出芽酵母SNX-BARヘテロダイマーの発現、精製、リポソーム結合

サマリー

ここでは、酵母におけるSNX-BARヘテロダイマーの発現、精製及びリポソーム結合のワークフローを提示する。

要約

SNX-BARタンパク質は、エンドサイトーシス中のタンパク質と脂質の選別と密売、エンドソーム系内での選別、オートファジーの選別に重要な役割を果たす、進化的に保存された膜改造タンパク質クラスです。SNX-BARタンパク質機能の中心は、高度に保存されたフォックス相同性(PX)およびBAR(ビン/アンフィフィシン/Rvs)ドメインを使用して膜を結合するホモダイマーまたはヘテロダイマーを形成する能力です。さらに、膜上のSNX-BARダイマーのオリゴマー化は膜管および小胞の形成を引き起こすことができ、この活性はエンドソーム由来輸送キャリアのコートタンパク質としての機能を反映すると考えられている。研究者は長い間、合成リポソームまたは巨大ユニラメラ小胞(GUV)上の組換えSNX-BARタンパク質を用いたインビトロ結合研究を利用して、膜リモデリングを駆動するために必要な脂質の正確な構成を明らかにし、その作用機序を明らかにしてきました。しかし、二重発現系の技術的な課題、細菌におけるSNX-BARタンパク質発現の毒性、および個々のSNX-BARタンパク質の溶解性の低下により、これまでのほとんどの研究では、細菌の発現中に形成される非生理学的二量体を含むSNX-BARホモダイマーを調べてきた。最近では、典型的な細菌発現系の大きな欠点を克服するためのプロトコルを最適化しました。このワークフローを用いて、大量のSNX-BARヘテロダイマーを正常に発現および精製する方法と、結合および管結アッセイのための合成リポソーム上でそれらを再構成する方法を示します。

概要

形質膜などの膜結合オルガネラは、小胞体、ゴルジ装置、リソソーム(酵母空胞)、およびエンドソームが真核細胞の内膜系を含む。ほとんどのオルガネラは、小胞輸送キャリアを介して他のオルガネラと通信し、物質を交換する能力を有する。細胞が内膜系内の小胞輸送キャリアの包装および形成をどのように調整するかをよく理解されていない。しかし、内膜系の多くを構成するタンパク質および脂質は、形質膜(PM)からの内視鏡小胞の内在化に由来することが知られている。内因性は、これらの小胞の一次アクセプターオルガネラであり、管状オルガネラの複数の相互接続されたセットで構成されています。内因性者の主な機能は、栄養獲得を促進し、タンパク質および脂質のターンオーバーを調節し、病原体感染から保護し、形質膜の脂質の主要な補充源として機能することである。内因性は、血漿膜から大量の貨物タンパク質および脂質を受け取るにつれて、貨物を管状内染色輸送キャリア(ETC)に分離することによって仕分けコンパートメントとして機能する。ETCに隔離されていないタンパク質は、エンドリソソーム系を介して分解されます。EDCに選別する貨物の調節不良は、栄養素の取り込み、タンパク質のターンオーバーまたは脂質恒常性の喪失につながり、多数の代謝、発達、および神経学的障害をもたらす^1、2。しかしながら、内因性におけるEPCの中心的な役割にもかかわらず、内因性者が多数の異種貨物の包装を管状キャリアに選択的に調整する方法の根本的なメカニズムは知られていない。

選別ネキシン(SNX)ファミリーは、細胞^3、4、5における多くの小胞輸送反応に重要であることが判明した進化的に保存されたタンパク質クラスである。選別ネキシンはエンドソーム膜にリクルートされ、その特徴的なフォックス相同性(PX)ドメインを介して貨物捕獲を助け、エンドソーム膜に富んだ脂質であるホスファチジルイノシトール-3-一リン酸(PtdIns(3)P)と結合する。哺乳動物は33個のSNXタンパク質をコードし、他のドメイン¹の存在に応じて、さらに複数のサブファミリーに分けることができる。最も顕著なのは、SNX-BARサブファミリーはヒトで12個からなる最大のサブファミリーであり、出芽酵母ではサッカロミセス・セレビシエで、サブファミリーはわずか7 SNX-BARRに減少する。SNX-BARタンパク質は、PXドメインと、脂質貯留層を引き起して陽性曲率膜を結合するビンアンフィフィシン-RvS(BAR)ドメインの両方を有する。その結果、SNX-BARファミリーはエンドソームに対して自然な親和性を有し、膜改造能力を介してETC形成を仲介することができる。インビトロでは、SNX-BARのリモデリング特性は、合成リポソームに精製されたSNX-BARを添加し、その後の狭い、被覆管を電子顕微鏡で可視化することによって誘導することができる。これらの方法を用いて、研究者は、オリゴマー化濃度と収縮強度の両方がSNX-BARファミリーの間で異なっているように見えることを決定し、ETCの形成とサイションの両方に役立つ可能性を示唆している。

