クライオスフェア生息地におけるバイオマーカーのインシトゥ測定のための新規非侵襲的ツールとしてのレーザー誘起蛍光放射(L.I.F.E.)

凍結圏には、海氷、氷河、高山湖、雪地、湖氷、溶融水流、永久凍土があります。地球の大陸の約11%を占め、大気圏は凍結圏の認識環境として覆われています。最近の研究では、極低温圏の巨大な領域はすぐに後退していることを示しています^3,4.^{南極5、6、アルプス7、北極8、}その他の地域は負の氷量バランスを示す。氷の帽子と氷河の後退は、地球上で最大の淡水貯水池の枯渇につながります。一部の地域では、氷河の隠れ家は止められない⁵.

長い間、氷の生態系は無菌環境と考えられていました。しかし、過酷な条件にもかかわらず、地球の凍結圏におけるアクティブな生命の存在は、^明らかな9、10、11、12、13、14、15.溶融による氷の大量損失の傾向により、凍結圏は生物活動の変化を経て、隣接する生息地に影響を及ぼしています。部分的に不可逆的な変化を理解するには、空間的および時間的分解能が高いその下で氷の生物学的活性を調べる方法が必要です。

氷河期の環境では、生命はクライオコナイトの穴、雪のカバー、溶けた水、小川、および裸の氷の表面で見つけることができます。しかし、最も明白な上氷河の生息地は、クライオコニテの穴です。彼らはグラシアテッド環境で世界的に現れ、1870年代^の16、17年にグリーンランドへの遠征中にスウェーデンの探検家アドルフ・エリック・ノルデンスコルドによって最初に説明されました。名前はギリシャ語で「クリョス」(コールド)と「コニア」(ほこり)に由来します。エオリア由来のダークオーガニックと無機の破片が氷面に付着し、アルベドを局所的に減少させます。日射量は、破片をより深い氷層に溶かし、底^部9に堆積物(クライオコニト)を有する円筒形の盆地を形成する。クライオコニト穴は氷河アブレーション^ゾーン11の0.1~10%をカバーします。

クライオコニトコミュニティは、ウイルス、真菌、細菌、シアノバクテリア、微細藻類、原生動物からなる。地域によっては、ロッター、線虫、コペポッド、タージグレード、昆虫幼虫などのメタゾアン生物も見つかります。エドワーズと他^の18は、クライオコニテの穴を「氷冷ホットスポット」と表現しています。彼らはまた、N、Fe、S、およびPサイクリングを担当するクライオコニトホールで機能的な遺伝子を追跡しました。ミニ湖の生態系は、はるかに暖かく、より栄養豊富な^生息地11で見つかった速度で呼吸と光合成.これらの知見は、氷河期環境における微生物隔離の重要な役割を強調している。クライオコニテの穴の中の生きているコミュニティのほかに、裸の氷の表面は氷藻によって生息しています。彼らの生理学はよく研究^{されている19}ですが、その空間分布^は20を評価されていません。上氷河環境での彼らの存在は、アルベドを減少させ、したがって、下流の^生息地9に栄養の洗い流しと栄養入力につながる溶融を促進します。温度が上昇し、液体水の可用性が高くなると、これらの氷の生態系における正味生態系の生産性に影響を及ぼす。

上氷環境において、光合成活性生物は、無機炭素および窒素を有機に変換し、微生物食品^{ウェブ21、22に}利用可能な供給源である。今まで、氷河上炭素フ^{ラックス11、20、23}を推定する研究はほとんどありません。炭素流束の提案率の不一致は、空間的および時間的なデータ分解能が低い結果です。また、クライオコニテ孔外の氷河期群生の空間分布はほとんど評価されていない。クックと他^の20は、超氷河藻類のコミュニティは、その大きな表面カバレッジのために、現代の凍結コニテの穴よりも11倍多くの炭素を固定すると彼らのモデルで予測しました。サンプルの完全性を確保する氷河藻類群集の検出は、その結果検出および定量化のための欠けているツールのために依然として妨げられない。

