ここでは、シリコーンオイルのカメラインジェクションによるマウス目の眼圧高血圧および緑内化神経変性を誘導するプロトコルと、眼圧の上昇を戻すための前房からのシリコーンオイル除去の手順を提示する。通常。
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この記事について
サマリー
要約
眼内圧の上昇(IOP)は緑内障の十分に文書化された危険因子である。ここでは、ヒトのビトレチナル手術でタンポネード剤としてシリコーンオイル(SO)を用いた術後合併症を模倣するマウスにおいて、安定なIOP上昇を一貫して誘導するための新規で効果的な方法について説明する。このプロトコルでは、SOは、瞳孔を遮断し、水性ユーモアの流入を防ぐために、マウスの眼の前房に注入される。後室は水性のユーモアを蓄積し、これは順番に後部セグメントのIOPを増加させます。単一のSO注射は、信頼性が高く、十分で安定したIOP上昇を生み出し、これは重大な緑内障神経変性を誘発する。このモデルは眼科医科で二次緑内障の真の複製である。さらに臨床設定を模倣するために、SOは、排水経路を再び開き、前房の角度でトラベキュラーメッシュワーク(TM)を通して排出される水性ユーモアの流入を可能にするために、前房から取り外すことができる。IOPはすぐに正常に戻るので、モデルは緑内障網膜神経節細胞に対するIOPを低下させる効果をテストするために使用することができる。この方法は簡単で、特別な装置や繰り返し手順を必要とせず、臨床状況を綿密にシミュレートし、多様な動物種に適用可能であり得る。ただし、わずかな変更が必要な場合があります。
概要
網膜神経節細胞(RGC)及びその軸索の進行性喪失は、網膜1における一般的な神経変性疾患である緑内障の特徴である。2040年までに40~80歳の1億人以上の個人に影響を及ぼす。IOPは緑内障の発症および進行における唯一の変更可能な危険因子のままである。緑内障の病因、進行、および潜在的な治療法を探索するためには、ヒト患者の主要な特徴を複製する信頼性が高く、再現性があり、誘導可能な実験的高血圧/緑内障モデルが不可欠である。
IOPは、後房内の毛様体から前房への水性液流入と、前房の角度でトラベキュラーメッシュワーク(TM)を通る流出に依存する。定常状態に達すると、IOP は維持されます。流入が流出を超えたり下回ったりすると、IOP はそれぞれ上昇または下降します。前房の角度を閉塞するか、またはTMを損傷することによって水性流出を減少させることにより、いくつかの緑内障モデルが確立された3、4、5、6、7、8、9、10である。これらのモデルは通常、不可逆的な眼組織損傷に関連しており、前房内の高いIOPは角膜浮腫や眼内炎症などの望ましくない合併症を引き起こし、網膜イメージングおよび視覚機能アッセイを行い、解釈することが困難になる。
これらの欠点を克服するモデルを開発するために、ヒトの静脈小体手術11、12の術後合併症として生じるシリコーンオイル(SO)によって引き起こされる十分に文書化された二次緑内障に着目した。SOは、その高い表面張力のために網膜手術のタンポナードとして使用されます。しかし、SOは水性および静脈内液体よりも軽く、前房への水性の流れを防ぐので、瞳孔を物理的に閉塞させることができる。閉塞は水性ユーモアの蓄積のために後部室のIOPの上昇を引き起こす。これは、二次緑内障の主な特徴を持つ、カメラルSO注射と瞳孔ブロック13に基づく新規な眼高血圧マウスモデルを開発し、特徴づける動機となった:効果的な瞳孔ブロック、SO除去後に正常に戻ることができる重要なIOP上昇、緑内障神経変性。
ここでは、SO注射と除去およびIOP測定を含むマウス眼におけるSO誘発性眼圧の詳細なプロトコルを提示する。
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プロトコル
すべての手続きは、スタンフォード大学の制度動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認されています。
1. SOのカメラ内注入による眼圧誘発
- ピペットプーラーでガラスキャピラリーを引っ張ってマイクロピペットを生成し、カメラ内SO注入用のガラスマイクロピペットを準備します。マイクロピペットの先端で開口部を切り、さらにマイクログラインダーベベルマシンで先端を研ぎ、35°-40°ベベルを作ります。
- ベベルの端を磨き、水洗いですべての破片を取り除きます。使用前にマイクロピペットをオートクレーブします。
