患者前立腺癌骨転移標本及びその異種移植片に由来する3次元(3D)オルガノイドの確立と解析

三次元培養オルガノイドは、生体内アーキテクチャ、細胞機能性および元の組織の遺伝的シグネチャを再現する可能性に注目されている^1,2,3,4,5.最も重要なことは、患者腫瘍組織または患者由来異種移植片(PDX)モデルから確立された3Dオルガノイドは、腫瘍形成に関する細胞シグナル伝達のメカニズムを理解し、各細胞集団^{6、7、8、9、10、11、12、13}に対する薬物治療の効果を決定する貴重な機会を提供する。Drostら5は泌尿器科の分野で広く採用されているヒトおよびマウス前立腺オルガノイドの確立のための標準プロトコル^{を開発した}。また、3Dオルガノイドのさらなる特徴付けに多大な努力が行われ、腫瘍形成および転移の詳細なメカニズムを理解するために^4,12,14,15.3D オルガノイド培養のための以前に確立され、広く受け入れられているプロトコルに加えて、我々は最適化された培養条件の3つの異なるドミン法を用いてPDOの3D培養のためのステップバイステップのプロトコルをここに記述する。

本稿では、3Dオルガノイドを骨転移性前立腺癌(BMPC)の元生体モデルとして確立した。これらの培養物に使用される細胞は、前立腺癌サンディエゴ(PCSD)シリーズから来て、患者前立腺癌骨転移性腫瘍組織(PCSD18およびPCSD22)または患者由来異種移植片(PDX)腫瘍モデル(PCSD1、PCSD13、およびPCSD17という名前のサンプル)から直接得られた。前立腺癌細胞の自発的な骨転移は遺伝子組み換えマウスモデル¹⁶ではまれであるため、ヒト腫瘍細胞の雄Rag2---γc-/-マウスへの直接の大腿内注射を使用して、骨転移性前立腺癌のPDXモデルを確立した^17。

異種患者腫瘍細胞または異種移植片由来の患者から3Dオルガノイドが確立されたら、前立腺腫瘍細胞としての同一性を確認し、3Dオルガノイド培養でそれらの表現型を決定することが不可欠です。免疫蛍光化学(IFC)は、各細胞におけるその中のタンパク質発現の可視化を可能にし、特定の細胞集団^2、4に対する潜在的な機能を示すことが多い。一般に、組織や細胞を含むサンプルの大部分に対するIFCプロトコルは、簡単で完全に最適化されています。しかし、細胞密度およびオルガノイドの数は、従来の培養物よりも有意に低くすることができる。したがって、オルガノイドのIFCプロトコルは、サンプル内のすべてのオルガノイドのパラフィンに適切な処理と埋め込みを確実にするために追加のステップを必要とします。アガロースの埋め込み前プロセスの追加手順と、特にオルガノイドのサンプルが所望よりも低い細胞密度を有する場合に、オルガノイド上のIFCの成功率を増加させるスライド上のセクション化オルガノイドの位置を標識するヒントを説明する。

この研究は、カリフォルニア大学サンディエゴ校(UCSD)機関審査委員会(IRB)のガイドの勧告に厳密に従って行われました。IRB #090401承認は、UCSD機関審査委員会(IRB)から、研究目的で患者から外科検体を収集するために受け取りました。各患者からインフォームド・コンセントを得て、手術骨前立腺癌転移標本は大腿骨の病的骨折の整形外科修復から得られた。動物プロトコルは、カリフォルニア大学サンディエゴ校(UCSD)の動物福祉および制度的動物ケアおよび使用委員会(IACUC)が#S10298承認されたプロトコルの下で行われました。機械的および酵素的に解離した患者腫瘍組織からの細胞は、前^{に説明したように}6〜8週齢の雄Rag2-/-γ^{c-/-マウス}に大腿内注射した。異種移植片腫瘍体積は、生体内生物発光イメージングシステムおよびキャリパー測定を用いて決定した。2.0cmまでの腫瘍増殖(IACUCによって承認された最大許容サイズ)に、腫瘍は3Dオルガノイドの確立のために収穫された。

注:図1は、実験手順の各ステップに対して3Dオルガノイドとプロトコル番号を確立するためのワークフローを示しています。

1. 患者由来異種移植片(PDX)腫瘍組織の処理

注:これは、異種移植片マウスモデルに由来する腫瘍のオルガノイド確立のための最初のステップです。このプロトコルは、Drostら5によって以前の出版物から適合^され、我々はオルガノイド培地に血清補充を含むように培地条件を変更しました。

