2インキュベーターで温かく保ちます。
3. 37°Cの水浴で凍結したHPrEC細胞(2 x 10⁵/mL)のバイアルを1つ解凍し、10mLの温かい培地で細胞を再中断します。
4. RT.アスパイアで5分間500 x gで細胞懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄する。
5. 温かい培養培地の1mLで細胞を十分に再中断する。1mLの細胞懸濁液を、前温培地の9mLを含むフィブロネクチン被覆100mm培養皿に直接ピペットすることにより種子細胞を用いる(培地及び細胞の総体積は10mLである)。培養料理を37°Cの_CO2インキュベーターに戻します。
6. 2日ごとに培地を補充します。これを行うには、慎重にすべてのメディアを吸引し、新鮮な暖かい媒体の10 mLを追加します。
7. 約5日間で、培養物が約70~80%のコンフルエントであることを確認します。3mLの3mLの細胞を37°Cで5分間インキュベートして酵素消化を行います。
8. 10%FBSを含む3mLの暖かいPBSを加えて消化を停止する。
9. 細胞を50mL遠心管に集め、500 x gで500 x gで5分間、RT.アスパイアで上清を廃棄します。
10. 30 mLの温かい媒体で細胞ペレットを再スペンドし、次の通路のために3つの新しいフィブロネクチンコーティングされた100ミリメートル培養皿に均等に分配します。
    注:原発性HPrEC細胞は、基底上皮細胞特性を変えることなく〜3〜5倍の通路が可能です。上皮表現型は、細胞化化学/免疫蛍光(ICC/IF)アッセイを用いて、基底上皮細胞マーカーサイトケラチン5およびp63の式によって試験される。

2. BrdU、CFSE、またはファーレッドプロ染料によるHPrECのラベリング

注: セルは、ステップ 2.1 またはステップ 2.2 に進み、ステップ 3.1 で説明したように 3D プロスタスフィア培養への転送を続けることができます。

1. BrdUを用いた細胞の単一標識
   1. 培養2 x 10⁵ HPrEC細胞をフィブロネクチン被覆100mm培養皿に、1μMのBrdUを含む温かい培地を用いた10mLの培養物。前立腺幹および前駆細胞を含むすべての細胞の標識を確実にするために、細胞を10日間(2箇所以上)培養する。
   2. 10日後、BrdUを含むPrEGM培地を慎重に吸引し、5mLの温かいPBSで細胞を洗浄する。1x を繰り返します。
   3. 手順 1.7 ~ 1.8 の説明に従って、0.05% トリプシン/EDTA を使用して酵素消化を実行します。細胞をRTで5分間500×gで遠心分離し、上清を廃棄します。
   4. BrDU標識ペレット化細胞(5 x 10⁴⁾を500μLの氷冷(1:1)基底膜マトリックス/培地に再中断し、3Dプロスタスフィア培養(ステップ3.1で説明)に移し、スフェロイド形成中にBrdUウォッシュアウトを許可する(~6細胞サイクル)。
2. BrdUおよびCFSEまたはファーレッドプロ染料を用いた細胞の二重標識
   1. 生細胞の共同標識が必要な場合は、ステップ2.1から10日間BrdUでインキュベートされた事前標識された細胞を取り、5 μM CFSEまたはファーレッドライブ細胞蛍光プロ染料を30分間共同標識します。
   2. BrdUとCFSEまたはファーレッドプロ染料を含む媒体を慎重に吸引する。5 mL の暖かい PBS で細胞を洗浄します。洗浄1xを繰り返します。
   3. 手順 1.7 ~ 1.8 の説明に従って、0.05% トリプシン/EDTA を使用して酵素消化を実行します。細胞を500 x gで5分間RTで遠心分離し、上清を取り除き、廃棄します。
   4. 共標識細胞(5 x 10⁴⁾を500°Lの氷冷(1:1)基底膜マトリックス/培地に再び中断し、3Dプロスタスフィア培養(セクション3.1に記載)に5日間移し、スフェロイド形成中にBrdUおよびCFSEまたは極赤色のウォッシュアウトを許可します(〜6細胞サイクル)。
3. ステップ4.1、4.2、4.3、または5の説明に従って、球(5日目のプロスタスフィア)の標識保持セルの検出を実行します。
   注:カルボキシフルオレセインジアセテートコハクニミジルエステル(CFSE)とファーレッドは、長持ちする蛍光プロ染料であり、標識された細胞内でよく保持されています。生細胞中の細胞内エステラーゼは、現在膜不浸透となっている緑色または赤色の蛍光分子を活性化する酢酸基を切断する。