SNX-BARは、その排他的二量体化特性によってさらに分類することができる。インビトロ結合アッセイと構造研究は、SNX-BARタンパク質が特異的ホモジマーまたはヘテロダイマーのみを形成できることを実証しています。したがって、原理的には、各潜在的なSNX-BARダイマーオリゴマーは、貨物特異的な入稿経路に対してチューブルコートを提供することができ、同様に、他のSNX-BARプロトマーの制限されたオリゴマー化は、異なる輸出経路を定義することもできる。しかし、SNX-BARの数が多く、SNXファミリー内の多様性が多いため、ネキシンワン貨物仮説を選別する可能性は非常に低いです。代わりに、SNX-BAR、貨物、脂質特異性、その他の依存関係など、さまざまな要因を使用して協調的な作業を行う可能性が高くなります。同様に、酵母SNX4ファミリーの最近の研究は、PtdIns(3)Pを超えて、追加の脂質特異性の証拠を明らかにし、内染色体輸送キャリア⁶を増強する。本研究では、SNX-BARホモダイマーMvp1-Mvp1を細菌および天然ヘテロダイマーSnx4-Atg20およびVps5-Vps17から精製し、酵母からの高収率で発現および精製したが、Snx4-Atg20のみがホスファチジルセリン(PS)と結合する構造を優先的に結合し、唇の^{結合研究で}狭いチューブ様構造を形成することが分かった。この分野の他の分野では、細菌由来の組換え精製SNX-BARホモダイマーを用いたSNX-BARの重要な特性を明らかにしているが、類似系でSNX-BARヘテロダイマーを発現させることに伴う毒性は、本来の特徴付けを妨げている^{7、8、9、10}である。したがって、純粋な組換え発現天然ヘテロダイマーを得るための信頼性の高いシステムがなければ、研究者はこれらの調査ラインを見送らなければなりません。図1では、1)タンデム親和性精製のためのSNX-BARヘテロダイマーを過剰発現する酵母株を構築する4部構成のワークフローを提示し、 2)発現および精製天然SNX-BARヘテロダイマー、3)ユニラメラ合成リポソームを調製し、4)リポソームチューブまたは沈沈沈下アッセイを設定し、研究者が自然界で見つかったソートネキシンの成長カタログを調査するための重要なツールを提供する。

プロトコル

1. 酵母ひずみ構造

1. TVY614(pep4Δ::LEU2 prb1Δ::hisG prc1Δ::HIS3)¹¹から始めます。この株は、細胞分解後のタンパク質分解の大部分に寄与する空胞プロテアーゼに欠乏し、したがって、よりクリーンで効率的な精製を可能にする。
2. 設計プライマー¹²と相同組換えを用いてAtg20(SNX-BAR ORF1)のC末端でタンデム親和性精製(TAP)タグを統合する。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して統合を確認します(図2)。
3. TAPタグに対してウェスタンブロットのセル溶解を実行し、適切な統合¹³を確認する。
   注:SDS-PAGEおよびウェスタンブロット検証のために3つのOD(1 OD ≥ 1 x 10⁷細胞)の細胞を収穫することをお勧めします。TAP タグの統合は、内因性プロモーターを GAL1 プロモーターに置き換える前に発生し、ウェスタンブロットを介した TAP タグ検証を容易にすることに注意してください。
4. 内因性Snx4(SNX-BAR ORF1)およびAtg20(SNX-BAR ORF 2)プロモーターを、個々のORF 14の逐次相同組換えおよび変換ステップを使用して、タグなし^GAL1プロモーターに置き換えます。
5. 統合サイトの外部でフランキング プライマーを使用して、統合が成功したことを PCR で確認します (図 2)。これは、成長培地中にガラクトースがない場合に標的SNX-BARのヌル表現型をもたらす。

