マウス脳のマイナート核基底部におけるコリン作動性繊維長の立体的推定

サマリー

脳領域の三次元構造内の神経線維の長さは、特定の神経構造の完全性または変性を定量化する信頼できるパラメータである。本稿では、マウスにおけるマイナート核内のコリン作動性繊維長を測定する立体定量法を例に説明する。

要約

様々な脳領域におけるコリン作動性または他の神経軸索の長さは、しばしば領域の特定の機能と相関している。ステアロジーは、様々な脳構造の神経細胞のプロファイルを定量化するのに有用な方法です。ここでは、基礎前脳のメイナート核(NBM)の基底にあるコリン作動性繊維の全長を推定するソフトウェアベースのステレロジープロトコルを提供します。この方法では、長さの推定にスペース ボール プローブを使用します。コリン作動性繊維は、西洋ワサビペルオキシダーゼ-ジアミノベンジジン(HRP-DAB)検出システムを用いたコリンアセチルトランスファーゼーション酵素(ChAT)免疫染色によって可視化される。染色プロトコルは、ステレロジーソフトウェアを用いた様々な脳領域における繊維および細胞数の推定にも有効である。このステレオロジープロトコルは、絨毛ノセプティブ繊維、ドーパミン作動性/カテコールアミン作動性繊維、セロトニン繊維、アストロサイトプロセス、あるいは血管プロファイルなどの任意の線形プロファイルの推定に使用できます。

概要

脳内神経線維の長さおよび/または密度の定量的推定は、神経病理学的研究の重要なパラメータである。様々な脳領域におけるコリン作動性、ドーパミン作動性、およびセロトニン作動性軸索の長さは、しばしばその領域の特定の機能と相関する。これらの軸索の分布は一般的に不均一であるため、設計ベースのステレロジーは、サンプリング中のバイアスを回避するために使用されます。ステレロジーの宇宙ボールプローブは、関心のある領域で神経線維などのライン状構造の効率的かつ信頼性の高い対策を提供するように設計されている^1.プローブは、組織に体系的に課せられる仮想球を作り、プローブの表面との線の交差を測定する。分析のために球プローブを組織に入れることは不可能であるため、市販のソフトウェアは、基本的には球プローブの表面を表す様々な直径の一連の同心円である仮想3次元(3D)球を提供します。

選択的コリン作動性神経変性は、アルツハイマー病(AD)2、3、4の一貫した特徴の1つである。機能不全のコリン作動性伝達は、ADにおける認知機能低下の原因因子と考えられている。コリン作動性機能不全は、パーキンソン病、中毒、統合失調症などの他の多くの精神障害でも明らかです。コリン作動性神経変性の異なる態様は、動物モデル(例えば、アセチルコリン⁵の減少、ChATタンパク質^6、アミロイドプラーク6付近におけるコリン作動性繊維神経変^性、及びコリン作動性繊維およびシナプス変動性の減少^7、8)において研究されている。繊維変性は神経細胞の損失よりも早く起こると考えられています, コリン作動性神経細胞の損失は、常に研究で観察されないので、コリン作動性ニューロンのほとんどは基底脳と脳幹にあり、その軸索は皮質や海馬などの様々な脳領域に投影する。NBMは基礎前脳に位置し、ADで一般的に影響を受ける脳領域の1つであることがわかりました。

分数体の分数法は、複数のレベルでの組織の系統的ランダムサンプリングに基づいています。セクションサンプリング分率(SSF)は、フラクテレータ法のステラゲオ法に対する非コンピュータベースの系統的な断面サンプリングである。エリア サンプリング分数(ASF)は、セクション内の対象領域の領域の分数です。厚さサンプリング分率(TSF)は、断面の厚さの分画です。スペースボールプローブを使用すると、分画された位置にある3D球体の関心プロファイルを定量化できます。ここでは、マウス脳のNBMにおけるコリン作動性繊維の全長を推定するスペースボールプローブを用いて、手順を説明する。現在のプロトコルは、組織処理、ステレロジーのサンプリング方法、ChAT抗体を用いた免疫組織化学染色、およびマウス脳のNBMにおけるコリン作動性繊維長と繊維密度を推定する非バイアスステローロジーに関する詳細を提供します。

プロトコル

これらの動物を使用するためのすべての手順は、カンザスシティ退役軍人医療センター機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されています。スウェーデンの突然変異体β-アミロイド前駆体タンパク質(Appswe)とそのC57/BL6 WTリッター類を過剰発現する18ヶ月のマウスが実験に使用された。繁殖とジェノタイピングの詳細は、He et al.⁸.

