多細胞三次元回転楕円体を生成するためのラボオンCDプラットフォーム

Summary

細胞回転楕円体を培養できるモータ駆動遠心マイクロ流体装置を紹介する。この装置を使用して、単一または複数の細胞タイプの回転楕円体は、高い重力条件下で容易に共培養することができる。

Abstract

三次元回転楕円体細胞培養は、2次元細胞培養よりも生体の細胞微小環境をより良くシミュレートできるため、細胞実験でより有用な結果を得ることができる。本研究では、遠心マイクロ流体ベースの回転楕円体(CMS)培養システムと呼ばれる電気モータ駆動ラボオンCD(コンパクトディスク)プラットフォームを作製し、高遠心力を実装する三次元(3D)細胞回転楕円体を作製した。この装置は1 x gから521 x gに重力条件を生成するために回転速度を変えることができる。CMSシステムは直径6cmで、100400μmのマイクロウェルを有し、コンピュータ数値制御機によって予め作られたポリカーボネート型でポリジメチルシロキサンで成形することによって作られています。CMSシステムのチャネル入り口のバリアウォールは、遠心力を使用してチップ内に均等に細胞を広げます。チャネルの終わりに、細胞がマイクロウェルに入ることを可能にするスライド領域があります。デモンストレーションとして、スフェロイドは、システムを用いた高重力条件下でヒト脂肪由来幹細胞およびヒト肺線維芽細胞の単一培養および共培養によって生成された。CMSシステムは、単純な操作スキームを使用して、同心円、ヤヌス、およびサンドイッチの様々な構造の共培養回転楕円体を生成しました。CMSシステムは、単一または複数の細胞型のスフェロイドおよびオルガノイド培養を必要とする細胞生物学および組織工学研究に有用であろう。

Introduction

2次元(2D)細胞培養(例えば、従来のペトリ皿細胞培養)よりも3次元(3D)スフェロイド細胞培養で生体内の微小環境で生物学的なシミュレーションを行い、より生理学的に現実的な実験を行う方が簡単です。結果¹.現在入手可能な回転楕円体形成方法には、吊り下げ滴^法2、液体オーバーレイ^技術3、カルボキシメチルセルロース^技術4、磁力系マイクロ流体^技術5、及びバイオリアクター⁶.それぞれの方法には独自の利点がありますが、再現性、生産性、および共培養スフェロイドの生成のさらなる改善が必要です。例えば、磁力系マイクロ流体技術5は比較的安価である^が、強磁場が生細胞に及ぼす影響は慎重に検討しなければならない。回転楕円体培養の利点は、特に間葉系幹細胞分化および増殖の研究において、いくつかの研究において報告^{されている7、8、9}である。

集光マイクロ流体システムは、ラボオンCD(コンパクトディスク)とも呼ばれ、内部の流体を容易に制御し、基板の回転を利用するのに有用であり、従って免疫測定^法10などの生物医学的用途に利用されてきた。生化学的^{マーカー11}を検出するための比色アッセイ、核酸増幅(PCR)アッセイ、自動血液分析^{システム12、}およびオールインワン遠心マイクロ流体^{デバイス13。}流体を制御する駆動力は、回転によって作成される引力です。さらに、混合、評価、およびサンプル分割の複数の機能は、この単一の CD プラットフォームで簡単に行うことができます。しかしながら、上記の生化学的分析方法と比較して、培養細胞、特にスフェ^ロイド14にCDプラットフォームを適用する試験は少なくなっている。