3. 3D基底膜培養システムにおけるプロスタスフィア形成

1. 3D基底膜マトリックスシステムにおけるプロスタスフィア培養
   1. 一晩で4°Cで基底膜マトリックスを解凍し、使用前に氷の上に保ちます。
   2. 氷冷基底膜マトリックスを1mLを氷冷培養培地の等量に加えます。気泡を避けて上下にピペットでゆっくりと混ぜます。
      注:この溶液の100°Lで12ウェル培養プレートウェルの底部を事前にコーティングします。これにより、マトリックスを通過するセルの数が最小限に抑え、単層として成長します。
   3. 5 x 10⁴ HPrEC細胞を氷冷(1:1)基底膜マトリックス/培養培地で500μLの総体積で混合して再サスペンドします。
   4. 各ウェルの底縁の周りにこのセル溶液のピペット500°L。
   5. プレートを旋回して、井戸の縁の周りに混合物を均等に分配します。プレートを_CO2インキュベーターに37°Cで30分間入れ、マトリックスを固めます。
   6. マトリックスが固化したら、ウェルあたり1mLの温培養培地で覆う。基底膜マトリックスリングを乱さないでください。慎重にピペットの先端を目指し、井戸の中心に培養培地を分配します。
      注:培養培地は、固化した基底膜マトリックスに添加する際に37°Cに温める必要があります。基底膜マトリックスは、その完全性を失い、冷たい/クールな媒体にさらされると溶解します。
   7. 2日ごとに培地を補充します。使用した培地の〜500μLを慎重に吸引し、新鮮な温培養培地の500°Lを追加します。
   8. 反転顕微鏡を使用して、プロスタスフィアの形成と成長を5~7日間監視します。
2. プロスタスフィアの通過
   1. 可能な限り多くのメディアを慎重に吸引することにより、マトリックスからプロスタスフィアを収穫します。固化したマトリックスの浮遊部分を乱したり拾ったりすることは避けてください。
   2. 1 mL のディスパーゼ溶液 (基底膜マトリックス:1:2 の比率でディスパーゼ) を追加します。何度か上下にピペットを組んで十分に混ぜます。
   3. 培養プレートを_CO2インキュベーターで37°Cで30分間インキュベートします。
   4. 球数カウントとサイズ測定のための培養皿の底にあるプロスタスフィアの画像を撮ります。
   5. 球体混合物を15 mLチューブに集めます。RTで5分間500 x gで懸濁液を遠心分離し、球体をペレットにします。吸気して上清を捨てる。
   6. 500°Lの温かいトリプシン/EDTAで消化し、懸濁液を1.5mLマイクロ遠心管に移すことによって、球体を単一細胞に分散させます。
   7. 37°Cの_CO2インキュベーターでマイクロ遠心チューブを5分間インキュベートします。
   8. 10%FBSを含む500 μLの暖かいPBSでトリプシン作用を停止します。26 G針5xの1mLシリンジを通して消化球懸濁液を通過し、球体を単一の細胞に解離します。
   9. 5分間500xgで懸濁液を遠心分離し、RTで細胞をペレット化し、上清を吸引して廃棄する。
   10. 温かい培養培地の1mLで細胞ペレットを再サーデさせ、40μmの細孔サイズのナイロンセルストレーナーを通して濾過します。
   11. 5分間500xgで細胞懸濁液を遠心分離し、RT.アスパイアで細胞をペレット化し、上清を廃棄する。
   12. 細胞ペレットを1mLの氷冷(1:1)基底膜マトリックス/培養培地で再サージし、プロスタスフィアの第2通路の3D基底膜マトリックスにサブカルチャーを行う。

