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方法論記事

出生前イスルmnからのオキュロモータ、トロクレア、脊髄運動ニューロンの単離と培養 :GFPトランスジェニックマウス

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DOI:

10.3791/60440

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2019年11月12日

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1Department of Neurology, Boston Children's Hospital, 2FM Kirby Neurobiology Center, Boston Children's Hospital, 3Department of Neurology, Harvard Medical School, 4Medical Genetics Training Program, Harvard Medical School, 5Department of Ophthalmology, Boston Children's Hospital, 6Department of Ophthalmology, Harvard Medical School, 7Broad Institute of M.I.T. and Harvard, 8Howard Hughes Medical Institute, 9Department of Neurology, Kokura Memorial Hospital, 10Department of Genetics, Albert Einstein College of Medicine

この記事について

サマリー

この研究は、原発性オキュロモーター、トロクレア、および脊髄運動ニューロンの均質な細胞培養を生み出すプロトコルを提示する。これらの培養物は、眼および脊髄運動ニューロンの形態学的、細胞的、分子的、および電気生理学的特性の比較分析に使用することができる。

要約

オキュロモーターニューロン(CN3s)およびトロクレアニューロン(CN4s)は、脊髄運動ニューロン(SM)と比較して筋萎縮性側索硬化症(ALS)などの変性運動ニューロン疾患に対して顕著な耐性を示す。プライマリ マウス CN3、CN4、および SNN を分離および培養する機能は、この選択的な脆弱性の根底にあるメカニズムを研究するアプローチを提供します。現在までに、ほとんどのプロトコルは異種細胞培養物を使用しており、実験的な結果の解釈を混乱させる可能性があります。混合細胞集団に伴う問題を最小限に抑えるためには、純粋な培養が不可欠です。ここで、第1のプロトコルは、胚発生日11.5(E11.5)Isl MN:GFPトランスジェニックマウス胚を用いて、同じ胚からSMNと一緒にCN3/CN4を効率的に精製および培養する方法を詳細に説明する。このプロトコルは、組織解離および解離、FACSベースの細胞単離、およびCN3/CN4およびSMN核からの細胞のインビトロ培養に関する詳細を提供する。このプロトコルは、既存のプロトコルに新しいインビトロCN3/CN4培養システムを追加し、同時に比較のために純粋な種と年齢に一致するSMN培養を提供します。運動ニューロンの形態学的、細胞的、分子的、電気生理学的特性に着目した解析は、この培養システムにおいて実現可能である。このプロトコルは、運動ニューロンの発達、選択的脆弱性、および疾患を定義するメカニズムの研究を可能にする。

概要

一次運動ニューロンの培養は、外因性ストレッサーに対する神経発達、機能、および感受性の研究を可能にする強力なツールです。運動ニューロン培養は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)1、2などの神経変性疾患の研究に特に有用であり、その疾患メカニズムは不完全に理解されている。興味深いことに、ALS患者およびALSモデルマウスの両方における脊髄運動ニューロン(SM)の有意な細胞死にもかかわらず、オキュロ運動ニューロン(CN3s)およびトロクレアニューロン(CN4s)における細胞死は比較的少ない1、3、4、5、6、7、8、9である。したがって、CN3/CN4sおよびSMNの純粋培養の比較分析は、相対的な脆弱性の根底にあるメカニズムに関する重要な手がかりを提供する可能性がある。残念ながら、このような分析の大きな障壁は、これらの運動ニューロンの精製培養を成長させることができないことです。

動物モデルからのSNNの精製については、多くのプロトコルが記載されている。これらのプロトコルのほとんどは、密度勾配遠心分離10、11、12および/またはp75NTR-抗体ベースの細胞ソートパンニング技術13、14、15、16を使用する。密度勾配遠心分離は、他の脊椎細胞に対してSNNのより大きなサイズを利用するのに対し、p75NTRは脊髄内のSNNによって排他的に発現される細胞外タンパク質である。ほぼ100%純粋なSMN培養物は、これらのプロトコル11、12、14の一方または両方によって生成されている。ただし、CN3/CN4s は p75NTRを表せず、その他の特定の CN3/CN4 マーカーが特定されていないため、これらのプロトコルは CN3/CN4 カルチャの生成に成功していません。また、SNN よりも小さいため、サイズに基づいて分離するのが難しくなります。代わりに、CN3sまたはCN4のインビトロ研究は、解剖された17、18、19、20、21、エクスプラント17、22、23、24、25、26、およびスライス27、28の異種細胞タイプで構成され、プロトコルが存在しなかった。プライマリCN3またはCN4の分離と培養。