2. 酵母誘導とSNX-BARダイマー精製

注:酵母細胞は、染色体的に統合された改変として、標準的なYPD(酵母エキス、ペプトン、および2%グルコース)寒天プレート上に伝播することができる。

1. 標準YP(酵母エキスとペプトン)培地の50 mLに細胞の大きな綿棒を接種し、フラスコ中の炭素源として2%ラフィノースと0.1%グルコースを少なくとも4倍の培養量にし、30°Cシェーカーで一晩成長させて適切な通気を可能にする。この培地の成長は、標準的なYPDに比べて遅くなると予想されます。
2. 翌朝、50 mLの前培養を使用して、2%ラフィノースと0.1%のグルコースを有する標準YP培地の1Lに接種し、30°Cシェーカーで4〜5時間成長させます。
   注:1L培養を接種するために使用されるプレカルチャーの体積は、前培養の_OD600に応じて調整され得る。接種後の1L培養物の_OD600は、4〜5時間成長中に少なくとも2倍を可能にするために約0.2でなければならない。
   1. 適切な通気を可能にするために成長のためにバッフルフェルンバッハフラスコを使用して、2.8 Lボリュームフラスコで十分です。通気が少ないと、収穫時に成長が遅くなり、細胞ペレットが小さくなることがある。
3. OD₆₀₀をチェックして、培養が4~5時間の成長後にログフェーズ(0.5-1)にあることを確認します。ひずみの成長に応じて、少なくとも2倍にできるように成長時間を調整します。2%ガラクトースに加え、30°シェイカーで一晩成長します。
   注:一晩の成長後の_OD600は変化し得るが、培養は飽和すべきである。この増殖プロトコルに2%ガラクトースを添加する前に、細胞を0.1%グルコースから除去する必要はないことに注意してください。検証のためにSDS-PAGEとウェスタンブロットのために、このステップで未誘導および誘導細胞の3つのODを収穫することをお勧めします(図3A、B、レーン1-2)。
4. 4500 x gで15分間遠心分離して細胞を収穫する。ここでは、1 L ボリュームカルチャーに対応するスイングバケットローターを使用できます。
5. 酵母ペレットを50mL円錐管に移します。必要に応じて2番目の遠心分離工程を実行してもよい。細胞ペレットは、一般に、卒業マーキングによって測定された体積で約10〜15mLであり、すぐに使用するか、-80°Cで保存することができます。
   1. 15 mL精製バッファー(50 mM Tris pH 7.4、300 mM NaCl、1.5 mM MgCl_2、1mM ジチオスレイトール(DTT)、プロテアーゼ阻害剤カクテル)でペレットを再サスペンドし、約30mLの最終体積を作る。
6. 使用前にホモジナイザー4°Cを冷やし、精製バッファーで平衡化する。機械的細胞破壊体またはホモジナイザーを用いた細胞をライゼする。ホモジナイザーにサンプルをロードし、2-3ラウンドのために20,000-25,000 psiでlyse;細胞がリンパが出るにつれて、20,000-25,000 psiを維持するために、より多くの入力圧力が必要になることに注意してください。氷上の50 mL円錐形チューブで細胞リサートを収集します。
   注:追加のサンプルを洗浄する必要がある場合は、次のサンプルをロードする前に、ホモジナイザーを完全に洗浄して平衡化する必要があります。すべての細胞リシスを氷の上に置いてください。
7. 直ちに35,000 x gで細胞リサートを4°Cで1時間クリアします。慎重に新しいチューブに上清を転送します。細胞リシスからの脂質は遠心分離中に上部に浮遊し、精製に影響を与えないことに注意してください。
   注:SDS-PAGEサンプルのリサートとペレットの0.5-1%を保存することをお勧めします。典型的には、大きな違いは観察されず、TAPタンパク質溶解性を確認するために追加のウェスタンブロットが行われ得る(それぞれ図4、レーン1および2)。
8. 精製バッファーを用いてIgGセファロースビーズの300μLを平衡化する。クリアした細胞リジン酸塩に加え、2時間インキュベートし、4°Cで回転させる。
9. 10 mLクロマトグラフィーカラムにビーズを集め、非結合リサートが流れるようにします。
10. 洗浄バッファー(50 mM Tris pH 7.4、300 mM NaCl、1.5 mM MgCl_2、1mM DTT)を使用してビーズを洗浄し、一度に1mLを加算し、完全に流れるようにします。
    注:SDS-PAGE サンプル用のバインド IgG ビーズの 2% を保存することをお勧めします。通常、私たちは4つの主要なバンドを観察します。2つのSNX-BARタンパク質とIgGヘビーおよびライトチェーン(図4、レーン3)。TEV切断効率を比較するために、同等の量の「溶出物」と「TEV後のIgGビーズ」を保存することをお勧めします。
11. ビーズを収集し、マイクロ遠心チューブに転送します。新鮮な洗浄バッファーと10 mg/mL TEVプロテアーゼの2 μLで全容積の500 μLに追加し、4°Cで回転し、一晩インキュベートします。
12. 翌朝、27G針を使用して上清を完全に除去し、タンパク質純度を10%ポリアクリルアミドSDS-PAGEで評価します(図4、レーン4)。
    注:通常、0.5-1 mg/mLの500μLを95%純粋ヘテロ二量(図4、レーン4)とします。カルモジュリン樹脂を用いた追加の精製も可能ですが、通常は収量が大幅に減少し、純度が>90%の場合はここで停止することをお勧めします。TEVはリポソーム結合アッセイを妨げませんが、TEVはNi-NTAアガロースビーズ¹⁵を使用してさらに除去することができます。
13. 濃縮するには、メーカーの指示に従って、10 KDaカットオフと遠心分離機を備えた0.5 mL遠心フィルターにサンプルを移します。ブラッドフォードタンパク質アッセイを用いて濃縮タンパク質を定量する。4°Cで保管し、1週間以内にご使用ください。