4. 免疫蛍光染色によるBrdU保持前立腺幹細胞の同定

1. 付着したプロスタスフィアをアウトグローし、続いて前立腺幹細胞2Dイメージング用の免疫蛍光(IF)染色を行う。
   1. ステップ3.2.1-3.2.3で説明されているように、消化をディスパスすることによってプロスタスフィアを収穫する。5分間500 x gで1.5 mLマイクロ遠心管内の球を遠心分離します。
   2. 温かい培養培地の1 mLで球体を再サスペンドする。
   3. 球体の付着と伸びを可能にするために、37°Cのインキュベーターで200°Lの培養培地で8ウェルチャンバースライドでウェルあたり〜50プロスタスフィアをインキュベートします。
   4. 2日目に、吸引し、培養培地を廃棄する。成長した球体を200μLのPBSで5分間洗います。
   5. 氷冷メタノールの200μL/ウェルの球を-20°Cで20分間固定します。
   6. 200 μL/ウェルのPBSで球を5分間洗います。
   7. RTで30分間2N HClの200 μL/ウェルを備えた酸洗浄球。
   8. 200 μL/ウェルのPBSで球を5分間洗います。
   9. PBST(0.25%トリトンX-100のPBS)に5%の正常ヤギ血清を含むブロッキング溶液を100μL加え、RTで30分間インキュベートします。
   10. ブロッキング溶液を吸引し、2%の正常ヤギ血清と一次マウス抗ヒトBrdU抗体(1:200)を含むPBSTの100μLを各ウェルに加え、一晩4°Cで加湿箱にインキュベートします。
       注:マウスIgG抗体は陰性対照として用いられる。
   11. 吸引し、一次抗体溶液を除去します。200 μLのPBSで球を5分間洗います。
   12. 2%の正常ヤギ血清と二次ヤギ抗マウスAlexa Fluor 488抗体(1:500)を含むPBSTの100μLを各ウェルに加え、暗闇の中で2時間RTでインキュベートします。
   13. 二次抗体溶液を吸引し、除去する。200 μL の PBS で球を 5 分間洗います。
   14. DAPIを含む水性取り付け媒体の~25~40°Lでスライドを取り付けます。
   15. 蛍光顕微鏡とカラーデジタルカメラで染色された球体/細胞の画像を取得します。
2. 前立腺幹細胞3Dイメージングのためのプロスタスフィアの全マウントIF染色
   注:全体のマウントIF染色のために、プロスタスフィアは1.5 mLマイクロ遠心管を使用して処理されます。
   1. ステップ3.2.1~3.2.3に記載されているように、消化を分別してプロスタスフィアを収穫する。5分間500 x gで1.5 mLマイクロ遠心チューブ内の球を遠心分離し、上清を吸引し、廃棄します。
   2. RTで4%パラホルムアルデヒドの1 mLで球を再サスペンドして固定し、5分間500 x gで球を遠心分離し、上清を吸引して廃棄します。
   3. PBSのペレットを1 mLで再サスペンドして球体を洗います。5分間500 x gで球を遠心分離します。1x を繰り返します。
   4. 酸は、2N HClの1 mLでペレットを30分間再サスペンドして球体を洗浄する。
   5. 1 mLのPBSで球を5分間洗い、500 x gで5分間遠心分離機を洗い、上清を吸引して廃棄します。3x を繰り返します。
   6. PBST(0.25%トリトンX-100のPBS)で5%の正常ヤギ血清を含むブロッキング溶液の100°Lで〜15〜30球を再サスペンドし、RTで30分間インキュベートします。
   7. ブロッキング溶液を除去するには、5分間500 x gで球を遠心分離し、吸引し、上清を廃棄します。
   8. 2%の正常ヤギ血清および一次マウス抗ヒトBrdU抗体(1:200)を含むPBSTの球体を100μLで再サスペンドし、4°Cで一晩インキュベートする。
   9. PBSのペレットを1 mLで再サスペンドして球体を洗います。5分間500 x gで球を遠心分離します。1x を繰り返します。
   10. 2%の正常ヤギ血清と二次ヤギ抗マウスAlexa Fluor 488抗体(1:1,000)を含むPBSTの球体を100μLで再サスペンドし、RTで2時間インキュベートします。
   11. PBSのペレットを1 mLで再サスペンドして球体を洗います。5分間500 x gで球を遠心分離します。1x を繰り返します。
   12. DAPIを含む水性取り付け媒体の30~50°Lで球を再サスペンドします。球体の平坦化を防ぐために、カバーガラス底の35mm未塗装の培養皿から作られた井戸にそれらを分配します。その後、井戸をカバーし、培養皿にカバースリップを追加します。
   13. 透過光反転蛍光共焦点顕微鏡を用いて球全体のZスタック画像を取得します。フリーフォーム描画機能を備えたイメージングソフトウェアを使用して、これらのZスタックイメージを3Dイメージに変換します。
       注:マウスIgG抗体は陰性対照として用いられる。
3. 対細胞解析(4日間プロトコル)
   1. BrdU ラベルの球を 5 日目に培養します。
   2. 1日目:1mLのディスパス消化で基底膜マトリックスから球を収穫する。ステップ3.2.1~3.2.11に記載されているように、1.5 mLマイクロ遠心管内の500°Lの温かい0.05%トリプシン/EDTAによって単一細胞に分散します。
   3. 細胞を1mLの温培養培地で再中断する。
   4. 分散した単一細胞(ウェルあたり〜300〜500)を8ウェルチャンバースライドにプレートし、200μL/ウェル培養培地で一晩培養し、取り付けを可能にします。
   5. 2日目:培養培地中の200μLのサイトチャラシンDを用いて培養培地を変更し、37°Cで一晩インキュベートして、メタフェーズ後期に一時停止する1つの細胞分裂をアナフェイズに許可する。
   6. 3–4日目:吸引し、媒体を廃棄します。200 μL/ウェルの氷冷メタノールを-20°Cで20分間固定します。
   7. 蛍光顕微鏡でペアリングされた細胞の画像を撮ります。2つの核間の距離が30μm未満であることを確認します。
      注:BrdU標識保持前立腺幹細胞は対称分裂を起こして同量のBrdUを保持する2つの娘幹細胞を生じるのに対し、非対称分裂を起こす幹細胞は、すべてのBrdUとBrdUラベルを失った他の娘前駆細胞。