物流の困難に対応して、氷の生態系は温帯地域の生息地よりも研究頻度が低い。データ解像度は、評価されるサンプルの数によって異なります。ソーイング、コーリング、その後の溶融などの標準的なサンプリング方法は、微生物群集の操作を伴う。例えば、固体氷試料におけるクロロフィルa(chl_a)評価は、実質的な干渉なしに標準的な方法では不可能である。したがって、調査された微生物群集内の溶融誘導温度変化は避けられない。サイクロ^フィル22における光系IIおよび他の細胞構造の熱性に応答して、溶融氷サンプルの実験室分析は、常にその場所での改ざんにつながる。

その上の測定の非破壊的な測定は信頼できるデータを得るための唯一の合理的な方法である。この目標は、蛍光ベースの方法を使用して達成することができる。その光収穫機能のために、chl_aおよびB-フィコエリスリン(B-PE)は、アネシオおよび他^の11によって証明されているように、上氷河環境における炭素循環に寄与する生物に存在する。したがって、これらの蛍光分子は、氷生態系における微生物媒介炭素フラックスの定量に適したバイオマーカーである。

本研究では、陸上および氷生態系におけるchl_a分子とB-PE分子のその場での定量における新規非侵襲的ツールの開発、校正、適用性を提示する。プロトタイプデバイスは、レーザーによる蛍光発光(L.I.F.Eとも呼ばれる)に基づいています。光学機器(図1)は、レーザー誘起蛍光励起後に蛍光バイオマーカーシグネチャを捕捉します。プロシージャは非破壊的であり、研究現場または実験室で行うことができる。

図1:L.I.F.E.プロトタイプ左:保護蓋のない器具の写真。右:楽器の概略図。総質量 = 5.4 kg (レーザーおよび光学系 = 4.025 kg、ラップトップ = 1.37 kg)。アルミニウムフレーム = 32.5 cm x 20.3 cm x 6.5 cm 光学管: 18.4 cm x 4 cm (直径)CCD: ブルーフォックス mv220g センサー;F:サーボステアリングロングパスフィルタ(450 nmおよび550 nm)。L: 光学レンズ;M1: ミラー;M2:ダイクロイックミラー;MC:マイクロコントローラ;P: プリズム;PBS:偏光ビームスプリッタ;S:調節可能なカミソリの刃から成っているスリット開口部。スケール バー = 70 mm.ここをクリックすると、この図の大きなバージョンが表示されます。

携帯用二重波長キットは4.5 kgの重量を量り、外付けコンピュータと組み合わせて三脚に使用される。フィールドの設定は迅速かつ簡単です。装置は三脚に取り付けられ、レンズ管はUSBケーブルおよびカメラケーブルと共に装置に取り付けられる。外部コンピュータはUSBケーブルを使用して計測器に接続されています。三脚脚は、レンズチューブが標本に向かって、覆われているように調整されます。次いで、分光計の光軸に向かって偏光をリダイレクトする偏光ビームスプリッタを通過した後、5mWの緑色レーザーが試料に当たる。検体は、図1に赤色で示す蛍光灯を示す。コリメートされた光の半分は偏光ビームスプリッタを通過し、レーザー信号を除去するサーボステアリングロングパスフィルタを介して集中します。次に、信号は2つの調節可能なカミソリの刃から成っている絞りスリットに当たる。プリズムは、信号がセンサーによって捕捉される前に、スリット絞りに直交する光の細線をスペクトル的に分離します。手順は青いレーザーで繰り返される。生データは、ソフトウェア操作にも使用されるポータブル コンピュータに自動的に転送されます。

この計測器は、撮影をCCDカメラと同期させ、レーザーのオン/オフを切り替え、ロングパスフィルターホイールを回転させるLabVIEW環境を使用して、外部コンピュータによって制御されます。グラフィカル・ユーザー・インターフェース (GUI) は、3 つの主要なセクションに分かれています。露出調整は手動で行います。露光時間と信号強度の補正は線形(図2B)ですが、積分時間が長いほど信号対雑音比が大幅に低下するため、最大露光時間は10sに制限されます。コメント フィールドは、サンプルの説明に使用されます (図 2A)。右側のセクションでは、測定が完了するとすぐに生の画像が表示されます。この機能は、現場での即時データ評価に不可欠です (図 2C–E)。赤い領域は露出過多のピクセルを示し、露出時間を短縮することで回避できます。

