スクレラクチニアン細胞集団の分離のための蛍光活性化細胞選別

サマリー

サンゴは、人間と海洋生物の両方にとって重要な生物多様性生態系を作り出します。しかし、多くのサンゴ細胞の可能性と機能をまだ理解していません。ここでは、石のサンゴ細胞集団の単離、標識、分離のために開発されたプロトコルを紹介する。

要約

サンゴ礁は、人類起源のストレッサーによって脅威にさらされています。これらのストレッサーに対するサンゴの生物学的応答は細胞レベルで起こり得るが、メカニズムはよく理解されていない。ストレッサーに対するサンゴの反応を調べるには、細胞応答を分析するためのツールが必要です。特に、細胞集団がストレスにどのように反応しているかを理解するために、機能アッセイの適用を容易にするツールが必要です。今回の研究では、蛍光活性化細胞選別(FACS)を使用して、石のサンゴの異なる細胞集団を分離します。このプロトコルには、(1)骨格からのサンゴ組織の分離、(2)単一細胞懸濁液の作成、フローサイトメトリー用の各種マーカーを用いたサンゴ細胞の標識、および(4)ゲーティングおよび細胞選別戦略が含まれる。この方法により、研究者は、さまざまな細胞集団の分析、機能アッセイ、遺伝子発現研究のために、細胞レベルでサンゴに取り組む。

概要

サンゴ礁は地球上で最も重要な生態系の一つです。彼らは、魚や無脊椎動物に重要な生息地を提供することによって生物多様性を促進し、観光を通じて食料と経済的生活を提供することによって人類起源のコミュニティを維持するために重要です¹.サンゴ礁のキービルダーとして、サンゴの動物(Phylum:Cnidaria)はまた、波と嵐の被害を軽減する大きな炭酸カルシウムフレームワークを作成することにより、沿岸のコミュニティを支援^{します 2}.

大人としてのサンゴは、ウイルス、アルカエア、細菌、プロティスト、真菌、そして最も顕著に、藻類ジノフラゲラートファミリーシンビオダニア科シンビオダニア科のメンバーを含む幅広いendosymbioticパートナーをホストするセシル動物である^。環境の変化は、このコミュニティの不均衡を引き起こす可能性があり、多くの場合、共生シンビオジニア科がサンゴのコロニーから追放される病気の流行やサンゴの漂白につながり、サンゴの主要な栄養源を排除します。これらのシナリオの両方は、多くの場合、サンゴのホスト^44、5、65の死^を6引き起こします。急速な気候変動....

プロトコル

1. エアーブラシとコンプレッサーによるサンゴ骨格からの組織の解離

注:氷の上でステップを実行し、手袋で手を保護します。

1. 空気圧縮機、ホース、エアブラシを接続してエアブラシキットを組み立てます(図2)。圧力計を276-483 kPaの間にセットします。
   注:この研究に使用される推奨コンプレッサーとエアホースは、393 kPaの最高圧力にプリセットされました。この276-483 kPaの範囲外での使用は、骨格からの不十分な細胞除去または細胞膜の破裂をもたらす可能性がある。この範囲は、種ごとに異なる場合があり、生存率テストを必要とする可能性があります。生存率試験は、単純なヘモサイトメーターと4′,6-ジミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)染料排除アッセイを用いて、化合物顕微鏡で可視化された細胞スラリーのサブセットで行うことができる。
2. オートクレーブで100mLの細胞染色培地を用意し、 滅菌ガラス容器は、3.3倍のリン酸緩衝生理食塩水(PBS;カルシウムおよびマグネシウムなし)の33mLを最終濃度3.3倍、2mLの胎児子牛血清(FCS;30分間56°Cで不活性化)を総体積の2%に、2mLの1M HEPESバッファーを最終濃度20mMに加えた。その後、滅菌水で100 mLでトップオフ。
   注:3.3倍のPBS濃度は、Rosental et al.

結果

全体的に見て、このプロトコルは機能分析に使用できる生きたサンゴ細胞集団の同定および収集を容易にするので有用である。このワークフローは、サンゴ組織を基になる炭酸カルシウム骨格から機械的に分離することから始まった(図1)。不適切な技術は細胞死亡率が高く、大量の破片を生み出す可能性があるため、これは最も重要な初期ステップの1つです。酵素分離は、組織せん断の増加と高い細胞死亡率をもたらす可能性があるため、推奨されません。エアブラシを用いた機械的分離は、これらの課題を軽減し(図2)、平均細胞死亡率を〜10%に減少させる(データは示さない)。スケルトンからの組織のエアブラシ媒介機械的分離に続いて、得られたスラリーを、細胞ストレーナーを濾過して細胞懸濁液に濾過した。次いで、細胞懸濁液をDNA(DAPI)、ROS、およびリソソームマーカーで染色し、FACSサイトメーターによって読み取った。その後、使用されている細胞マーカーに基づいて特定の細胞集団を単離するための格言戦略.......

ディスカッション

このプロトコルは、ローゼンタールら¹⁸から適応され、P.ダミコーンの細胞の同定および単離のために開発された。この方法論は、相対細胞サイズ、相対細胞粒度、細胞自家蛍光、無傷の細胞膜の存在を含む細胞固有因子の検査を通じて、破片、生存不可能な細胞、および共生細胞を除去するためにサンプルをフィルタリングするプロセスに焦点を当てています。これらの技術は、他のサンゴ種に適用することができます。しかし、FACSの格言戦略は、細胞集団特性における種特異的な違いによって異なる可能性がある。

サンゴの健康を理解するためのFACSの有用性は、細胞を差別的に識別し、単離するために多様な細胞固有の要因を使用する能力にあります。また、このプロトコルは、生存率、活性酸素種濃度、およびリソソーム含有量に基づいてサンゴ細胞を分化するための外因性細胞染色の追加使用について説明する。ローゼンタールら¹⁸で以前に試験された30+の市販マーカーのうち、24個の標識P.ダミコルニス細胞のうち、1.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
エアブラシキット&コンプレッサーTCP	グローバル	ABD KIT-H-SET	Paasche Hシリーズシングルアクションサイフォンフィードエアブラシキット、マスターTC-20コンプレッサー&エアホース
BD FACSAria II	BD	644832
ボーンカッター	バルクリーフサプライ	205357	Oceans Wonders コーラル ストーニー ボーンカッター
セルストレーナー	コーニング	352340	40 um;BDファルコン;個別に包装されています。不妊;ナイロン
CellRox Green	Life Technologies	C10444	2.5 mM in DMSO;励起/発光:485/520 nm
コレクションバッグ	グレインジャー	38UV35	Reloc ジップピット 6"L x 4"W ジッパーシールクロージャー付き標準再閉可能ポリバッグ、透明; 厚さ 2 mil
DAPI	Invitrogen	D1306	10mg in H2O;励起/発光:358/461 nm
子牛胎児血清	Sigma-Aldrich	F2442-100ML	57°Cで熱不活性化。C 30分間
血球計算盤	Sigma-Aldrich	Z359629	Bright-Line 血球計算計
HEPES バッファー	Sigma-Aldrich	H0887
LysoTracker Deep Red	Life Technologies	L12492	DMSO 中の 1mM;吸収/放出:647/668 nm
微量遠心チューブ	VWR	87003-294	1.7 mL
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)	Gibco	70011-044	pH 7.4; 10X
丸底チューブ	VWR	352063	5 mL ポリプロピレン丸底チューブ
シリンジ	BD	309628	1 mL BD Luer-Lokシリンジ滅菌、ポリカーボネート専用