5. FACS選別によるCFSE標識保持前立腺幹細胞の単離

1. 5日目:培地を2mLのディスパーゼ(基底膜マトリックス:1:2比でディスパス)に置き換えて、3D培養中の6ウェルカルチャープレートで成長するCFSE標識5日目プロスタスフィアを収穫する。ピペットを数回上下に切り、徹底的に混ぜます。
2. 37°Cの_CO2インキュベーターでプレートを30分間インキュベートし、マトリックスを消化します。
3. 球体混合物を15 mL遠心管に集めます。RTで5分間500 x gで球を遠心分離します。
4. 温かい0.05%トリプシン/EDTAの500°Lで球ペレットを再サスペンドし、1.5 mLマイクロ遠心管に移します。
5. CO2インキュベーター内の球を37°Cで5分間インキュベートします。
6. 26 G 針 5x で 1 mL シリンジを通して球を通過し、球を完全に単一のセルに解離します。
7. 細胞をRTで5分間500×gで遠心分離し、上清を廃棄します。
8. 1μg/mLプロピジウムヨウ化物(PI)を含む温培養培地の細胞を1mLで再ステントし、死んだ細胞を染色する。RTで1分間インキュベートします。
9. 細胞をRTで5分間500×gで遠心分離し、上清を廃棄します。
10. 細胞を1mLの温培養培地で再中断する。細胞をRTで5分間500×gで遠心分離し、上清を廃棄します。
11. 500°Lの温かい培養培地で細胞を再サスペンドし、35μmの細孔サイズの細胞ストレーナースナップキャップを通して濾過することにより、5 mLポリスチレン丸底管に細胞を収集します。
12. トリプシン分散型CFSE標識プロスタスフィア細胞の解析をシングルチャネルFACSアナライザで行います。
13. 分数 CFSE^Hi、CFSE^Med、および CFSE^Loセルのサブ母集団をゲートします。ゲーティングには負のコントロールと正のコントロールを使用します。
    注:FACSソートされたCFSE標識保持前立腺幹細胞(Hu et al.¹³を参照)の存在は、緑色蛍光顕微鏡法および非保持細胞と比較してその大きな細胞サイズによって確認することができる。この大きな細胞サイズは、前駆細胞集団に対する前立腺幹細胞の性質である。これは、他の組織タイプと異なる場合があります。