1. 灌流および組織処理

1. ケタミン(100mg/kg)およびキシラジン(10mg/kg)を用いた腹腔内注射を用いてマウスを麻酔する。つま先をつまんで応答の欠如を確認してから^9.
2. 0.1Mのダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)の氷冷〜50mLを有する経脈的に浸透し、続いて0.1Mリン酸緩衝液(PB)中に4%パラホルムアルデヒド(PFA)が続く。
   注意: PFA は有毒です。PFA を使用する場合は、個人用保護具 (PPE) を使用します。
3. 脳^10を取り除き、4°Cで0.1 M PBの4%PFAに浸漬し、24時間後置きのためにDPBS 3xで洗浄します。
4. 0.1 DPBSで15%のスクロース溶液に一晩に変更し、0.1 M DPBSで30%のスクロース溶液を4°Cでさらに48時間に変更します。
5. スクロース溶液から組織を取り出し、あらかじめ設定されたクライオトームチャンバー内で-20°Cの温度に凍結する。凍結したサンプルは、切り離しまで-80°Cの密閉管に保管することができます。
6. 最適な切断温度埋め込み媒体に組織を埋め込み(材料表を参照)、試料ディスクに取り付けます。クライオトームを使用してコロナ平面で連続30 μmの厚い部分を切断し、その結果、凍結保護剤溶液(30%グリセロール、30%エチレングリコール、40%DPBS;40%DPBS)を充填した24ウェル培養プレートですべてのセクションを収集します。図 1A–C-20°Cの冷凍庫に保管してください。
   注:より厚いセクション(例えば、50 μm)は、可能であれば好ましい。セクションが切断順序に保たれ、すべてのセクションが完全に凍結保護剤であることを確認してください。96ウェルプレートは、セクションを収集するために24ウェルプレートの代替として使用することができます。
7. 蒸発と乾燥を防ぐためにプレートシーラーで井戸を覆います。プレートは、さらに使用するまで-20°Cで保存してください。-20°Cで保存された切片は、ChAT免疫賦化学に対して数ヶ月間安定である。

2. IHCの系統的なセクション選択

注: 許容誤差係数(CE)を達成するために必要なセクションの総数を知るためにパイロットスタディを行う必要があります。CE 値は、サンプリング・プロシージャーのエラーの合計量を表す式です。最小値は最小エラーを表し、0.1 未満の CE 値はここで使用されるソフトウェアで許容可能と見なされます (資料表¹¹を参照)。

1. フランクリンやパキシノスなどの標準的なマウス脳アトラスと形態学的特徴を比較することによって、各脳の最初と最後のセクションを識別します。NBMはブレグマ-0.0mmで始まり、-1.6mmで終わります。したがって、約 50 セクションには NBM が含まれます。セクションの総数は、ステレロジーの間に必要なパラメータの1つです。8^番目のセクション(SSF = 1/8)の選択は、分析のための合計6-7セクションを与え、我々のパイロット研究でボリューム推定と繊維長推定の両方に許容可能なCEを得ました。
2. 最初の 8 つのセクションのうちの 1 つからランダムに開始し、NBM を含む最後の後部セクション (図 1C)まで、8^番目のセクションごとにシステム的にサンプリングします。

3. 免疫学化学

1. 凍結保存されたセクションを凍結保護剤で室温に移し、その後0.1Mリン酸緩衝液(PB)を6つのウェルプレートに移します。
2. PBで3倍を洗います。
3. メタノール中の0.3%H2O2で15分間インキュベートする。
4. トリス緩衝生理処理 (TBS) で 3 倍洗浄します。
5. TBSで0.25%トリトンX-100で30分間インキュベート。
6. TBSで0.1%トリトンX-100で10%正常牛血清(NBS)で30分間ブロックします。
7. 4 °Cで0.1%トリトンX-100および1%NBSを有するTBSにおけるヤギ抗ヒトChAT一次抗体の1:1,000希釈(材料表を参照)をインキュベートする。
8. 室温でTBSで3倍洗います。室温で、さらにすべてのインキュベーションと洗浄を行います。
9. ビオチン化牛抗ヤギ二次抗体(材料表を参照)を1時間インキュベートする。
10. TBSで3倍に洗います。
11. アビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ複合体を用いたインキュベート(資料表参照)。
12. TBSで3倍に洗います。
13. メーカーの推奨に従って、強化されたDABペルオキシダーゼ基質溶液(材料表を参照)を使用して開発します。
    注意:DABは発がん性物質の疑いがあります。接触および吸入によって有毒である。DAB を使用する場合は PPE を使用します。
14. 蒸留水でセクションを数回洗浄し、トリスpH = 7.6に保ちます。
15. ゼラチン化スライドにセクションをマウントします。1つの組織からのすべての切片を同じスライドに置くことができます。空気は、セクションを乾燥し、70%、90%、95%、および100%エタノールでそれぞれ5分間2xを脱水し、その後、2つの10分キシレンワッシュでセクションをクリアします。取り付け媒体を使用してセクションをカバースリップします(材料の表を参照)。
    注: 退避と消去の処理時間は、断面の厚さに影響します。したがって、すべてのセクションで同じ条件を使用する必要があります。現在の研究では、最終厚みの平均値は21.11±0.45μmであった。
16. ヒュームフードのセクションを乾燥させておきます。乾燥セクションは生殖器学のための準備ができている。