ここでは、同じ胚発生日11.5(E11.5)Isl MN:GFPトランスジェニックマウス29(図1、図2A)からのCN3、CN4、およびSNNの可視化、単離、精製、および培養のためのプロトコルについて説明するプロトコルである。IslMN:GFPは、細胞膜に局在するファルネシル化 GFP を有する運動ニューロンを特異的に標識します。このプロトコルは、運動ニューロン疾患の病理学的メカニズムを解明するために、複数のタイプの運動ニューロンの種および年齢マッチング比較を可能にする。

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プロトコル

実験動物を利用した実験はすべて、実験動物のケアと使用に関するNIHガイドラインに従い、ボストン小児病院の動物ケア・利用委員会の承認を得て行った。

1. 解剖前のタイミング交配の設定

  1. 運動ニューロンの収穫のために出生前胚性マウスを生成するには、各雌マウスの体重を量り、ニューロン単離の日の11.5日前に成人IslMN:GFPトランスジェニックマウス間のタイミング交配を設定します。このプロトコルの開発を目的として、129S1/C57BL/6J IslMN:GFPマウスを2~9ヶ月齢で使用し、夕方にタイミング合致を設定した。
  2. 翌朝、雌のマウスに膣栓がないか調べてください。プラグが胚の日(E)0.5として識別される日付を考えてみましょう。
  3. 雌のマウスの重量を量り、E8.5−11の間に超音波(材料の表を参照)を使用して子犬を調べます。交配が成功した兆候がないか確認してください。
    1. メスマウスの体重増加を検出して交配が成功したことを確認します(通常、5~6個以上の胚がある場合はE9.5で>1.5g)。
    2. 超音波の下で胚を視覚的に確認します。胚はE9.5の後に超音波によって容易に検出される。超音波は、彼らがそうでないものよりも頻繁に妊娠しているので、体重が増加した女性にのみ行われます。
      注:メスマウスは妊娠以外の理由で体重を増やすことができるので、体重増加だけでは妊娠の信頼できる指標ではない。超音波確認は、妊娠していないが、利用できない場合は重要ではない女性の不必要な犠牲を防ぎます。

2. 解剖条件と器具の調製

  1. すべてのコーティング(カバーリップの酸洗浄を除く)、メディア調製、組織解離(遠心分離およびインキュベーションを除く)、層流フードで培養作業を行い、メディアおよび胚性運動ニューロンの滅菌性を確保します。
  2. 滅菌技術に細心の注意を払って、汚染の危険性を最小限に抑えながら層流フードの外側で組織解剖を行います。
  3. 解剖プレート1枚、マイクロディセグドハサミ1組、親指ドレッシング鉗子1組、デュモン#5ピンセット2組、マイクロセグマナイフ1本、モリアミニ穿刺スプーン1本を、使用前に70%エタノールに浸して滅菌します。

3. PDL/ラミニンコーティングの料理/カバースリップ

注:培養は、適用に必要な細胞の数に応じて、96ウェルまたは24ウェルプレートで一次運動ニューロンを解結合した。ウェルが光学的に透明であり、厚さがイメージングと互換性がある場合、細胞はカバースリップを使用せずに組織培養プレート内で直接画像化することができます。

  1. カバースリップを必要とするアプリケーションについては、先に説明した30のように、ニューロン分離の少なくとも2日前に酸洗浄、殺菌、および空気乾燥カバーリップを調製する。カバースリップのバッチは、実験の前にこの方法でよく調製することができ、実験品質に影響を与えることなく、最大6ヶ月まで保存することができます。
  2. ニューロン単離の2日前にリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に20μg/mLポリD-リジン(PDL)の作動溶液を調製します。
    1. アリクォートPDL(1mg/mL)を事前に、-20°Cでストックソリューションとして保存してください。
  3. 各カバースリップの表面または十分なPDL溶液加工溶液(例えば、96ウェルプレート上のウェルあたり100μL、またはカバースリップの有無にかかわらず24ウェルプレート上のウェルあたり500 μL)で組織培養プレートの表面をカバーします。37°Cで一晩インキュベートする。
  4. 翌日は殺菌水で3倍洗浄する。
    1. プレートをパラフィンフィルムで密封し、最終洗浄後に完全に乾燥させた場合は、4°Cで4°Cで保存します。
  5. 1.2 mLのPBSでラミニン(1.1−1.2 mg/mL)の10°Lで作業溶液を準備します。
    1. アリコートラミニン株(1.1−1.2 mg/mL)を事前に、-80°Cで保管してください。
  6. 各カバースリップの表面をカバーするか、表面を均等にコーティングするのに十分なラミニン溶液でよくカバーします。使用前に37°Cで少なくとも2時間インキュベートする。
    注:PDL/ラミニンコーティングプレートおよびカバーリップは37°Cで1週間まで保存できるが、塗りたてのラミニンが好ましい。めっき30の前にラミニンを直接取り除く。ラミニンは乾燥させてはならない。プレートを数時間以上保存する場合は、パラフィンフィルムで包む必要があります。