- 角膜の入り口のための麻痺の針を準備します。これを行うには、Luerロックの5 mLシリンジに32 G針を取り付け、テープでさらに固定します。針のベベル先端を30°で上に曲げる。
- 最初に10 mLシリンジに鈍い端18 G針を取り付けて固定して、SOインジェクターを準備します。次に、一方の端に18 G針を付けたプラスチックチューブを取り付け、もう一方の端を通して必要に応じてSOで満たします。
- 殺菌したマイクロピペットをプラスチックチューブに取り付け、シリンジプランジャーを押してマイクロピペット全体をSOで満たします。
2. 片目のためのカメラ内SO注射
- 9-10週齢の雄C57B6/Jマウスを誘導室に入れ、3%のアイソフルランを酸素と混合し、2L/分で3分間
- 腹腔内は、0.3 mg/g体重で2,2,2-トリブロモエタノールを注入します。
注:ケタミン/キシラジンとは異なり、2,2,2-トリブロモエタノールは明らかな瞳孔拡張を引き起こさない。 - つま先のピンチに対する応答の欠如と、ひげや尾部の動きの欠如をチェックして、麻酔強度を決定します。
- 手術用プラットフォーム上の横の位置にマウスを置きます。処置の間に感受性を減らすために、注射の前に角膜に0.5%のプロパラカイン塩酸塩の1滴を適用する。
- 32 Gのパラセンテシス針を、辺縁から約0.5mm離れた側頭象で切開します。
- 前房に突き刺す前に、角膜の層を約0.3mmトンネルで貫通する。レンズや虹彩に触れないように注意してください。
- 針をゆっくりと引き出し、トンネル(パラセンテシス)を通して前房からいくつかの水性ユーモア(約1−2°L)を放出します。
- IOP をさらに減らすには、~8分間待ちます。これは、対向的な、コントロール眼を測定することによって決定することができる。
- 角膜トンネルを通してSOをプリロードしたガラスマイクロピペットを前房に挿入し、面取りを虹彩面に向けます。
- シリンジプランジャーをゆっくりと押して、SO液滴が虹彩表面の大部分(直径約2.3−2.4mm)を覆うまで、前房にSOを注入します。
- マイクロピペットを前房に10個入れたままゆっくりと引き出してください。
- SO漏れを最小限に抑えるために、上部まぶたをゆっくりと押して角膜切開を閉じます。
- 眼表面に抗生物質軟膏(バチトラシン-ネオマイシン-ポリミキシン)を塗布する。
- 処置を通して、頻繁に人工涙で角膜を湿らせた。
- 麻酔から完全に回復するまで、加熱パッドの上にマウスを保持します。
3. SOの除去
- 灌漑システムを準備します。
- 製造元の指示に従って灌漑ソリューションを準備し、灌漑ボトルに入れます。灌漑ソリューションボトルを手術用プラットフォームの上の110−120 cm(81−88 mmHg)に引き上げます。
- 灌漑液ボトルにIV管理セットを取り付けます。IVチューブから気泡を取り除きます。33 G針を20°の面に接続してIVチューブに接続します。
- 排水システムを準備するには、1 mLシリンジからプランジャーを取り外します。33 G針を注射器に取り付け、針を20°に曲げる。
- 前房からSOを取り外します。
- 腹腔内注射 2,2,2-トリブロモエタノール (0.3 mg/g 体重).つま先のピンチに対する応答の欠如をチェックして、麻酔強度とウィスカーまたは尾部の動きの欠如を判断します。
- マウスを手術用プラットフォームに置き、テープで横の位置に固定します。0.5%の塩酸プロパラカインを角膜に1滴塗布し、感度を低下させます。
- 所定の32 Gのパラセンテシス針を使用して、SO液滴の端で〜2と5時の間に角膜の側頭象に2つの切開を行います。
- 1つの角膜切開、最高速度を介して灌漑溶液に接続された33 G灌漑針を挿入します。
- 他の角膜切開部を通してプランジャーなしでシリンジに取り付けられた別の33G排水針を挿入し、灌漑溶液を灌漑しながら、SO液滴が前房を出るようにします。
- 排水針を引き出し、次に灌漑針を引き出します。
- 気泡を前房に注入して通常の深さを維持し、角膜切開部を閉じるために押す。
- 両方の眼に抗生物質軟膏を塗布する。
- 麻酔から完全に回復するまで、加熱回復パッド上でマウスを維持します。
4. 週1回のIOP測定
- 3%のアイソフルランを酸素と混合した誘導室にマウスを3分間置きます。
- 腹腔内注射キシラジンとケタミン (0.01 mg キシラジン/g, 0.08 mg ケタミン/g).