その後の生データ削減プロセスは、画像取得手順から切り離され、画像取得後いつでも行うことができます。

図 2: データ取得と生データ評価のための L.I.F.E. グラフィカル ユーザー インターフェイス(A) ソフトウェアは、サンプルの説明のための手動テキスト入力を有効にします。(B)露光時間は測定前に調整することができる。(C-E)生のイメージは、インターフェイスの右側に表示されます。(E)赤色はセンサーの彩度を示します。(F) [計測の実行]ボタンをアクティブにすると、データ取得プロセスがトリガされます。配列(G)では、データ取得中に自動的に実行されるすべてのコマンドが表示されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 3: 生のイメージの例左:アセトン溶液中のchl_の生データは、L.I.F.E機器で記録される。デバイスの光学的特性により、信号は歪んだ線として表示されます。右:ピクセルあたりの生画像(px)の解釈。スペクトル軸(5 nm/px分解能)は、空間軸(30μm/px分解能)に対してプロットされます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

12 ビットグレースケールの生画像は、CCDの前のプリズムによる1次元絞りスリットとスペクトル成分による空間成分を示しています(図3)。光学的制約に応じて、生の画像が歪みます。したがって、歪みの度合いを認識するコードを適用してトリミングおよび逆ワープする必要があります。これは、ソフトウェア ウィザード (図 4)を使用して行います。次に、波長キャリブレーションを532nmレーザーで行います。緑色光は、1,064 nmの赤外線レーザーの周波数倍増によって生成されます。両方の波長はCCDによって検出できるため、各画素のスペクトル位置は自動的に歪み画像で計算できます(図4)。

次に、画像を特定の波長範囲(緑色レーザー測定の場合は550~1,000 nm、青色レーザー測定の場合は400~1,000nm)までトリミングされます。選択したピクセルラインの各ピクセルのグレー値がカウントされ、合計されます。灰色の値の範囲は 0 ~ 255 です。その後、すべてのピクセルラインが1つの数字を占める。さらに画面上のソフトウェア命令は、空間座標に対してプロットされた各ピクセルラインからのグレー値カウントを示すプロットの生成につながります。これにより、試料中のchl_aとB-PEの定量的空間的判別が同時に可能にする。さらに、サンプルのスペクトルプロパティは、選択したピクセルラインから自動的にプロットできます。

図 4: 生のイメージをデワーピングする左:緑色のレーザーで撮影された生の画像。フィルタは使用されませんでした。信号は532 nmおよび1,064 nmで表示される。露光時間 = 0.015 s.センター:トリミングされた 532 nm 信号は、画像のセットをゆがめる基準線として使用されます。右:生のイメージ ソースから歪んだイメージ。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

1. キャリブレーションと検証

メモ:顔料キャリブレーションのために、chl_aおよびB-PEのストック溶液から希釈行を準備します。不種溶液_をアセトンで希釈し、B-PEを蒸留滅菌水で希釈します。その後、各希釈工程の15mLが必要となる。顔料をアルミホイルで包んで光から守ります。さらに使用するまで、冷凍庫にchl_aを入れ、B-PE を冷蔵庫に保管します。希釈行の詳細なプロトコルは、chl_aの場合はセクション 1.1、B-PE の場合は 1.2 に従います。L.I.F.E.計測器による顔料検出および定量のためのchl_aおよびB-PEラボキャリブレーションの両方について以下に説明します。以前の^{キャリブレーション24}は、本研究と同じ顔料で行われた。