4. 解剖、運動ニューロン培養媒体、解離液の準備

注:括弧内の濃度は、各試薬の最終濃度を示す。

  1. 解剖媒体を準備します。
    1. 熱不活トチマセラムを4°Cで一晩解凍し、1mLアリコートを調製し、-20°Cで保存します。使用前にRTでアリコートを解凍してください。
    2. 1 mL のアリコートで B27-サプリメント (50x) を -20 °C で保存します。使用直前にRTでアリコートを解凍してください。凍結/解凍サイクルを避けてください。
    3. 4°または-20°Cでグルタミンサプリメント(100x)を保存します。-20°Cで保存する場合は、0.5 mLのアリコートに分割します。
    4. ペニシリン・ストレプトマイシン(10,000 U/mL)を-20°Cで1mLアリコートに保存します。使用直前にRTでアリコートを解凍してください。
    5. 解剖媒体を作るために、 ヒベルネートEの9.4 mLを馬血清200°L(2%)、50x B27サプリメント(1x)の200°L、100xグルタミンサプリメント(1x)の100μL(例えば、グルタMAX)、および10,000 U/mLペニシリン・ストレプトマイズ(1000°ML)の100°Lを混合します。解剖された組織を収集し、解離した細胞の最終的な懸濁液を作る場合に、この培地を使用します。
    6. ニューロン分離の前日に組織採取用の解剖培地を500μLを個々の1.7 mLマイクロ遠心管に加えます。回収される組織タイプごとに1本のチューブ(例えば、正対照、陰性対照、CN3/CN4、SMN)を準備し、使用前に4°Cで保管してください。
    7. 49 mL の Hibernate E 低蛍光培地を 1 mL の B27 サプリメント (1x) と組み合わせ、ニューロンの分離の前日にこの培地 (2 mL/well) で 24 ウェルプレートを充填します。この料理は、マウスの胚を収集するために使用します。使用前に4°Cで保管してください。
  2. 運動ニューロン培養培地を調製する。
    1. ライボヴィッツのL15培地に25mM 2-メルカプトエタノールの250μLアリコートを調製します。-20°Cで保管してください。
    2. 殺菌水で希釈したBDNF、CNTF、GDNFの100μg/mL溶液の5μLアリコートを生成します。-80°Cで保管し、使用直前にRTでアリコートを解凍してください。
    3. ジメチルスルホキシド(DMSO)を64μLのフォルスコリンとボルテックスウェルの5mg(1.0670 μM)に加えて10mMフォルスコリン溶液を調製し、完全に溶解させます。次に、DMSO溶液と渦によく殺菌水(1.003 mL)を加えます。10 mMフォルスコリンの12μLアリコートを-20°Cで保存し、使用直前にRTでアリコートを解凍してください。
    4. DMSOで希釈した100mMイソブチルメチルキサンチン(IBMX)の12μLアリコートを調製します。-20°Cで保管し、使用直前にRTでアリコートを解凍してください。
    5. 運動ニューロン培養培地を作るために、9.4mLの神経基底培地と200μLの馬血清(2%)を混合し、 200μLの50x B27サプリメント(1x)、100xグルタミンサプリメント(1x)の100μL、10,000 U/mの100μL:ペニシリンストレプトマイシン(100 U/mL)、および25 mM 2-メルカプトエタノール(50μM)の20μL、直接使用する前に好ましい。このステップは、ニューロン分離の1日前まで行うことができる。
    6. 使用直前に、100 μg/mL BDNF (10 ng/mL)、CNTF (10 ng/mL)、GDNF (10 ng/mL) と 10 mM フォルスコリン (10 μM) の 10 μL、および 10 mM IBMX (100 μM) の 10 μL を運動ニューロン培養培地にそれぞれ 1 μL を追加します。培地を37°Cに前温する。
  3. 解離ソリューションを準備します。
    1. パパイン溶液(20 U/mLパパインおよび0.005%DNase)とアルブミン-オボムコイド阻害剤溶液(1mg/mLオボムコイド阻害剤、1mg/mLアルブミン、0.005%DNase)をメーカーの指示に従って調製します。
    2. オボムコイド阻害剤およびパパイン溶液のそれぞれ500μLアリコートを調製し、-80°Cで保存する。使用直前に37°Cでアリコートを解凍してください。