4. ステレロジー

メモ:使用する顕微鏡およびソフトウェアの材料表を参照してください。数値開口(NA)>1.2を使用した浸漬目的は有用であり、必要に応じて使用する必要があります。スライドは、遺伝子型または治療グループに従ってグループ化し、コード化する必要があります。1つの研究のための完全な滅菌学は、同じ人によって行われるべきであり、ステレロジーを行う人は、検査された個々のスライドまたはグループのアイデンティティに対して盲目であるべき1、12、13である。

1. ソフトウェアで新しい研究を開きます。(ファイル > 新しい研究)[スタディの初期化] ダイアログ ボックスが開きます。マルチレベル(分数ベース) ( 図 2A) を使用して、学習情報を入力します。
2. [パラメータ] で [ボリューム] をダブルクリックすると、[ボリューム] ダイアログ ボックスが開きます。対象の機能に名前を付け、[領域ポイントカウント' プローブ] を選択します。[次へ] をクリックします。
3. 次のパラメータ '長さ' をダブルクリックします。
   1. 機能の名前を指定します (例:'L')球の選択 ' 球 ' プローブを選択し、 [次へ] をクリックします。
4. 次に、[スタディの初期化] ダイアログ ボックスをクリックします。ケース情報を入力します。グループは、調査を開始する前にコード化する必要があります。セクションの総数は、対象領域を含む最初のセクションから、対象領域を含む最後のセクションまでのセクション数です (ステップ 2.1 を参照)。IHC染色のために8^区間ごとに選択されたため、断面サンプリング間隔は8である。
5. [次へ] をクリックすると[プローブの初期化]ダイアログ ボックスが開き、領域の選択と体積の推定の最小の倍率が自動的に設定されます。設定を確認し、選択した低倍率で関心領域を識別できるかどうかを確認します。「ボリューム」をダブルクリックし、領域ボリューム分率のポイントあたり50,000 μm³を入力します。[完了 ]をクリックします。
6. [オブジェクト (高) の倍率] で、[長さ] を 63 倍または 100 倍に設定します。[長さ]をダブルクリックして[長さ- 球] ダイアログ ボックスを開き、球の直径を 10 μm に設定します。
   注: ガード ゾーンは、断面の実際の厚さに基づいて決定する必要があります。オペレータは、損傷を避けるために、複数のサイトでセクションの厚さをチェックする必要があります。必要に応じて、断面の厚さに基づいてガードゾーンの厚さを調整します。
7. フレーム領域、フレームの高さ、ガード ゾーン、フレーム間隔に適切な値を設定します。
   注: これらの値は、スタディ領域のオブジェクト プロファイル(ファイバ)の異種性に依存します。フレーム面積は400^μm2、フレーム高さ10μm、ガードゾーンは2μm、フレーム間隔は300μmで、NBMにおける繊維長推定に適したCE値を得られます。パイロット スタディは、次のケースに向かう前に、これらの値を使用して実行する必要があります。
8. 各手順の後に、ソフトウェアによって提供される指示に従ってください。指示は、ダイアログ ボックスまたは画面下部に表示されます。
9. セクション 1 を挿入します。
10. 低倍率(5x)で、NBMの周囲に任意の境界を作って、対象領域を定義します。ビデオウィンドウの左隅にある[次へ]ボタンをクリックします。指示に従って、すべての緑のポイントがNBMに入っているのを確認します。ポイントは、ポイントをクリックして含めたり除外することができます。
    注: NBM の周りに明確な境界を設定する必要はありません。選択は主に調査者が定義しています。NBMのChAT+コリン作動性ニューロンは、内部カプセル(ic)および球状パリダス(GP)で観察することができる。このプロトコルでは、ChAT+コリン作動性ニューロンを持つicとそれらの突起(繊維)およびGP全体がNBMに含まれています(図1D)。
11. 指示に従い、現在の分数でのファイバー測定の場合は 63x に変更します。[セクションの太さ] ダイアログ ボックスが画面に表示されます。断面の実際の厚さを測定するには、断面の上面と底面を設定します。手動の Z 軸の移動を使用する必要があります。[完了]をクリックします。
    注: 領域にファイバーがない場合は、ステップをスキップして次の分数位置に移動できます。
12. 断面のフレームの高さの上から下に Z 軸をゆっくりと移動し、仮想球プローブのサーフェス上のすべての交差するファイバーをマークします (図 3)。完了したら、[次へ] をクリックして次の場所に移動します。
13. すべての分数を完了すると、ソフトウェアは次のセクションを挿入するように求めます。組織の 6 セクションまたは 7 セクションすべてに対して、手順 4.9 ~ 4.12 を繰り返します。
    1. 最後に、CE値を示すケースの結果がソフトウェアによって生成されます (図 4)。CE が許容される場合は、次のケースに進みます。ファイル > 新しいケース.CE が許容できない場合 (図 4A)、ソフトウェアは、いくつかのパラメーターを変更するための推奨事項を提供します。多くの場合、フレーム間隔を小さくすると CE 値が許容範囲に減少します (図 4B)。
14. すべてのケースを完了したら、ケースとグループごとに結果を生成します ([ファイル|結果] )。