1. 腫瘍標本を以下に記載する方法で処理する。
   1. 1-3 mm³サイズの断片に腫瘍サンプルをミンチし、室温で45分間細胞解離液10mLでサンプルを消化します。
   2. 消化を終了するには、サンプルに20 mLのDMEM完全なメディアを追加します。
   3. 70 μmの細胞ストレーナーを通して懸濁液をフィルターします。無菌プランジャーフランジを使用して、70 μmの細胞ストレーナーの上に残ったティッシュを押します。
   4. 4 °Cで5分間300xgで遠心分離。
   5. 新鮮なadDMEM完全な媒体で細胞ペレットを3回洗浄します。洗浄および再懸濁用のメディアのボリュームと、表 3に示されているメディアのボリュームを一致させます。例えば、24ウェルプレートの培養条件の場合、洗浄の体積は500μLである必要があります。
      注 :表 3に示すように、プロトコルは異なるカルチャ条件に適用できます。
   6. トリパンブルー染料とヘモサイトメーターを使用して、最終的な細胞数を決定します。
   7. 細胞数を得た後、2 x¹⁰⁶腫瘍細胞あたりPBS中の80 μLの2%FBS中の細胞ペレットを再懸濁する。
   8. マウス細胞枯渇カクテル 2 x 10⁶腫瘍細胞あたり 20 μL を追加します。.よく混ぜ、2-8 °Cで15分間インキュベートします。
   9. 2 x 10⁶腫瘍細胞当たりのPBSバッファーの2%FBSを使用して、体積を500μLに調整します。
      注:細胞懸濁液の2.5 mLの1 x 10⁷腫瘍細胞まで1つのLSコラムで処理することができる。
   10. LS カラムを磁気カラムセパレータにロードし、下のラックに 15 mL 円錐形チューブを配置して、フロースルーを収集します。
   11. PBS バッファーに 3 mL の 2% FBS を使用して各列をリンスします。洗浄フロースルーで円錐形チューブを捨て、新しい無菌15 mL円錐形チューブに交換します。
   12. カラムに細胞懸濁液(1 x 10⁷腫瘍細胞の最大2.5 mL)を加えます。ヒト腫瘍細胞で濃縮されるフロースルーを収集します。
   13. PBS バッファーで 1 mL の 2% FBS でカラムを 2 回洗浄します。
       注:列が空の場合は、すぐに洗浄手順を実行することが重要です。また、気泡の形成を避けるようにしてください。
2. 適切な細胞懸濁液の体積を、所望の培養用の1.5 mLチューブにアリコートする(表3)。
3. 1.5 mLチューブを300×g、4 °Cで5分間遠心分離します。
4. 上清を慎重に取り出して捨てます。

2. 患者原発腫瘍組織の処理

注:これはオルガノイドの確立のための最初のステップです。

1. マウス細胞の枯渇プロセスを除く全てのステップに従い、これは患者の原発性腫瘍組織の処理には必要ない。

3. プレートに取り付けられた円形ドームを形成する

注: この原稿では、図1および図2に示すように、細胞ペレットと基底膜(例えば、Matrigel)の混合物からドームを作る3つの方法について説明します。ステップ2-4では、細胞と基細胞膜は、基細胞膜の凝固を防ぐために氷の上に保持する必要があります。

1. 24ウェルプレートセット用の原元膜の適切な体積(例えば、40μL)に細胞ペレットを再懸濁する(表3)。
2. 細胞が元の膜でうまく再懸濁されていることを確認するために、ピペットを穏やかに上下させます。
3. ピペットは、細胞基盤膜混合物の適切な容積(表3)(および任意の10μLのadDMEM完全培地)を予め温めた組織培養プレートの中心に入る。
4. プレートを反転し、直ちに5%CO2、37°C、15分間の_CO2細胞培養インキュベーターにプレートを逆さまに置きます。これにより、細胞が沈降し、底面に付着するのを防ぎ、基盤膜が固化します。
5. ピペットは、各ウェルに10μM Y-27632ジヒドロクロリドを含む予め温めた培地の適切な容積(表3)を含む。
6. プレートを_CO2細胞培養インキュベーター(5%CO2、37°C)の内側に上に置きます。
7. 3~4日ごとにメディアを交換します。5-7日後、10μM Y-27632ジヒドロクロリドを用いない培養培地を使用して培養液を維持する。