5. 腹中脳と脊髄解剖

注:蛍光解剖体顕微鏡で、ステップ 5.1.1-5.1.3 および 5.1.5-5.1.6 を除き、以下のすべての手順を実行します。実験あたりの総解剖時間は、通常、解剖技術の習熟度と各実験に必要な運動ニューロンの数に応じて、3〜5時間である。

  1. 腹中脳解
    1. 二酸化炭素ガスと子宮頸部転位による妊娠マウスの受精後約11.5日を安楽死させる。
    2. 腹部にエタノールを十分にスプレーし、無菌微小分離ハサミと親指ドレッシング鉗子を使用して子宮を取り除きます。子宮を滅菌PBSで短時間洗浄し、その後、プレチルド滅菌PBSで満たされた解剖プレートに移す。
    3. シスレットマイクロディセグメントハサミ、親指ドレッシング鉗子、デュモン#5ピンセットを顕微鏡の明るい光の下で氷冷滅PBSで使用して、子宮からIslMN:GFP陽性胚を慎重に取り除きます。滅菌モリアミニ穿入スプーンを使用して、各胚を1x B27で補充されたプレチルドヒベルネート-E低蛍光培地で満たされた24ウェルプレートの別々のウェルに移す。24ウェルプレートを氷の上に置いてください。
    4. 1つの胚を滅菌解剖板に移し、氷冷無菌ハンクのバランス塩溶液(HBSS)で完全に覆います。
    5. 解剖ステップが顕微鏡の蛍光体イソチオシアネート(FITC)照明の下で行われることを確認します。ピンセットを使用して、中脳を損傷することなく、胚の尾と顔を取り除きます(図2Ba)。下に手足がまたがり、尾が顕微鏡の前面を向き、離星に向かって胚を置きます(アスタリスク、図2Bb)。
    6. ピンセットを使用して、小さな開口部を生成するために、第4の心室の屋根を開きます。この開口部を使用して、第4心室とその屋根の間に作成されたスペースにピンセットをフックします。胚ロストラルの後面を皮質に沿って解剖し、床板とモーターカラムに横向きに(図2Ca,b)。解剖された組織をオープンブックで開き、GFP陽性CN3およびCN4核を明らかにします。
      注:間葉膜、CN3、CN4を含む腹半脳の小さな組織が露出する。
    7. 慎重に胚から腹部の中脳を分離し、ピンセットとマイクロセグミジングナイフを使用して髄膜組織を除去します。ピンセットとマイクロセクサジックナイフを使用して、床板および他のGFP陰性周囲組織から離れた両側GFP陽性CN3およびCN4核を解剖する(図2D)。除出された組織のGFP陽性運動ニューロンの数を最大化しますが、それらに触れたり損傷を与えたりしないでください。
    8. 別個のCN3およびCN4核の収集が望ましい場合は、これら2つの核の中間線に沿って切断する(図2Dの黄色の点線)。P1000ピペットを使用して、最小限のHBSSで解剖された腹部中脳組織を収集し、解剖媒体で満たされた標識された1.7 mLマイクロ遠心管に入れます(ステップ4.1.5を参照)。解離するまで氷の上に保管してください。
    9. 合計数が実験要件を満たすまで、同じチューブ内の追加胚から腹部の中脳をプールし続けます(理想的なセル番号については、ステップ8を参照してください)。
      注:組織は解離および選別中にストレスを受けるので、約1 x 104 CN3/CN4運動ニューロンを生じる少なくとも10の腹部中脳のプールされたコレクションをお勧めします。
  2. 腹脊髄解剖
    1. 顕微鏡の前部を向いた頭部を離れに向けて、胚を起こしやすい状態に保ちます。ピンセットの1ペアで胚を保持し、第4心室の未開封のコード部分にピンセットのもう一方のペアの先端を挿入します。
    2. 胚の回転範囲全体にわたって後脳と脊髄の残りの部分を背部に開きます。後部組織を切断して開き、第4心室から始まり、鉗子をはさみとして使用して、大脊髄の中央管に向かって働く(図2Ca,b)。この処置の間、腹部の脊髄に触れたり損傷を与えたりしないように注意してください。
    3. ピンセットの1ペアで胚を保持し、ピンセットの他のペアと両側の後ろ組織のフラップをつまむ(図2Ea,b)。
      注:分液化後ろ組織には、後ろ皮膚、間葉系、後根神経節(DRG)、後後脳、脊髄が含まれる。これらの組織は、接着性であり、フィルタリング中に SMN をトラップしたり、FACS のソート中に目詰まりを引き起こしたりする可能性があるため、SMN 核を損傷することなく、できるだけ多くの組織を取り除きます。
    4. GFP陽性SMNのすぐ下に突き刺さるようにマイクロ分剖ナイフを使用して腹側脊髄を取り外します。両側の鋸のような動きで腹脊髄を持ち上げます (図 2Fa,b)。最初のGFP陽性前角部プロジェクトであるC1の真上で、浮遊腹部脊髄を横に切ります(図2G)。また、下肢の上の境界で横に切ります(図2G)。この手順の後、腹脊髄の頸椎(C1)-腰椎(L2-L3)部分を取り外します。
    5. 1対のピンセットでGFP陽性SMNカラムの間にGFP陰性組織を押して、腹脊髄後側を上に置き、保持します。GFP陽性SMNカラムの両側をマイクロジ剖ナイフでトリミングして、残りの付着した間葉系、DRG、および後側脊髄を取り除きます(図2H)。GFP陽性運動ニューロンを損傷することなく最大化するように注意してください。
    6. P1000ピペットを使用して、最小限のHBSSで解剖された腹側脊髄組織を収集し、解剖媒体で満たされたSMN標識1.7 mLマイクロ遠心管に置きます。解離するまで氷の上に保管してください。総数が実験要件を満たすまで、同じチューブ内の追加の胚から腹部脊髄をプールし続けます。
      注:組織は解離および選別中にストレスを受けるので、約2.1 x 104 SMNを生じる少なくとも3つの腹脊髄を集めることをお勧めします。
    7. 蛍光活性化細胞選別(FACS)のGFP陽性およびGFP陰性対照として、IslMN:GFPマウス胚の顔運動ニューロンと四肢をそれぞれ収集します。SNNのGFP陽性軸索がこの胚年齢でまだ四肢に伸びていないため、四肢はGFP陰性である。