本研究では、ヒト脂肪由来幹細胞(hASC)及びヒト肺線維芽細胞(MRC-5)の単一培養又は共培養による遠心微流体系回転楕円体(CMS)系の性能を示す。本論文では、当社グループの研究^方法論15について詳しく述べている。これにより、スフェロイド培養ラボオンCDプラットフォームを容易に再現することができる。CMSカルチャーチップ、チップホルダー、DCモータ、モータマウント、回転プラットフォームを備えたCMS生成システムを提示します。モーターマウントは、アクリロニトリルブタジエンスチレン(ABS)で3Dプリントされています。チップホルダーと回転プラットフォームは、PC(ポリカーボネート)で加工されたCNC(コンピュータ数値制御)です。モータの回転数は、パルス幅変調に基づいてPID(比例積分微分)アルゴリズムを符号化することにより、200~4,500rpmを制御します。寸法は100mm×100mm×150mmで、重さは860gで取り扱いが容易です。CMSシステムを使用すると、スフェロイドは1 x gから521 x gまでの様々な重力条件下で生成できるため、高重力下での細胞分化促進の研究を2D^{細胞16、17から3D}に拡張することができます。回転 楕円 体。種々の種類の細胞の共培養も、生体内^環境18を効果的に模倣するための重要な技術である。CMSシステムは、様々な構造タイプ(同心円、ヤヌス、サンドイッチなど)の共培養スフェロイドだけでなく、単一培養スフェロイドを簡単に生成することができます。CMSシステムは、単純な回転楕円体研究だけでなく、3Dオルガノイド研究にも利用することができ、ヒト臓器構造を考慮する。

Protocol

1. 遠心マイクロ流体ベースの回転楕円体(CMS)培養チップ製造

1. CNC加工により、CMSカルチャーチップの上下層用のPC金型を作ります。チップの詳細な寸法を図1に示します。
2. PDMSベースとPDMS硬化剤を5分間10:1(w/w)の比率で混合し、デシケータに1時間置いて気泡を除去します。
3. CMS培養チップの金型にPDMS混合物を注いだ後、気泡を1時間以上取り除き、80°Cのヒートチャンバーで2時間硬化させます。
4. 表面を上に接合する真空プラズマクリーナーに入れ、30sで18 Wのパワーでエアアシストプラズマにさらします。
5. CMSカルチャーチップの2層を接着し、80°Cのヒートチャンバーに30分間入れ、接着強度を高めます。
6. CMS培養チップを121°Cおよび15 psiのオートクレーブ滅菌器で殺菌します。

2. 細胞調製

1. 5×105-1×106hASCまたはMRC-5s細胞を含むバイアルの1mLを36.5°Cの水浴中で2分間解凍します。
2. ダルベッコのオグニドイーグルミディアム(DMEM)をバイアルに1mL加え、1,000μLピペットと軽く混ぜます。
3. 36.5°Cに前温したDMEMの15mLをピペットを使用して直径150mmのペトリ皿に入れ、バイアルから細胞を加えます。
4. 1日後、DMEMを吸引し、新鮮なDMEMの15 mLに交換してください。その後、2~3日ごとにメディアを変更します。
5. ペトリ皿から細胞を切り離すために、ペトリ皿に4mLのトリプシンを加え、36.5°Cでインキュベーターに入れ、4分間5%CO2に入れます。

3. 単一培養回転楕円体形成

1. 2.5 mL の 4% (w/v) プロウロン F-127 溶液を CMS カルチャー チップの入口穴 (図 2A)に入れ、チップを 500 ~ 1,000 rpm で回転させ、CMS システムを使用して 4,000 rpm で 3 分間チップを回転させます (図 2B)。
   メモ:プルーニックコーティングは、チップの回転中に入口ポートへのセルアタッチを防止します。空気がマイクロウェルに閉じ込めされていないことを確認します。
2. 5%CO2で36.5 °Cで一晩プロロニック溶液で満たされたCMS培養チップをインキュベートします。
3. プレロニック溶液を取り出し、残りのプルロニック溶液をDMEMで洗い流し、チップを12時間乾燥させます。
4. CmSカルチャーチップに2.5 mLのDMEMを追加し、チップ内部を前もって3分間約4,000rpmで回転させます。
5. 回転を停止し、DMEMの100°Lを引き出して、セルサスペンションを注入するスペースを作ります。
6. 5 × 10⁵ hASC または 8× 10⁵ MRC-5s を含むセル懸濁液を 100 μL 加え、ピペットで 3 ~ 5x のリサスペンション用にセルを均一に分散します。
7. チップを3,000 rpmで3分間回転させ、各マイクロウェルのセルを遠心力でトラップします。
   メモ:回転速度が過度すぎると、溶液の放出穴を通してセルエスケープが発生する可能性があります。
8. 36.5°C、>95%湿度、5%CO2でインキュベーターで3日間細胞を培養し、1,000~2,000rpmで回転させる。毎日文化培地を変える。

