コーダル静脈グルコース注射によるパラバイオティクスマウスにおける共有血液供給の検出

サマリー

ここでは、グルコースの尾静脈注射を通じて2つのパラバイオリンの共有血液循環の確立を成功させたことを検出する新しい方法について説明します。

要約

パラビオシスは、身体の縦軸に沿って2つの平行動物を外科的に結合するための実験的方法である。我々は、グルコースの尾静脈注射によってパラバイオントにおける血液キメラリズムの確立を成功させるためのプロトコルを提示する。パラバイオティクスマウスを構築した。グルコースは、尾静脈を介してドナーマウスに注入され、そして、血糖量の変動を異なる時点で血液グルコメーターを用いて両マウスで測定した。我々の結果は、グルコース注射後、ドナーマウスの血糖値が1分後に急激に増加し、その後ゆっくりと減少することを示した。一方、レシピエントマウスの血糖値は、注射後15分にピークを迎えた。同様の結果は、グルコースの陽性対照として使用されるエバンスブルーで得られた。血糖レベルの同期変動は、2つのマウス間の血流が正常に確立されたことを示す。

概要

パラビオシスは、2つの生物が外科的に結合し、共有循環系¹を有する単一の生理システムとして発達するモデリング方法である。このようなモデルは、単一の個人によって産生される物質が共有循環系を介して両方の動物に同時に作用できるという利点のために生理学を研究するために広く使用されている。1800年代半ば以来、パラバイオティクス実験がPaul Bert²によって開拓された、パラバイオティクスモデルを構築するための方法が標準化されています。しかし、血液キメラリズムの確立が成功したことを確認するための簡単で便利な方法は欠けています。クロス循環は、腹腔内注射で0.5%のエバンスブルー染料を1つのパラバイオエントに注入し、続いてマイクロ^{プレートリーダーを}用いた両方のパラバイオレントの血液中のエバンスブルーの吸光度の測定によって正常に評価できることが報告されている。別の方法は、各パラバイオレントにCD45.1^{+ -}とCD45.2⁺- 標識単球を含む特定のマウス品種を必要とします。細胞サイトメトリーは、次に脾臓または血液⁴から単球中の2つのマーカーの頻度を測定することによって血液キメラリズムを決定するために使用される。しかし、これらの方法は、動物に対して致死的または面倒であることが多く、かつ、パラバイオティクスモデルの迅速かつ確実な検証のための安全で簡単な方法が非常に望ましい。本研究では、パラビオシスのマウスモデルで検証された新しい方法を確立しました。尾静脈から採取した血液サンプル中のグルコース濃度はグルコメーターを用いて測定され、ドナーマウスとレシピエントマウスにおけるグルコースレベルの変化のパターンは循環キメラリズムの指標と考えられる。この方法を「グルコース変動法」と名付けた。この検証方法の適用は、マウスに限らず、グルコース代謝の深刻な調節不変を有するものを除いて、多様な病理学的モデルに拡張することができる。手順は簡単で、時間を節約し、安全です。

プロトコル

動物とそのケアに関するすべての手順は、ハルビン医科大学の機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されました.

注: この方法に必要な工具および装置は、材料表にリストされています。

1. 素材・動物の製造

1. 標準的な実験動物の供給業者からの20 g-25 g間の重量のC57BL/6雄のマウスを注文する。
2. マウスを12時間の光のサイクルに収容する:水と食物へのアドリビタムアクセスで24-26°Cで12時間の暗闇。

2. パラビオシス

1. 0.1 mL/10 gの濃度で20g/L 2,2,2-トリブロモエタノールの腹腔内注射によってマウスを麻酔する。筋肉弛緩、ゆっくりと安定した呼吸、皮膚刺激反射の喪失、角膜反射の消失によって示される適切な麻酔法を確認する。
2. 眼の軟膏をQチップで塗布し、目が乾くのを防ぎます。
3. 前述の⁵に従ってパラビオシス手順を実行します。
   1. マウスを上向きの位置に置きます。片方のマウスの左側ともう一方のマウスの右側を肘の上約1cmから膝より1cm下に電気かけで剃ります。脱毛クリームを使用して、剃った皮膚の毛皮を完全にクリアします。
   2. ヨードファーでかき部分を拭きます。無菌パッドで覆われた加熱パッドの上にマウスを置きます。
   3. 肘の上0.5cmから膝関節の下0.5cmまで、各動物の剃った側に鋭いはさみを使用して縦皮切開を作成します。
   4. 切開後に皮下筋膜から皮膚をそっと取り外す。
   5. 3-0縫合糸でパラバイオレントのオレクラノンと膝を接続します。
   6. 連続5-0縫合糸で剃った皮を縫合する。
4. 脱水を防ぐために、各マウスに0.9%NaClを皮下に0.5mL注入します。
5. 痛みを和らげるために、各マウスにトラマドール(10mg /25 g/日)を筋肉内に注入する。