6. 組織解離

注:総解離時間は、通常、実験あたり1.5時間である。

  1. 温かいパパインおよびアルブミン・オボムコイド阻害剤溶液アリコートを解離する前に37°30分にする。
  2. マイクロセク剖された組織を低速で短時間スピンダウンします。
  3. P100ピペットを使用して、組織を吸引することなく、できるだけ多くのヒバネートEを慎重に取り除きます。
    注:次のステップでパパイン解離の有効性を低下させないために、このステップの後にすべての残留ヒバネートEを削除してください。
  4. マイクロセク剖組織サンプルを含む1.7 mLマイクロ遠心管のそれぞれにパパイン溶液(表1)の適切な体積を加えます。
    注:解離のためのパパインの適切な体積は、細胞へのストレスを最小限に抑えながら、効果的な解離を最大化するために決定された。
  5. P200ピペットで8xを穏やかに三重にします。すべてのトリチュレーションステップを穏やかに実行して、運動ニューロンの生存率を維持します。
  6. 37°Cで30分間組織を含むチューブをインキュベートし、10分ごとに10倍の指フリックで攪拌し、インキュベーション後にP200ピペットで各懸濁液8倍を穏やかにトリキュレートする。300 x gで細胞を 5 分間スピンダウンします。
  7. 次のステップでオボムコイド阻害の有効性を確保するには、P1000ピペットを使用して、組織を吸引することなく、できるだけ多くの上清を除去し、廃棄します。
  8. P200ピペットで8xを穏やかに三量りとすることにより、アルブミン-オボムコイド阻害剤溶液(表1)の適切な体積のペレットを再サスペンドする。
  9. 2分間待って、未解傷の組織の残りの部分がチューブの底部に落ち着くようにします。
  10. P200ピペットを使用して未解傷組織を吸引することなく、できるだけ多くの上清を収集します。新しい1.7 mLマイクロ遠心管に上清を移します。
  11. ステップ6.10後に組織の一部の塊が解離されていない場合は、元の1.7 mLマイクロ遠心管に残っている未解離組織に対して手順6.8-6.10を繰り返し、細胞のストレスを最小限に抑えながら解離した細胞の最終的な収率を最大化します。以前に解離し、ステップ6.10の上清に含まれる。
  12. 300 x gで細胞を 5 分間スピンダウンします。
  13. P1000ピペットを使用して8xをピペットすることにより、適切な量の解剖媒体(表1)でペレットを再サスペンドします。最終的な懸濁液の適切な体積は、細胞密度が107細胞/mLを超えないように決定され、フローサイトメトリーマシンの流れを遮断するだけでなく、細胞が過度に希釈されないようにして、ソート速度が遅くなる。
  14. 70μmの細胞ストレーナーを通して懸濁液を濾過し、大きな塊または未消化組織を除去します。懸濁液を5mL丸底ポリスチレン試験管に移し、必要になるまで氷の上に保管します。