1. クロロ_{フィル・ア・}希釈列
   1. 1mgのchl_a(A.ニデュラン藻類から精製)をアセトンで50mLのサンプルチューブに溶解し、アセトン_でこのchlを次の最終濃度に希釈します。800;640;320;160;80;40;20;10;5;1;0.5 ng/mL です。
   2. 各希釈の15 mLを50mLのサンプルチューブに移し、光感度によるアルミニウム箔で覆います。キャリブレーションの測定が行われるまで、チューブを-20°Cの冷凍庫に保管してください。
      注: プロトコルはここで中断できます。
   3. 二重ビーム分光光度計における各希釈物_{からの吸収特徴}を三重項として測定し、セクション2.2.2で詳しく説明するローレン^ツェン25に記載_{されている含有量を}計算する。
2. PE希釈行
   1. 滅菌濾過水(pH =7)で4mg/mL B-PE原液を次の最終濃度に希釈します: 1,000;800;640;320;160;80;40;20;10;そして5 ng/mL B-PE。各希釈の15 mLを50mLのサンプルチューブに移し、アルミニウム箔で覆います。さらに使用するまで4°Cで保管してください。
      注: プロトコルはここで中断できます。
3. キャリブレーションの設定
   1. 図 5に示すようにラックを構築して、3 つの測定プラットフォームを確立し、それぞれ 1.5 cm 高く設定します。
      注:図5に示すように、液体の表面はL.I.F.E.計器の焦点に留まる必要があるため、ラックとカラムの高さは測定に重要な役割を果たします。
   2. ポリシンチレーションプラスチックバイアルに最高濃度希釈の5 mLを追加し、ラックの最高点に置きます。蛍光強度を測定します。
   3. バイアルをラックの中央位置に置き、さらに5mL(総容積10mL)を追加します。蛍光強度を測定します。別の 5 mL (合計ボリューム 15 mL、列の高さ 45 mm の合計) を使用して、ラックの最も低い位置で手順を繰り返します。
      注:各希釈ステップの露光時間を調整して、検出器の飽和(12ビット画像では255以上のグレー値)と弱い蛍光信号の十分な信号対雑音比を防ぎます。
   4. すべての希釈(ステップ 1.1.1 および 1.2.1)で、chl_aと B-PE のステップ 1.3.2 と 1.3 を繰り返します。
   5. 生成されたデータ ファイルをデータ削減ウィザードに読み込み、Y 軸 (空間分布) に沿った各ピクセル ラインのグレー値を自動的にカウントして合計します。
      注:可変露光時間は、蛍光強度を1sの積分時間に正規化することにより自動的に補償されます。
   6. 希釈系列の既知の濃度と計算された正規化された蛍光強度を使用して、ポアソン回帰分析を使用して顔料面積密度を計算します。次に、各列の高さからのカウントを係数 (因子 1、0.5、および 0.33、それぞれ 5 mL、10 mL、および 15 mL 濃度溶液) で乗算することにより、3 つの異なる列の高さから 1.5 cm (5 mL) までの蛍光カウントを正規化します。

図5:実験室条件下でのchl_aおよびB-PEによるL.I.F.E.キャリブレーションの設定。
(A)器具のレンズ管。(B) B-PE励起用グリーンレーザー。(C)_励起のための青色レーザー。(D) シンチレーションバイアル.(E) L.I.F.E.楽器の焦点。(F) B-PE/水_または5mL、10 mL、および15 mLの/アセトン溶液。(G) 各溶液の表面を3つの異なるボリュームの焦点面に保つスペーサー。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