3. 循環キメラリズムの検証

1. グルコース変動方法
   注:パラバイオシス手術後10日目にグルコース変動法(断食なし)を用いて、パラバイオント間の循環キメラリズムの構築が成功したことを確認します。
   1. 20g/L2,2,2-トリブロモエタノールを濃度0.1mL/10gで各マウスに腹腔内注射することにより、パラバイオントを麻酔する。
   2. ドナーマウスを静脈ビジュアルマウス尾フィクサーで固定します。
   3. 70〜75%のアルコールに浸した綿のボールで、パラバイオントの尾の脇腹に尾静脈をこすり、尾をきれいにし、血管を拡張します。
   4. 右手にブドウ糖を含む1.0 mLの注射器を持ち、針を静脈に平行に保ちます(15°未満)。
   5. 尾端から約2~4cmの位置に針を挿入します。
   6. 100 μLのグルコース(1.2g/kg)を10秒以内にドナーに注入します。
      注:ドナーという用語は、尾静脈を介してグルコース注射を受けるパラバイオレントを指す。レシピエントは他のパラバイオレントで、グルコースを直接受け取りません。
   7. ヨードファーでつま先をきれいにします。ドナーマウスとレシピエントマウスのつま先をハサミで切り取り、グルコースの注射後に異なる時点(1分、5分、10分、15分、20分、30分、40分、50分、60分)で血液の滴を採取する。より多くの損傷を避けるために、各収集時点で血栓を取り除く。
      注:採取された血液の量は、1回の検査で10〜25ul、合計で90〜225ulであった。
   8. グルコースレベル検出のためのグルコメーターテストストリップの中心に血液を滴下.
2. エバンの青いカウンターステインをポジティブコントロールとして使う^3.
   1. 0.5%のエヴァンの青いカウンターステインを腹腔内の200 μLをドナーマウスに注入します。
   2. 2時間後、20g/L2,2-トリブロモエタノールを各マウスに0.2mL/10gの濃度で腹腔内注射してパラバイオイントを安楽死させ、心臓穿刺により両方のパラバイオレントから血液を採取する。
   3. 血液サンプルを916 x gで15分間遠心分離する。
   4. 上清から血清を集める。
   5. 血清を0.9%NaClで1:50に希釈します。
   6. 分光光度計で620nmで希釈した血清サンプルの吸光度を測定します。

結果

ドナーマウス6匹では、血糖濃度が100μLのブドウ糖(1.2g/kg)を尾静脈に注射した後、平均1分で26.5μmol/L(173%増加)に急上昇し、60分で13.3μmol/Lに徐々に低下した。レシピエントマウスでは、注射後に血糖値がゆっくりと上昇し、15分で最初のピークレベルに達した(47%増加、12.2μmol/L)。上記の結果に基づいて、循環キメラ症の標準は次のように設定した:1)グルコース注入後1分以内のドナーマウスにおける血糖値の急激な上昇(最低100%増加または20μmol/L)、及び2)注射後15分のレシピエントマウスにおける血糖値の有意な増加(最小37%増加)(図1)。

また、パラバイオントの血清中のエバンス青色素の濃度は、循環キメラリズムの構築に成功したことを示した(図2)。血中グルコース測定後のパラビオを安楽死さ...

ディスカッション

パラバイオシスは、実験手段^6、7、8によって共通の血管系を確立するために2匹の生きている動物を接続する外科的技術を指す。このモデルの利点は、単一の個人によって生成された物質が同時に両方の動物に作用することができるということです。したがって、パラビオシスモデルは、関連疾患における物質または因子の役割を探求するために使用することができ、多くの有意義で革新的な結論を生み出す。その大きな適用価値の観点から、モデルは、心血管系疾患8、9、10、11、12、13、神経系障害...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
湾曲鉗子	JZ手術器具、中国	J31340
細かいはさみ	JZ手術器具、中国	WA1030
針鉗子	JZ手術器具、中国	60017961
2.5 mL注射器	Agilent、米国	5182-9642
Tribromoethano	Sigma-Aldrich、米国	T48402-5G
ペニシリン	Solarbio、中国	IP0150
トラマドール	Yijishiye、中国	YJT712520
血糖値計	ロシュ糖尿病ケア、インディアナ	Accu-Chekアクティブテストストリップエ
ヴァンの青いカウンターステイン	Solarbio、中国	G1810
脱毛クリーム	ナイール、アメリカ	LL9161
温暖毛布(加熱パッド)	ケントサイエンティフィックコーポレーション、米国	TP-22G
電気シェー	バーCodos、中国	CP-5000
3-0,5-0 外科用縫合	糸上海医療縫合針工場、中国	SYZ 3-0#、SYZ 5-0#