7. 蛍光活性化細胞選別(FACS)

注:このプロトコルは、15 mw 405 nmバイオレットレーザー、100 mw 488 nmブルーレーザー、75 mw 594 nmオレンジレーザー、および40 mw 640 nm赤色レーザーを搭載したFACSソーターを使用して最適化されました。細胞は、100μmノズルを介して無菌条件下で滅菌PBS中のシース液として選別した。セル応力を最小限に抑えるために、流量を1−3のサンプル圧力に設定し、毎秒最大1,000〜4,000イベントが取得されるようにした。FACS 時間の合計は、通常、実験あたり 1 ~2 時間です。

  1. セルの母集団を正しく視覚化できるように、前方および横方向の散乱の電圧を設定します。セルのソートに適切な電圧を設定することは複雑であり、経験豊富なFACSオペレータが必要です。
  2. 異なるセル集団を区別するには、前方散乱領域(FSC-A)によって決定されるサイズと、側方散布領域(SSC-A)によって決定される内部複雑度に基づいてセルをプロットします。図 3Aaおよび図 Baに示すように、生きているセルの周囲にゲートを描画して、破片と死んだセルを除外します。ゲート領域内のセルを母集団 1 (P1) としてグループ化します。
  3. セルの束とダブレットを除外するには、サイドスキャッタ幅(SSC-W)とSSC-Aに基づいて次に P1 セルをプロットします。単一細胞の集団を母集団2(P2)としてゲートする(図3Abおよび図Bb)。
  4. 前方散乱幅 (FSC-W) と FSC-A に基づいて P2 セルをプロットし、単一セルの母集団を母集団 3 (P3) としてゲートします (図 3Acおよび図 Bc)。
    注: 7.3 および 7.4 で 2 つの連続したゲートを使用すると、セルの束とダブレット(高 FSC-W および高 FSC-A)は除外されます。
  5. GFP対アロフィコシアニン(APC)に基づくゲートP3細胞。APCチャネルは自己蛍光を検出する。このチャネルでゲーティングは自己蛍光細胞の捕獲を避ける。GFP負のセルを使用して、FITC/GFP 蛍光チャネルの電圧を調整します。理想的には、これらの細胞集団の位置ゲートは約102.運動ニューロンのタイプごとに、GFP 陽性集団 4 (P4) のゲートしきい値を個別に選択します (図 3Adおよび図 Bd)。
    注:純粋なカルチャを取得するには、CN3/C4 よりも SNN の GFP ゲートをはるかに高く設定します (図 3Adおよび図 Bd)。SMN培養のためのより低いGFPゲートは、グリアおよび非運動ニューロンによる培養物の汚染につながる。これは、漏れやすいプロモーターに起因するいくつかのグリアおよび非運動ニューロンに低レベルのGFP発現があるためである可能性が高い。総セルと比較したGFP陽性細胞の割合は、通常、CN3/CN4sの場合は0.5−1.5%、SNNの場合は1.5−2.5%です。解剖が成功した場合、これらの数値をベンチマークとして使用して、GFP陽性ゲートの適切な位置を決定することができます(図3Aeおよび図Be)。
  6. 製造元のプロトコルに従って FACS を実行します。500°Lの運動ニューロン培養培地で満たされた新鮮な1.7 mLマイクロ遠心管にP4細胞を収集します。めっきまで氷の上に保管してください。
    注:セルはウェルに直接並べ替えることができますが、その結果、ウェルあたりのセル数が不均等になります。より均等なめっき分布を達成するために、1.75 mLマイクロ遠心管に細胞をソートし、手動でプレートします。