4. プレートに取り付けられた円形ドームから浮遊ドームを形成する

1. ステップ3.7の後、セルスクレーパーを使用してドームを取り外します。

5. フローティングビーズの形成

注:このプロトコルは、基細胞膜、媒体、オルガノイドの混合物がビーズのように見えるので、浮遊ビーズとして命名されています。

1. 2インチ×4インチのパラフィンフィルムをカットします。
2. 1000 μLプラスチックピペットチップボックスから空の先端保持ラックのディボットの上にパラフィンフィルムを置きます。
3. パラフィンフィルムを軽く押し下げて、手袋をはめた人差し指を使ってディボットをトレースしますが、パラフィンフィルムを突破することなく。
4. 70%エタノールでパラフィンフィルムをスプレーし、少なくとも30分間調製したパラフィンフィルムを殺菌するために細胞培養フードのUVランプをオンにします。
5. 細胞と20μLの細胞の混合物を調製する。シード密度は、ドームあたり 50,000 ~ 250,000 個のセルにすることができます。
6. ピペットは、ステップ1または2から処理された細胞の混合物を、調製されたパラフィン膜に形成されたディボットの型に20μLの基盤膜を形成した。
7. 細胞ペレットを原元膜に再懸濁し、調製したパラフィンで細胞懸濁液をピペットに処理し、調製したジボットを取り出した。
8. 固化ビーズとパラフィンフィルムを6ウェルプレートに入れる。6ウェルプレートに1つのウェルは、5ビーズまで収めることができます。
9. パラフィンフィルムのビーズをやさしくブラッシングしながら、各ウェルに10μM Y-27632ジドロリドを含む予め温めた培地のピペット3〜5mL。
   メモ:最小ボリュームとして、3 mL を推奨します。ウェルあたりビーズ(N=5)の最大数には、5 mLの培地を推奨します。
10. プレートをCO₂インキュベーター(5%CO2、37°C)内に入れてください。
11. オルガノイド培地を3~4日ごとに交換します。5-7日後、10μM Y-27632ジヒドロクロリドを用いない培養培地を使用して培養液を維持する。

6. インビボオルガノイド顕微鏡を用いた画像ステッチ⁸

注:特定の顕微鏡は、セルプレート(エッジ壁)の外周に到達することができません。したがって、画像ステッチ時にはセルプレートの周囲に近いウェルを使用することをお勧めします。

1. 細胞培養プレートを上向きの位置にキーエンス顕微鏡のプレートホルダーに置きます。
2. レンズをターゲットドームの中心に置きます。
3. フレームの数を選択して自動ステッチ処理を設定します。例えば、3 x 3または5 x 5を選択して、合計で9枚の画像または25枚の画像を生成することができます。
4. キャプチャボタンを押してイメージングプロセスを開始します。
5. イメージ ビューア ソフトウェアを開き、手順 4 で撮影した画像のグループを読み込みます。
6. [画像のステッチ]をクリックして、高解像度のステッチ画像を作成します。
   メモ:シリアル9または25の画像をキャプチャするには、手動または自動設定してセルをフォーカスします。

7. 組織学のためのオルガノイド処理:アガローススピンダウン法

注: このプロトコルは、以前の出版物から Vlachogiannis ら⁷.我々は、正常にオルガノイドのすべての集団を埋め込むためにアガロース埋め込みを含むステップを追加しました。

1. 既存のメディアをウェルから取り出します。基盤膜ドームを吸引しないように注意してください。
2. 細胞回収液の体積(ステップ1から取り出した媒体の容積と等しい)を加え、4°Cで60分間インキュベートする。
3. ピペットを用いて基盤膜ドームを取り外し、ピペット先端を用いて基盤膜ドームを潰す。解き起下ろしたドームと細胞回収液を1.5mLのチューブに集めます。
4. 遠心分離機 300 x gと 4 °C で 5 分間.
5. 上清(細胞回復溶液)を取り除きます。最終ペレット化ステップでオルガノイドの存在が確認された場合、最後まで、すべての上清を別々のチューブに保存します。
6. 冷たいPBSの所望の容積(表3)を加え、機械的に邪魔するペレットにピペットを軽く上下に加えます。
7. 遠心分離機 300 x gと 4 °C で 5 分間.
8. 上清(PBS)を取り除きます。
9. ペレットを一致した体積(例えば、24ウェルプレート培養条件から1つのペレットに対して500 μL、表3)の4%PFAを室温で60分間固定します。
10. 固定後、遠心分離機は300×g、4°Cで5分間。
11. 上清(PFA)を取り外します。
12. 一致した容積(例えば、24ウェルプレート培養条件から1つのペレットに対して500μL、表3)のPBSおよび遠心分離機を300xgおよび4°Cで5分間洗浄する。
13. 温かいアガロース(PBSで2%アガロース)を準備します。
    注:ここでは、凍結セクション用の細胞ペレットを、プロトコル7のさらなるステップなしで200 μLのOCT化合物に直接再懸濁することができます。
14. 細胞ペレットをアガロースの200μL(PBSで2%)で再懸濁した。
    1. アガロースを加えた直後、1mLシリンジに取り付けられた25G針を使用して、1.5mLチューブの壁から細胞ペレットを軽く取り外します。図3に示すように、細胞ペレットが1.5mLチューブの壁から物理的に剥離していない場合、アガロース埋め込みプロセス中に細胞ペレットの全部または一部を失う危険性があります。
15. PBSの2%アガロースが完全に固化するまで待ちます。
16. 固化したアガロースブロックを1mLの注射器に取り付けた25G針を使用して1.5mLチューブから切り離します。
17. 切り離されたアガロースブロックに細胞ペレットを含む新しい1.5 mLチューブを移します。
18. 70%のEtOHでチューブを充填し、組織脱水およびパラフィン埋め込みのための従来のプロトコルを使用してさらに進みます。