原発正常ヒト前立腺上皮細胞は、フィブロネクチン被覆培養皿に入れられ、細胞増殖は2D培養中に維持される(図1a)。基底膜マトリックスで3D培養に移ると、分化した上皮細胞はゆっくりと死ぬ。前立腺幹細胞だけがアンカーフリー培養で生き残ることができ、5日間で回転楕円体を形成する(図1b)。

2D培養における前立腺上皮細胞の二重標識の後に3D培養におけるスフェロイド形成が続き、同じ標識保持細胞におけるBrdU、CFSE、および極赤の共振化を示す(図2a-i)。

標識保持細胞は、5日目のスフェロイドにおける幹細胞特性を示す。二重免疫染色は、標識保持細胞がサイトケラチンタンパク質KRT14のより低いレベルを示すことを示す;減少した細胞接合タンパク質 E-カドヘリン14;増加した幹細胞初期マーカータンパク質Wnt10B13、15、16およびALDH1A1;オートファジータンパク質LC3の増加、オートファジーフラックス活性の指標17;ミオシンIIBを増加させ(図3a-f)。

スフェロイドベースの標識保持アッセイは、前立腺癌検体における癌幹細胞様細胞の検出にも成功する(図4)。これにより、がん幹細胞に対する真のバイオマーカーの発見が可能になり、前立腺癌の新しい治療標的を同定する可能性がある。

図1:2D培養におけるHPrECの維持と3D培養における回転楕円体形成(a)HPrECの2D一次培養物をBrdU標識し、5日目(b)にプロスタスフィア形成を伴う3D培養に転移した。スケールバー = 400μm.ここをクリックすると、この図の大きなバージョンが表示されます。

図2:一次プロスタスフィアにおける長期標識保持細胞の同定BrdU(赤)とCFSE(緑)の二重ラベリング。CFSE (緑) と遠赤 (赤)BrdU(緑)と極赤(赤)は、親DNAの保持を有する同じ幹状細胞を同定した。急速に分割する前駆細胞(DAPI、青)のBrdU、CFSE、またはファーレッドラベルは希釈され、失われました(a-i)。代表的な画像は、BrdU/CFSE(a-c)(上パネル)、CFSE/ファーレッド(d-f)(中央パネル)、および単一プロスタスフィア (PS) セルでの BrdU/Far Red (g-i) (下側パネル) の共同ラベリングを示しています。スケールバー = 50μm.ここをクリックすると、この図の大きなバージョンが表示されます。

図3:幹細胞特性を示す標識保持PS細胞。非標識保持前駆細胞と比較して、BrdUまたはCFSE標識保持幹細胞は、cytokeratin 14(KRT14)の低レベルを示し、(b)Eカドヘリンのレベルの低下、(c)Wnt10Bのレベルの上昇レベル、(d)より高いレベルのALDH1A1、(e)増加LC3、および(fIB)を示す。スケールバー = 50μm.ここをクリックすると、この図の大きなバージョンが表示されます。

図4:がん幹細胞の同定のための球系標識保持アッセイを用いた。ヒト前立腺癌標本に由来するスフェロイド中のCFSE標識保持癌幹細胞は、非標識前駆細胞に対して減少したE−カドヘリンタンパク質を示した。スケールバー = 50μm.ここをクリックすると、この図の大きなバージョンが表示されます。

著者は開示する財政的な関係を持っていません。