4. コカルチャースフェロイド形成

1. 同心円球状形成
   1. 最初のセル、2.5 × 10⁵ hASC を追加し、チップを 3,000 rpm で回転させます。3分後、2番目の細胞、4×105 MRC-5sを加え、3,000rpmで3分間チップを回転させます。細胞が注入されたら、回転速度を500-1,000 rpmにシフトします。
   2. インキュベーター内の細胞を36.5°C、>95%湿度%、5%CO2で培養し、1,000~2,000rpmで回転させた。同心円回転楕円体は 24 時間以内に作成されます。長期的な文化のために、毎日文化培地を変更します。
2. ヤヌス・スフェロイド形成
   1. チップが500~1,000rpmで回転しながらピペットを取り込み、最初のセルを含む100μLのセル懸濁液^を2.5× 10 5 hASCに加えます。次に、チップを3,000rpmで3分間回転させます。
   2. チップを36.5°C、湿度95%、CO25%で3時間1,000~2,000 rpmで回転させてインキュベートします。
   3. チップが500~1,000rpmで回転しながらピペットを取り込み、2番目のセルセットを含むセル懸濁液を100μL、4×105 MRC-5sに加えます。次に、チップを3,000rpmで3分間回転させます。
   4. インキュベーター内の細胞を36.5°C、>95%湿度、5%CO2で培養し、1,000~2,000rpmで回転させた。ヤヌス・スフェロイドは24時間以内に作成されます。長期的な文化のために、毎日文化培地を変更します。
3. サンドイッチ回転楕円体形成
   1. チップが500~1,000rpmで回転しながらピペットを取り込み、最初のセルを含む100μLのセル懸濁液(1.5×10⁵ hASC)を加えます。次に、チップを3,000rpmで3分間回転させます。
   2. チップを36.5°C、湿度95%、CO25%で3時間1,000~2,000 rpmで回転させてインキュベートします。
   3. チップが500~1,000rpmで回転しながらピペットを取り込み、2番目のセルを含む100μLのセル懸濁液を3×105 MRC-5sに加えます。次に、チップを3,000rpmで3分間回転させます。
   4. チップを36.5°C、>95%湿度%、5%CO2で3時間1,000~2,000 rpmで回転させてインキュベートします。
   5. チップが500~1,000rpmで回転しながらピペットを取り込み、3番目のセルを含む100μLのセル懸濁液(1.5×10⁵ hASC)を加えます。次に、チップを3,000rpmで3分間回転させます。
   6. インキュベーター内の細胞を36.5°C、>95%湿度%、5%CO2で培養し、1,000~2,000rpmで回転させた。サンドイッチ回転楕円体は12時間以内に作成されます。長期的な文化のために、毎日文化培地を変更します。

5. 細胞染色

1. 細胞蛍光色素を室温(20°C)まで温める。
2. バイアルあたり20μLの無水ジメチルスルホキシド(DMSO)を加えるため、1mM溶液を作ります。
3. DMEMを使用して蛍光を1μMの最終作業濃度に希釈します。
4. 蛍光を細胞懸濁液に加え、ピペットを使用して穏やかに再サスペンドします。
5. 36.5 °Cで 20 分、湿度 >95%、および 5% CO₂をインキュベートします。