3. リポソーム製剤

1. 市販の脂質を購入する: ホスファチジルセリン (PS), PI3P, エルゴステロール, ホスファチジルコリン (PC).必要に応じて、推奨される溶媒に再サスペンドしてストック脂質を作ります。
   注:脂質は、製造業者の推奨事項に従ってメタノール/クロロホルム混合物に再懸濁される。使用する前に、脂質ストックが透明で室温まで温まれていることを確認してください。再懸濁脂質は、アルゴンガスの下に貯蔵し、6〜12ヶ月間、または活性の損失が観察されるまで-20°Cでワックスフィルム(または同等物)を使用して密封することができる。
2. 各脂質ストックに必要な体積を計算して、所望の脂質組成との混合物を作成します(表1を参照)。脂質混合物中の脂質の合計1モルを仮定する。
3. 化学ヒュームフードでこのステップを実行します。クロロホルムの完全な注射器の容積を描き、廃棄物容器に捨てることによってきれいなガラス注射器。さらに 2 回繰り返します。クロロホルムを移す場合は、ガラスシリンジまたはピペットのみを使用してください。クロロホルムを描くときは、シリンジに気泡が入らないようにストッパーをゆっくり引っ張ってください。
4. ガラスシリンジを使用して、クリーンなガラス培養管に計算されたストック脂質を転写し、1%PI3P、20%エルゴステロール、30%PS、PC(表1)の最終脂質混合物を作製する。各脂質が再懸濁される溶媒によっては、各脂質を添加すると混合物が曇りになることがある。
   注:PSの濃度を変化させる(0-30%)には、それに応じて音量を調整し、様々なPCで補正する(表1)。
5. 円運動で脂質混合物に向けられた窒素ガスを用いて脂質混合物を慎重に乾燥させ、脂質を均一に乾燥させる。乾燥プロセス中にガラス管の底部に脂質を保つために低ガスの流れを使用してください。ガラス培養管をホイルで包み、開口部を未カバーのままにし、さらに1時間真空中で脱水する。
6. 400 μL の結合バッファー (50 mM Tris pH 7.4, 300 mM NaCl, 1 mM MgCl₂₎を加えると、脂質を完全に脱水し、最終的なリポソーム濃度を 2.5 mM にします。
   注:最終的なリポソーム濃度は、多かれ少なかれ結合緩衝液を添加することによって調整することができる。例えば、200μL結合緩衝液を添加して、必要に応じて5mMのリポソーム濃度を生成してもよい(下記参照)。
   1. 30分間室温で渦上で中速で振って脂質を再懸濁し、脂質が再懸濁されると、緩衝液は曇って見えるはずです。
7. 再懸濁されたリポソームをマイクロ遠心管に移す。この時点から、プラスチックピペットチップは、脂質がクロロホルムに再懸濁されなくなったように使用され得る。リポソーム溶液は曇って見えるはずです。
8. 凍結融解リポソームは、まず液体窒素にマイクロ遠心管を浸し込み、次に37°水浴中に沈み込む。リポソーム混合物は、解凍する前に完全に凍結し、目で固体に見える必要があります。
9. 化学ヒュームフードにクロロホルムを含むステップを実行します。クロロホルムの完全な注射器の容積を引き出して捨てることによって2つの1 mLガラス注射器をきれいにし、それぞれ3回、残留脂質を除去する。各ガラスシリンジを2つのシリンジボリュームを作成して超純水で平衡化し、2つのシリンジボリュームを作成して結合バッファと平衡化します。
10. メーカーの推奨事項に従ってミニ押出機を組み立てます。結合バッファーにそれぞれを水没させることにより、1つの200 nm膜と2つのフィルタサポート(材料表を参照)を平衡化します。
11. フィルターサポートとミニ押出機に配置する間に膜を挟みます。組み立てられたミニ押出機のデッドボリュームを減らし、アセンブリが気密であることを確認するには、1 mLガラスシリンジを使用してミニ押出機を介してリポソーム混合物の体積に匹敵する結合バッファのボリュームを渡します。
12. 1 mLガラスシリンジのいずれかを使用し、リポソーム混合物を描きます。マイクロ遠心チューブを反転して、ガラスシリンジに引き込むためにチューブキャップ内のリポソーム混合物の最後を収集します。
13. 200nm膜を19〜21回通過してリポソームを押し出す。新しいマイクロ遠心管で押し出されたリポソームを収集します。
    注:押し出しリポソームは、押し出し前のリポソームよりも曇りが少なく見えるはずです。リポソームは、同じ日に使用し、氷の上に保存する必要があります。最後の押し出しは、リポソームを始めた注射器の反対側に置く必要があります。

