リファレンスフリートラクションフォース顕微鏡プラットフォームの製造と実装

Summary

このプロトコルは、ポリ(エチレングリコール)ベースのヒドロゲルに埋め込まれた蛍光線マーカーの3次元配列を製造するための多光子リソグラフィーを実装するための指示を提供し、参照フリー、トラクション力顕微鏡として使用します。プラットフォーム。これらの指示を使用して、3D材料ひずみの測定および細胞牽引の計算は高スループット牽引力の測定を促進するために簡単にされる。

Abstract

細胞誘発物質の変形を定量化すると、細胞が微小環境の物理的特性をどのように感知し、それに反応するかに関する有用な情報が提供されます。細胞誘発物質株を測定するための多くのアプローチが存在する一方で、ここでは、参照フリーの方法でサブミクロン分解能で歪みを監視するための方法論を提供します。2光子活性化フォトリソグラフィパターニングプロセスを用いて、蛍光線マーカーの埋め込み配列を含む機械的および生体的に微細に微細に誘導可能な合成基板を生成し、3次元を容易に測定する方法を示します(3D)サーフェストラクションに応答する材料変形プロファイル。これらの基質を使用して、セル張力プロファイルは、対象セルの単一の 3D イメージ スタックを使用してマッピングできます。この方法論の目標は、トラクションフォース顕微鏡検査をよりアクセスしやすく、細胞メカノトランスダクションプロセスを研究する研究者、特にこの分野の新規参入者のためのツールを実装しやすくすることです。

Introduction

牽引力顕微鏡(TFM)は、付着細胞および収縮細胞によって生成された受動マーカーの補間変位場を使用して細胞トラクションを近似するプロセスである。TFMを用いて、増殖、分化、および移行などの重要な細胞プロセスに対する細胞外環境における機械的手がかりの影響を調査^{することができる1、2、3、4 ,5,6,7,8},^9,10,11,12.残念ながら、既存のアプローチの多くは実装が難しいか、高度に専門化された分析ツールや計算ツールに精通している必要があり、経験の浅い研究者が TFM を使用することは困難です。分析の難しさを解消しつつ、ハイスル....

Protocol

1. PEGDA塩基ヒドロゲルを光重合

1. 試薬の収集
   1. リチウムフェニル-2,4,6-トリメチルベンゾイルホスフィン酸リチウム(LAP)、3.4 kDaポリ(エチレン)グリコールダイアクリレート(PEGDA)、n-ビニルピロリドン(NVP)、アレクサフルオール488標識PEGDA(PEG-488)、アレクサフルオール633標識PEGDA(PEGDA)を収集PEG-RGDS)をそれぞれの冷凍庫から、それぞれを室温にします。
   2. 別々の琥珀色マイクロ遠心管では、LAPの3mg、PEGDAの10mg、PEG-488の5mg、PEG-633の20mg、およびRGDSペプチドの6mgを測定する。
2. プレポリマー溶液の調製
   1. LAPをリン酸緩衝生理食生の1mL(PBS、pH 7.4)で溶解します。溶解したLAP溶液の200 μLを使用してPEGDAを溶解します。次に、PEGDA溶液の200 μLを使用してPEG-RGDSを溶解させます。
      注:細胞形状の制御が望ましい場合は、ベースヒドロゲルプレポリマー溶液中のPEG-RGDSを省略し、2光子を介して追加され、後でプロトコルでレーザー走査リソグラフィを行います。
   2. 80 μL の PBS を使用して PEG-488 を溶解します。この溶液の2.5 μLをプレポリマー溶液に加えます。

Results

プロトコル全体を通じて、パターニング手順の品質を評価するためのフィードバックを提供するチェックポイントがいくつかあります。各チェックポイントの進捗状況を評価する方法に関する洞察を提供するために、実際の実験の代表的な結果を提供します。結果は、ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)のTFM分析のために調製されたフォトパターンヒドロゲルに対して行われたこのプロトコルの適用を強調する。結果には、生の画像データと、各重要なステップでの処理されたデータ出力が含まれます。

最初のチェックポイントはステップ4で起こり、フィデューシャルマーカー配列がヒドロゲル中にフォトパターン化された後に行われる。イメージ スタックを収集する場合、結果として得られるイメージは、イメージ スタック内の Z 位置の関数として強度で振動するパターン化されたフィーチャ (図 1A-C)の定期的な配列を表示する必要があります。パターン化されたサーフェスが完全に水平でない場合、各画像スライスの異なる領域は、これらの振動に関して互いに相外に見.......