8. 精製一次運動ニューロンの培養

  1. モータニューロン培養培地を用いた希薄FACS単離CN3/CN4およびSMN懸濁液を、それぞれ5x 103および1 x 104細胞/mLの密度に37°Cに前温した。
    注:1つのE11.5胚はおよそ1 x 103 CN3/CN4および7 x 103 SMNを生じる。しかし、これらの収率は、解剖組織の純度、細胞解離の完全性、およびFACS中のGFPゲートの適切な閾値に大きく依存する。
  2. PDLとラミニンでコーティングされた96ウェルプレートを37°Cの組織培養インキュベーターから層流フードに移し、各ウェルからラミニンを吸引します。皿やカバーリップを洗わずにすぐに使ってください。
  3. 200 μL の希釈 CN3/CN4 および SMN 懸濁液を PDL/ラミニンコーティングされた 96 ウェルプレートの各ウェルに追加します。最終的なセル密度は、CN3/CN4 および SMN に対してそれぞれ 1 x 103および 2 x 103セル/ウェルである必要があります。
    注:96ウェルプレート(2 x 103セル/ウェル)のSMの初期めっき密度は、CN3/CN4s(1 x 103細胞/ウェル)の2倍であり、2日と9日で同様の最終運動ニューロン数と密度をインビトロ(DIV)(4−6 x 102および2−4 x102セル当たり)で得られます。
  4. 培養ニューロンを37°C、5%CO2インキュベーターで培養する。
  5. 古い媒体(100°L)の半分を取り除き、新鮮な運動ニューロン培養培地の同じ容積と置き換えることによって、5日ごとにニューロンを供給する。神経プロセスが 1 DIV で見えるようになり、14 DIV によって太く長くなるようにします (図 4)。神経細胞体は拡大し、特にSMの長期培養で凝集する傾向がある(図4)。
    注:培養細胞の剥離を避けるために、元の中容量の半分を残して、すべての培地および溶液の変更を実行します。これには、固定および免疫細胞化学(ICC)ステップが含まれます。すべてのメディアを取り除くと、どんなに穏やかに取り外されても、ほとんどの細胞は剥離して洗い流されます。

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結果

このプロトコルの目的は、運動ニューロン障害の基礎となるメカニズムの比較分析を可能にするために、プライマリCN3/CN4s/CN4とSNNの両方を長期的に高度に浄化および培養するものでした(概要については図1と図2を参照)。

ニューロンが正常に単離され、培養中に成長すると、ほぼ純粋な一次CN3/CN4およびSMN培養物が得られ(図5A、B)、少なくとも14 DIVに維持された(図4および図6)。2 DIVにおけるCN3/CN4およびSMN培養物の純度はそれぞれ93.5±2.2%および86.7±4.7%であり、運動ニューロンマー...

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ディスカッション

歴史的に、CN3および/またはCN4運動ニューロンのインビトロ研究は、解離された17、18、19、20、21、エクスプラント17、22、23、24、25、26、およびスライス27、28の培養物を区別することができないなどの異種培養に依存してきました