- 手順全体を通して人工涙を適用することにより、角膜の湿った保湿を保ちます。
- 瞳孔が完全に拡張できるように約15分間待ちます。
- 製品の指示に従って、眼のIOPを測定します。マウスの目の近くに眼計を持って来てください。プローブの先端からマウス角膜までの距離を約3~4mmに保ち、測定ボタン6xを押して1つの読み取り値を生成します。平均IOPを取得するために、各眼から3つの機械生成測定値が得られます。
- SO注射後8週間で動物を犠牲にし、全マウント網膜の免疫ヒストケミストリー、RGCカウント、視神経(ON)半薄切片、および13以前に記載されている生存軸索の定量を行う。
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結果
注射の直後に、SO液滴が小さすぎ(≤1.5mm)13のために安定した眼圧を産生しないマウスを容易に同定できる。これらの動物は、その後の実験から除外されます。注射手順に従って、SO注射マウスの80%以上が1.6mmを超える液滴で終わる。これらのマウス眼のIOPを1回のSO注射後8週間、週に1回測定した。眼を受けるSOのIOPは高いままで、一般に対側対照眼のIOPを2倍にし、有効な瞳孔遮断を示す(図1)。マウス角膜の浮腫は、通常回収に2~3日かかるカメラ内注射後、光解剖顕微鏡で検査することができる。瞳孔拡張には時間がかかり、IOP測定を行う前に瞳孔拡張を待たなければなりません。したがって、注射後の IOP の測定が早すぎないようにしています。同じ理由で、IOP を頻繁に測定することはお勧めしません。別のマウス群を用いて、SO注射の2週間後に前房からSOを洗い流し、IOPを測定する前に角膜が回復するのをもう1週間待った(図1)。
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ディスカッション
ここでは、SOのカメラインスインジェクションによってマウスの目に持続的なIOP上昇を誘導するための簡単で効果的な手順を示します。この手順は顕微鏡の下のマイクロディセクションの経験を持つ誰によってすぐに学ぶことができる。障害の主な潜在的なリスクは、角膜切開からのSOの漏出です。しかし、SOを用いた利点の一つは、油滴が目に見えて測定可能であるため、小さすぎて注射後すぐに安定した眼圧を誘発するマウスを簡単に特定し、その後の実験から除外できることです。我々は日常的に80%の成功率を達成し、小さなSO液滴(≤1.5mm)13のためにマウスの約20%を除外した。しかし、角膜の層内に比較的長いトンネル(0.3mm)を作って、角膜をベベレージ先端で前房に浸透させることができる経験豊富な外科医は、角膜トンネルの内側の開口部を外側の開口部よりもはるかに小さくすることで、SO漏出をほとんど防ぐことができます。そこで、ほぼ全てのマウスに1.8mmを超えるSO液滴を注入した。トンネルの長さに加えて、他のいくつかの重要なポイントは強調する価値があります。まず、注射された眼のIOPを低く保ち、前房からSOを押し出さない...
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開示事項
著者たちは何も開示する必要はない。
謝辞
この作品は、NIHがYHに対するEY024932、EY023295、およびEY028106を付与することによってサポートされています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.5% プロパラカイン 塩酸塩 | Akorn, Somerset | ||
| 10mL syinge | BD | Luer-Lok Tip | |
| 18G needle | BD | with Regular Bevel, 針の長さ:25.4 mm | |
| 2,2,2-トリブロモエタノール (Avertin) | Fisher Scientific | CAS# 75-80-9 | 50g |
| 32G nano | BD | 320122 | BD Nano Ultra Fine Pen Needle-32G 4mm |
| 33G眼科用針 | TSK / VWR | TSK3313/ 10147-200 | |
| 5mL syinge | BD | Luer-Lok Tip | |
| AnaSed Injection(キシラジン) | Butler Schein | 100 mg / ml、50 ml | |
| 人工涙液 | Alcon Laboratories | 300651431414 | Systane Ultra Lubricant Eye Drops |
| BSS PLUS Irrigating solution | Alcon Laboratories | ||
| デュアルステージガラスマイクロピペットプーラー | ナリシゲ | PC-10 | |
| EZ-7000 クラシックシステム | EZシステム | ||
| イソフルラン | VetOne | 502017 | イソフルラン、USP、250ml /ボトル |
| IV投与セット | EXELint/フィッシャー | 29081 | |
| ケタミン塩酸塩注射 | VEDCO | 50989-996-06 | ケタベド 100mg/ml * 10ml |
| マイクログラインド面取り機 | NARISHIGE | EG-401 | |
| ミニチュアEVAチューブ | McMaster-Carr | 1883T4 | 0.05" ID, 0.09" OD, 10 ft. 長さ |
| シリコンオイル (SILIKON) | Alcon Laboratories | 8065601185 | 1,000 mPa.s |
| 標準ガラスキャピラリー | WPI/ Fisher | 1B150-4 | 4 in.(100mm) 外径 1.5mm 内径 0.84mm |
| TonoLab 眼圧計 | コロニアル メディカルサプライ、フィンランド | ||
| 獣医用抗生物質軟膏 | Dechra 獣医 | 1223RX | BNP 眼科用軟膏、ベトロポリシン |
参考文献
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