8. オルガノイドの組織学と免疫蛍光性細胞化学(IFC)

1. ヒストロジーまたはIFCのスライドを選択します。
2. 染色プロセスを開始する前に、セルがスライド上のどこにあるかを調べ、マーカーを使用してスライド上のセルの周りに円を描きます。
3. スライドのエッジまたはボーダーの周囲に周囲を描画し、ラボノートのスライド上の円が配置されている場所を描いて、その位置を記録します。
4. 所望の染色を行う。
   注:このプロセス中に、通常のメーカーは化学物質に耐性がないため、マークされた円が消えます。いくつかのヒストロジー永久マーカーでさえ、染色プロセス中に消去される可能性があります。
5. 染色処理後、スライドを研究室のノートに置いて、スライド上のセルの位置を見つけます。

3Dオルガノイドは、骨転移性前立腺癌(BMPC)の由来異種移植片(PDX)モデルから、ならびに患者の骨転移性前立腺癌組織から直接確立された(図4)。簡単に言えば、BMPCのPDXモデルは、大腿内(IF)が雄Rag2----c-----マウスに腫瘍細胞を注入することによって確立され、PDX腫瘍を採取し、この原稿に記載されているように処理した。図4に示すように、PCSDシリーズのPDX腫瘍組織は、このプロトコルを使用して形成された嚢胞、回転楕円、およびより高い複雑性オルガノイドとして現れる差動表現型を有する3Dオルガノイドをもたらした。

25の高解像度10倍の拡大画像からのステッチ画像は、地下膜とオルガノイドのドーム全体を示した(図5)。画像解析ソフトウェアを使用して、特定のサイズよりも大きい細胞または細胞クラスターを選別するか、または回転楕円体または嚢胞を手動で選択するオプションがあります。

アガロースの埋め込みオルガノイド培養とスライド上の切り離されたオルガノイドの位置をラベル付けするためのヒントは、特にオルガノイドのサンプルが所望よりも低い細胞密度を有する場合にオルガノイドにIFCを行う成功を増加させる。図6は、サイトケラチン5(CK5、基底上皮細胞マーカー)、シトケラチン8(CK8、ルミナル上皮細胞マーカー)およびDAPIを標的とするオルガノイドの5μm厚いパラフィンセクションに関するIFCの例を示す。

図1:患者腫瘍組織または患者由来異種移植片(PDX)腫瘍組織のいずれかに由来する3D培養オルガノイドの確立および特徴付け。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:細胞ペレットと基底膜の混合物を形成する方法論。付属のドーム (a) ) ( 浮動ドーム (b) と浮動ビーズ (c) )この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:アガロース埋め込みを成功させるための重要なステップ1.5 mLチューブの壁から細胞ペレットを取り外すプロセス。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図4:一連のPCSD PDX腫瘍からのオルガノイドの微分型の形型は、単一の細胞、嚢胞、回転楕円体およびより複雑なオルガノイドを含む。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 5: 合計 25 の高解像度画像からの生のステッチ画像の例と、セル数をカウントしたり、セル/セルクラスターの面積を測定するためのフォローアップ分析のためのそのアプリケーション。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図6:CK5およびCK8 IFC染色PCSD1オルガノイド(パラフィン部の厚さ5μm)を示す画像。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

表 1: adDMEM/F12 +/+/+ 準備このテーブルは、Drost ら 5 によって以前に公開されています。

表 2: C/S ヒューマンメディア用のコンポーネント + 10 % FBSこのテーブルは、Drost ら 5 によって以前に公開されています。

表3:1つのドームに必要なシーディング密度、基盤膜体積、中量このテーブルは、Drost ら5によって以前のパブリケーションから変更されます。

サンヒー・リーとクリスティーナ・A・M・ジェイミーソンは、JoVE Methodsコレクションのゲスト編集者です。