4. SNX-BAR リポソーム結合とチューブ

1. リポソーム結合および沈殿実験を行う前に、4°Cで20分間の超遠心分離機で100,000 x gで精製されたタンパク質を予め整示しました。上清を取り除き、新しいマイクロ遠心管に移します。ペレットがある場合は、ペレットを乱さないでください。
2. リポソーム結合および管状アッセイを行うために、4μM精製Snx4-Atg20および2.5 mMリポソームを20μLの全反応体積でインキュベートし、添加するリポソームの体積を変化させる。
   注:同じ実験では、同じ量のリポソームを使用する必要があります。
3. 30°Cで30分間インキュベートする。
   注:沈殿時の可視化を可能にするために、10μL以上のリポソームを用いて、各反応に添加する2.5mMリポソームの量を最大化することを提案する。20μL反応で2.5mMリポソームの10μLを使用する場合、リポソームの最終濃度は1.25mMになります。精製されたタンパク質が希釈され、4 μMタンパク質に対してより多くの体積が必要な場合、脂質はリポソームの濃度を2倍にするために、水分補給工程中に200μLで再懸濁され得る(ステップ3.6を参照)。しかし、これはリポソームを作る前にタンパク質濃度を知る必要があります。
4. リポソームの管を視覚化し、定量します。
   1. 電子顕微鏡分析のために直ちにリポソーム結合反応を処理する。炭素被覆銅メッシュグリッド上のスポット試料及び1%ウラニル酢酸塩を用いた負の染色(図5B)16。
   2. 透過型電子顕微鏡(200kV)でサンプルを分析します。
   3. 画像解析ソフトウェアを使用して、尿細管の直径を測定および定量します。単一のチューブルの尿細管径を正確に定量するには、チューブの長さに沿って3つの直径測定を行い、平均(図5B)。
      注:分散の双方向分析を使用して統計的有意性を決定しました (図 5E)。酢酸ウラノールは放射性と毒性の両方です。この手順を実行するには、適切なラボの安全性認定が必要です。
5. リポソーム結合と沈沈下。
   1. 反応(20°L、ステップ4.3から)をポリカーボネート遠心管に移し、互換性のあるローターを使用して、4°Cで20分間、超遠心分離機で100,000 x gで回転させます。慎重に上清を除去し、新しいマイクロ遠心管に移します。ペレットはそのまま残す必要があることに注意してください。
   2. サンプルバッファーのSDS-PAGE 40°Lのペレットを再サスペンドし、新しいマイクロ遠心管に移します。上清に20μLのサンプルバッファーを加えます。10%ポリアクリルアミドSDS-PAGEゲルに同等量のペレットと上清をロードし、クマシー染色を行い、リポソームに結合したSNX-BAを可視化する(図5A)。
   3. ペレット画分中のSNX-BAR複合体の量を定量するには、密度測定を用いてバンド強度を定量し、ペレット画分中のSNX-BARタンパク質の割合を定量する。
      注:分散の双方向分析を使用して統計的有意性を決定しました(図5C)。