5. 分析と統計

1. ソフトウェアは、各サンプルと各グループのデータを提供します。ソフトウェア自体は、SSF、ASF、TSFなどのフラクションを計算し、参照領域(この場合はNBM)の繊維の総参照体積(V_REF)および全長(L)を提供します(図4B)。データをエクスポートし、グループ分析間で選択した統計ソフトウェアに保存またはコピーします。表 1に、統計分析の代表的な結果データを示します。総繊維長を参照体積で割って、繊維密度(Lv)を解析します。

結果

代表的な結果を表 1および図 5に示します。APweグループ(APP)としてデコードされたグループCは、野生型(WILD)のリッターメートと比較して、ファイバ長(図5B)およびファイバ長密度(図5C)が有意に低かった。結果は、分析した2つのグループ間でNBMの体積に有意差がないことを示した(図5A)。

図1:本研究で用いた組織処理およびサンプリングの図。

ディスカッション

ここでは、スペースボール(球)プローブを用いてNBM中のコリン作動性繊維の密度を推定する方法を示す。このプローブは、対象領域の総繊維長を推定します。全長を領域の体積で割って、繊維密度を取得できます。リージョンのボリュームを推定するには、カバリエリポイント数法を使用しました。カバリエニポイント数法は、任意のリージョンの3D参照ボリュームの公平で効率的な推定値です。この方法では、点を数え(面積分率を表す)、分析された2つの断面間の距離を乗じて、断面の切断面の面積の推定値を計算します^。この方法は、労働集約的で、関心のある領域の周囲の正確なトレースを必要としません。光学分画器と組み合わせて細胞や繊維の密度を推定します。

立体分析には、正確なサンプリング方法が必要です。関心のある脳領域は、染色で適切に定義する必要があります。NBMは、フランクリンとパキシノスのマウスアトラスあたりAPブレグマ-0.0 mm〜-1.6 mmの間に位置しています。免疫組織化学の場合、セクションは系統的にランダムに選択されるべきであり、これは最初のセクションをランダム...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ABCキット	Vector Laboratories	PK6100
抗ChAT抗体	米国マサチューセッツ州ミリポア	AB144P
ウシ抗ヤギ IgG-B	Santacruz Biotechnology	SC-2347
ウシ血清、成人	Sigma-Aldrich、ミズーリ州セントルイス、米国	B9433
クライオスタット	Lieca Microsystems、イリノイ州
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	D5652
エチレングリコール	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	324558
Glycerol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	G2025
Hydrogen Peroxide	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	H1009
Immpact-DAB kit	Vector Laboratories	SK4105	強化型DABペルオキシダーゼ基質溶液
ケタミン	ウェストワード・ファーマシューティカルズ社、ニュージャージー州、米国	0143-9509-01
顕微鏡	Lieca Microsystems社、イリノイ州バッファローグローブ、米国	AF6000	電動ステージとIMI-techカラーデジタルカメラを装備
最適な切断温度(O.C.T.)埋め込み媒体	電子顕微鏡科学、ペンシルバニア州、米国	62550-12
パラホルムアルデヒド	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	P6148
Permount mounting medium	Electron Microscopy Sciences, PA, USA	17986-01
Stereologer Software	Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA	Stereologer2000	デルのデスクトップコンピュータにインストール済み。
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T8787
Trizma Base	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T1503	Tris base
Trizma hydrochloride	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,	USA T5941	Tris hydrochloride
キシラジン	バイエル、レバークーゼン、ドイツ	Rompun
Xylenes, Histological grade	Sigma-Aldrich, St. Louis,MO	534056