Discussion

このプロトコルの目的は、TFM データの生成と分析に関連する困難の多くを軽減するワークフローを提供することです。一度調製されると、フォトパターン化されたヒドロゲルは使いやすく、標準的な組織培養慣行と蛍光顕微鏡の知識のみを必要とします。リファレンスフリーのアスペクトにより、セルを含むヒドロゲルの気楽なナビゲーションが可能になり、参照画像と変形画像間の画像登録などの面倒な画像処理手順を排除します。結果として得られる分析はほぼ完全に自動化され、個々のCOIからのデータを最初から最後まで10分以内に分析できます。

このプロトコルの主な課題は、フォトパターン化ヒドロゲルの製造に起因します。プロトコルで使用される試薬のほとんどは社内で合成されるため、合成ヒドロゲル材料を使用した経験の少ないユーザーは、このプロトコルを試みるのをいくらか妨げる可能性があります。とは言うに、このプロトコルで使用されるPEGylatedコンポーネントはすべて、ワンポット反応を使用してほぼ同一のプロトコルから合成され、多くのコンポーネントは商用ベンダーから購入することができます。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrodiscシリンジフィルター、0.2 μm Supor Membrane, Low Protein Binding	Pall	PN 4602	ベースゲル合成およびその後のリソグラフィーステップの前にマクロマー溶液をろ過することができます。
アクリレート-シラン官能基化#1.5カバースリップ	社内	社内	アクリレートは、ベースハイドロゲルをガラス表面に結合してハイドロゲルを固定化します。参照:21-24
Axio-Observer Z1 w/Apotome	Zeiss		Widefield microscope with structured illumination module used to capture images for TFM.
Chameleon Vision ii	Coherent株式会社		多光子リソグラフィーに使用されるレーザー走査型顕微鏡に搭載されています。
二重コーティングされたテープ、9500PC、6.0 mil	3M		ペトリ皿にアクリレートシラン官能化カバースリップを結合します。
Flexmark90 PFWライナー	FLEXcon	FLX000620	両面テープのライニングが可能で、プロッターへのテープの供給が可能です。
LSM-880	Zeiss		レーザー走査型顕微鏡は、多光子リソグラフィーに使用されます。
MATLAB	Mathworks	R2018a	カスタム スクリプトを実行して、顕微鏡のリソグラフィー命令と TFM データの解析用命令を生成します。
モデルSCプロ	ッターUSCutter	SC631E	二重コーティングされたテープをリングにカットして、カバースリップをペトリ皿に結合します。
対物レンズ C-アポクロマート 40x/1.20 W Corr M27	Zeiss		視野顕微鏡とレーザー走査型顕微鏡の両方に搭載され、リソグラフィーとTFMの両方に使用できます。
PEG-AF633	自社	社内	マーカーを作成するための蛍光色素標識アクリレートPEGバリアント。参照:21
PEG-DA	em>in-house	in-house	Base material for hydrogels.参考文献:細胞接着を促進するための21
PEG-RGDS	in-house	in-house	RGDSペプチド標識モノアクリレートPEGバリアント。参照:21
ペトリ皿	CELLTREAT	229638	8mmの穴は、ベースハイドロゲルに適合するコアリングビットを使用して各皿の中央に切られます。
Sylgard 184 シリコーン エラストマー キット	ダウ コーニング	3097358-1004	ベース ヒドロゲル (別名 PDMS) を制御するためのスペーサーを作成します。
シリンジ、Leur-Lok、1 mL	BD	309628	ベースゲル合成およびその後のリソグラフィーステップの前にマクロマー溶液をろ過できます。
UVランプUVP		ブラックレイ®B-100AP	はベースヒドロゲルを重合します。
1-ビニル-2-ピロリジノン(NVP)	Sigma-Aldrich	V3409-5G	ラジカル促進剤およびコモノマー。リソグラフィー中のペグ化フルオロフォアの取り込みを改善します。