Results

直径6cmCMCMS培養チップ(図2)は、上記のプロトコルに従って正常に作られました。まず、チップを最上層と底層とは別に作り、プラズマ結合により結合した。得られた回転楕円体は、チップを取り外すことによって容易に集めることができる。CMSカルチャーチップのチャネルは、入口ポートと中央、スライド、およびマイクロウェル領域で構成されます(図3)。細胞、中、およびプレロン溶液は、直径5mmの入口穴を通して注入される。注入された細胞は、入口ポート領域の再懸濁液3~5倍によって均等に分布する。細胞は中央領域で遠心力を受け、外側に広がる。中央領域はマイクロウェルよりも高いため、より多くのメディアを含むことができ、回転楕円体がより長く生き残ることができます。マイクロウェルの高さは0.4mm、中央領域の高さは1.5mmであり、吸引孔は中央領域の中心に存在し、内部溶液を容易に取り除く。スライド領域は、中央領域とマイクロウェル領域を結ぶ傾斜領域である。細胞は45°の斜面に沿って移動し、細胞が定着し、成長し、回転楕円体を形成するためにもつれが...

Discussion

CMSは、注入されたすべての細胞が無駄なくマイクロウェルに入り、従来のマイクロウェルベースの回転楕円体生成方法よりも効率的で経済的なシステムです。CMSシステムでは、チップ内のメディアを取り外すために設計された吸引穴を通して、メディアは12~24時間ごとに交換されます(図3A)。メディア吸引プロセスの間、メディアとマイクロウェルの壁との間の表面張力のために、マイクロウェルの内部からほとんどすべてのメディアが脱出します。PDMS製のチップは弾力性があり柔軟であるため、チップのマイクロウェル領域付近を指で押すことで、閉じ込められたメディアを簡単に取り外すことができます。マイクロウェル内の細胞は、複数のメディアの変更があっても、エスケープすることなく安定したままです。すべての100マイクロウェルで回転楕円体の同じ品質を達成するために、デバイスの回転は偏心してはず、チップは軸対称でなければなりません。そうしないと、可変個のセルが各ウェルに入り、回転楕円体のサイズと形状が異なる場合があります。従来のマイクロウェルシステムでは、空気がマイクロウェルに閉じ込められることが多いため、気泡を除去...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3Dプリンター	Cubicon	3DP-210F
脂肪由来間葉系幹細胞(hASC)	ATCC	PCS-500-011
抗生物質-抗真菌剤	Gibco	15240-062	完成した培地と緩衝液の1%を含む
CellTracker Green CMFDA	Thermo Fisher Scientific	C2925	10
mM CellTracker Red CMTPX	Thermo FisherScientific	C34552	10 mM
コンピューター数値制御 (CNC) ロータリー彫刻機	Roland DGA	EGX-350
DC モーター	Nurielectricity Inc.	MB-4385E
ジメチルスルホキシド (DMSO)	シグマ アルドリッチ	D2650
ダルベッコの修飾イーグルの培地 (DMEM)	ATCC	30-2002
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 (D-PBS)	ATCC	30-2200
ウシ胎児血清	ATCC	30-2020	の 10% を含んでいました
(MRC-5)	ATCC	CCL-171
Inventor 2019	Autodesk		3D コンピューター支援設計プログラム
ペトリ皿 & ファイ; 150 mm	JetBiofill	CAD010150	表面処理
プラズマクリーナー	ハリックプラズマ	PDC-32G
プルロニック F-127	シグマ アルドリッチ	11/6/9003	リン酸緩衝生理食塩水で 4% (w/v) 溶液
ポリカーボネート (PC)	アクリル	AC15PC	200 x 200 x 15 mm
ポリジメチルシロキサン (PDMS)	Dowcorning	Sylgard 184
トリプシン	Gibco	12604021