結果

このプロトコルは、下流膜改造アッセイに使用できる内因性酵母SNX-BAR複合体の再現性と堅牢な製造方法を記述する(図1)。精製に用いた酵母株の構築は、出芽酵母における相同組換えの効率を利用し、標的SNX-BARのゲノムロチでの改変を可能にする(図2)。この設計には2つの利点があり、(i)選択が修飾を維持する必要がないように、標準的なYP培地を使用することができ、より高い細胞密度への増殖を可能にし、したがって、タンパク質のより高い産生を可能にし、(ii)標的SNX-BARの発現レベルが均等になり、ヘテロ二量体複合体の産生を最適化する。ガラクトースを添加する前に、標的SNX-BARはヌル表現型を示すため、標的SNX-BARに特異的な成長欠陥またはその他の既知の欠陥をもたらす可能性があります。さらに、2%ラフィノースおよび0.1%グルコースの増殖は、2%グルコースの増殖よりも遅い。したがって、ガラクトース誘導前の増殖期間は、各特定の株に対する最適化を必要とし得...

ディスカッション

ここでは、酵母のSNX-BARダイマーを精製するための最適化されたワークフローと、合成リポソーム上の生物物理特性を評価する2つのアッセイを示します。大腸菌または他のシステムにおける典型的な組換えタンパク質発現に対する主な利点は、天然の宿主でSNX-BARタンパク質を均等に発現する能力であり、したがって、他のシステムにおけるSNX-BARの精製に見られる毒性および不溶性の問題を回避する。また、我々のシステムは、分子クローニングや複数の発現ベクター¹⁷の収容を必要としないことも注目に値する。当社の二重SNX-BAR酵母株は、染色体設計されたガラクトースプロモーターによって駆動され、誘導時の発現さえも保証します。重要な考慮事項は、ガラクトースがない場合、標的となるSNX-BARの発現がほとんどなく、したがってヌル表現型になることです。さらに、SNX-BARsはC末端タグを十分に許容する傾向があり、C末端にTAPタグを追加できることがわかります。しかし、タグ付けされるタンパク質に応じて、N末端TAPタグを¹²個用いることもできる。さ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.2 μm PC メンブレン	Avanti	610006
10 mL Poly-Prep Chromatography カラム (Bio-Rad)	Bio-Rad	731-1550
27 G needle	BD Biosciences	301629
Amicon Ultra Centrifugal Filter with 10K cutoff	Amicon	UFC501024
Avestin EmulsiFlex-C3 Homogenizer	Avestin	EF-C3
BCA assay	Pierce	23225
Beckman Optima MAX-XP 超遠心分離機	Beckman Coulter	393315
Complete Protease Inhibitor Cocktail	Roche	4693116001
DOPC	Avanti	850375
DOPS	Avanti	840035
Ergosterol (Sigma)	Sigma	47130-U
押出機セットブロック 0.2 μL/1 mL	Avanti	610000
FEI Tecnai F20 透過型電子顕微鏡 (200 kV)
ガラス製培養管	VWR	47729-570
IgG セファロースビーズ (GE Healthcare)	GE Healthcare	17-0969-01
Microlter ガラスシリンジ	ハミルトン	7637-01
ニューブランズウィック エクセラ E25	エッペンドルフ	M1353-0000	または同等の揺れ30°CC
Ni-NTA磁気アガロースビーズ	ピアス	78605
ティマXE-90超遠心分離機	ベックマンコール	ターA94516
パラフィルムM	VWR	52858-076
PI3P	エシュロン	P-3016	またはエシュロン相当
ポリカーボネートボトルアセンブリ	ベックマンコールター	355622
TLA-100固定角度ローター	ベックマン・コールター	343840
タイプ 45 Ti ローター	ベックマン・コールター
真空デシケーター、ソケットバルブ付き底部および蓋	VWR	75871-436
真空ポンプ アルカテル (Pascal 2005 C1)	A&J バキューム	PN07050
ボルテックス フォームホルダー付	VWR	10153-838
VWR キット マイクロチューブ	VWR	12620-880