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開示事項

著者らは利益相反を宣言しない。

謝辞

ブリジット・ペットマン(バイオジェン、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国)のSMN解剖技術の指導に感謝します。ダナ・ファーバー癌研究所フローサイトメトリー施設、ハーバード大学医学部免疫部門フローサイトメトリー施設、ジョスリン糖尿病センターフローサイトメトリーコア、ブリガムと女性病院フローサイトメトリーコア、ボストン小児病院フローサイトメトリー研究施設A.A.ニュージェント、A.P.テニー、A.S.リー、E.H.グエン、M.F.ローズ、追加のエングル研究所メンバー、プロジェクトALSコンソーシアムメンバーは、技術的な支援と思慮深い議論のために。この研究はプロジェクトALSによって支持されました。また、海外の国際心臓財団/バイエルヤチン研究助成、遺伝学T32 GM007748のNIH研修助成金を受け、R.F.は資金提供を受けました。J.J.は、シペンス眼科学研究所を通じて眼疾患分子基盤(5T32EY007145-16)のNIH/NEIトレーニングプログラム、ボストン小児病院を通じて発達神経学研修プログラム博士研究員(5T32NS007473-19)によって支援されました。M.C.WはNEI(5K08EY027850)と小児病院眼科財団(教員発見賞)によって支援されました。そしてE.C.E.はハワード・ヒューズ医学研究所の研究者です。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)Thermo Fisher ScientificA-110011:400
Alexa Fluor 594-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG (H+L)Thermo Fisher ScientificA-110721:400
B27 Supplement (50x), serum freeThermo Fisher Scientific17504-044
BD FACSAria llu SORP Flow CytometerBD Bioscience-これには、405、488、594、および640nmのレーザーを備えた4つのレーザーシステムがあります。
BDファルコン70μm ナイロンセルストレーナーCORNING352350FACSの前に解離細胞をろ過します。
BDファルコン スナップキャップ付き丸底試験管コーニング352054
BDNF HumanProSpec-Tany TechnoGene, Ltd.CYT-207
Cell Culture microplate, 96 well, PS, F-bottom (Chimney Well)Greiner Bio-One International655090私たちは複数の96ウェルディッシュを試しましたが、これはICC後の培養と分析に最適なものでした
用Circular Cover GlassesKarl Hecht &Assistent1001/14面積が大きかったため(直径:14mm)、このカバースリップを使用しました。
CNTFヒトプロスペック-タニーテクノジーン(株)CYT-272
シクロピアゾン酸 Penicillium cyclopiumSigma-AldrichC1530CPAERストレッサーの1つ。
4′,6-ジアミジノ-2-フェニルイノドール (DAPI)サーモフィッシャーサイエンティフィックD1306
ジメチルスルホキシドSigma-AldrichD2650DMSO
Dumont #5 鉗子 イノックス チップサイズ 0.05 mm x 0.01 mm バイオロジーチップロボズ 手術器具RS-5015
フォルスコリンサーモフィッシャーサイエンティフィックBP25205
GDNF ヒトProSpec-Tanyテクノジーン(株)CYT-305
GlutaMAX サプリメントサーモフィッシャーサイエンティフィック35050-061
ハンクス平衡塩溶液(HBSS)サーモフィッシャーサイエンティフィック14175-095
Hibernate EBrainBitsHE
低蛍光BrainBitsHELF胚のGFP発現の観察を妨げる蛍光は低くなければなりません。
馬の血清、熱不活化、ニュージーランド原産サーモフィッシャーサイエンティフィック26050-070
IBMXトクリス・クックソン2845イソブチルメチルキサンチン
ラミニンサーモフィッシャーサイエンティフィック23017-015
リーボビッツ's L15 ミディアムサーモフィッシャーサイエンティフィック11415064
2-メルカプトエタノールSigma-AldrichM6250
マイクロ解剖ハサミRoboz 手術器具RS-5913
マイクロナイフ 4.75" 1.7 mm x 27 mm ブレードRoboz 手術器具RS-6272
Moria ミニ穴あきスプーンファインサイエンスツール10370-19
神経細胞クラスIIIに対するマウスモノクローナル抗体 &β;-tubulin (TUBB3)BioLegend8012021:500, TUJ1
Nikon Perfect Focus Eclipse Ti live cell fluorescence microscope and Elements softwareNikon-Differentialinterference contrast images and immunocytochemistry images were captured with these equipment of the same
硝酸 90%, Fuming (Certified ACS)FisherScientificA202-212カバーガラスのすすぎ用
Olympus 1.7 mL Microtubes, ClearGenesee Scientific22-281これらは、文脈で「1.7 mL微量遠心チューブ」と説明したチューブです。
パパイン解離システムワージントン バイオケミカル コーポレーションLK003150パパイン溶液とアルブミン-オボムコイド阻害剤溶液は、このキットから調製されます。
ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-122
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)Thermo Fisher Scientific10010-023
Poly D-lysin (PDL)MilliporeSigmaA-003-E
Abcamab1095171:200に対するウサギモノクローナル抗体
カメラNikon-Dissectionを行い、解剖した胚と組織の画像をこれらの蛍光顕微鏡で撮影しました。
Sylgard 170 Black Silicone Encapsulant - A+B 0.9 kg kitDow Corning1696157このキットを使用して解剖皿を製造しています。
TC処理ディッシュ、100mm×20mmジェネシー・サイエンティフィック25-202このディッシュを使用して解剖皿を作っています。
Thum ドレッシング鉗子 4.5インチ 鋸歯状 2.2 mm 先端幅Roboz 手術器具RS-8100
トランスデューサー LOGOQ e VETGE HealthcareL8-18i-RS女性マウスの超音波用
獣医用超音波装置GE HealthcareLOGOQ e VET女性マウスの超音波用
Zeiss LSM 700 シリーズ レーザー走査型共焦点顕微鏡と Zen ソフトウェアカール・ツァイス●これらの装置で胚の共焦点像を撮影しました
顕微鏡Islet1 SMZ18 および DS-Ri1 SMZ1500ズーム実体顕微鏡

参考文献

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