2. サンプリングとサンプル処理

1. 雪と氷のコレクション
   1. 氷河から無菌ポリエチレン袋に雪と氷河氷を収集し、さらに処理するまで凍結保存します。
      注:この研究では、サンプルはスヴァールバル諸島の高北極群(78°53'N、12°03'E)の研究村ニオーレスンド近くの多熱氷河であるミッドトレ・ラヴェンブリーン(MLB)で採取されました。
   2. 氷河前野から無菌ポリエチレン袋に細菌マットをサンプルし、さらなる処理のためにすべてのサンプルを実験室に運ぶ。
   3. 4°Cで暗い中で冷凍材料をゆっくりと溶融する。GF/Fフィルター(直径47mm)で液体サンプルをろ過し、ろ過した容積を書き留めます。さらに処理が行われるまで、フィルターを凍結したままにしておきます。
2. クロロフィル_の測定値
   1. L.I.F.E.計器を使用して、緑と青のレーザーを使用して、それぞれ三重の4つのランダムな領域でフィルタを測定します。面積密度にフィルター領域とろ過体積を掛けて、全体的な顔料濃度を計算します。顔料濃度(μg/L)を1Lの体積に正規化します。
   2. ローレン^ツェン25によるプロトコルに従って実験室標準でGF/Fフィルタ_の内容を評価する。これを行うには、アセトンの13 mLのバイアルに各フィルタを入れ、一晩4°Cで暗闇の中に保存します。次に、バイアルを取り、連続モードで50%の電力で2分間超音波処理の前に氷の上に置きます。絞り、バイアルからフィルタを削除します。
   3. シリンジにタイゴンチューブを取り付け、バイアルから抽出アセトンミックス_を取り除きます。タイゴンチューブをGF-5フィルターホルダーに交換してください。溶液を石英キュベットに移します。
   4. アセトンの吸光度分光計を校正した後、クベットにサンプルを入れ、400~750 nmの吸光度を測定します。次に、分光器からキュベットを取り出し、2M HClの200 μLをサンプルに加えます。次いで、吸光度測定を繰り返し、試料中のフェオフィチン含有量を測定する。
3. 放射線標識マーカーによる微生物活性の測定とレーザー強度と露光時間が生産性に及ぼす影響
   注意: マーカー放射(β放射)に注意してください。実験室のコート、手袋、ゴーグルを使用し、ライセンスを受けた同位体ラボでヒュームフードの下で作業します。
   1. 細菌の生産のために細菌マットの5つのアリコートを滅菌ポリエチレン袋に移す。ホルムアルデヒドでコントロールを4%の最終濃度に無効にします。
      注:3つのH標識ロイシン取り込み^には3つのアリコートが使用され、2つのアリコートがコントロールとして使用されます。
   2. マットを青いレーザー(405 nm、5 mW)、緑色のレーザー(532 nm、5 mW)でそれぞれ10sと30 sで露出させます。50 mW レーザーで手順を繰り返します。次いで、ホルムアルデヒドで処理されなかった試料を不活性化する。
      メモ:1つのマットは、1つのレーザー露光にのみ使用されます。非露出微生物マットをコントロールとして使用します。
   3. レーザー処理^後、3H-ロイシンとNaH¹⁴_CO3をそれぞれ組み込んで細菌および一次産生を推定する。細菌の産生測定では、サンプルあたり5つのアリコート(20 mL)を使用し、マーカーのアバイオティクス組み込みの制御として機能する2つの平行線にホルマリン(4%最終濃度)を加えます。様々な治療のすべてのサンプル^に3つのH-ロイシン(40 nM)を加え、その条件下(0.1°C)で4時間インキュベートします。残りのライブサンプルにホルマリンを加えて反応を終了します。
   4. 細菌マットの細菌産生のために、標識されたサンプルを凍結膜に移す。キルヒ^{マン26およびベル27}によるプロトコルに従って5分間10,000 x gで5%トリクロロ酢酸と遠心分離機で細胞を抽出する。シンチレーション液を加え、多発性バイアルにクライオビアーを入れます。液体シンチレーションカウンターでサンプルを分析し、取り込み率を計算します。
      注:3つのH標識ロイシン取り込み^には3つのアリコートが使用され、2つのアリコートがコントロールとして使用されます。
   5. 一次生産の場合は、様々なトリートメント(100mL)の5つの反復を準備し、そのうちの2つをアルミニウム箔に包んで暗いサンプルを模倣し、NaH¹⁴CO 3(1°Ci)をすべてに加えます。周囲光と温度(0.1 °C)で4時間インキュベートします。残りの3つの反復を暗くして反応を終了し、GF/Fフィルター(直径25mm)にサンプルをフィルタリングします。
   6. フィルターに100°Lの2 N HClを加えて余分なカーボンをすべて取り除き、ヒュームフードの下に空気を入れましょう。80°Cの加熱プレートでサンプルを乾燥させ、サンプルをポリシンチレーションバイアルに入れます。
   7. 一次および細菌産生のすべての治療の毎分(dpm)あたりの放射性崩壊を測定するには、凍結膜を多発性バイアルに入れ、5mLのシンチレーションカクテルを加えます。液体シンチレーションカウンターでdpmを測定し、取り込み率を計算します。

B-PE用ラボキャリブレーション
B-PE希釈行の応答信号は、20°Cの暗い部屋でL.I.F.E.計器で測定した(図6)。カウントレートは、測定されたサンプルの濃度とカラムの高さの両方に依存します。低濃度および低カラム高さB−PE検体は、同じ濃度およびより高いカラム高さのサンプルと比較してより強く蛍光を与えた。

図6:B-PEラボキャリブレーションB-PE含有量とカラム密度キャリブレーションを示します。正規化されたカウントレートは、列の高さが 1.5 cm の場合に計算されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

最終的なキャリブレーションラインフィットにはポアソン回帰が使用されました。面積密度とピクセルグレー値カウントの間には線形相関がありました。曲線の関数は y = 81.04x (図 7)で、1 s 露出サンプルのグレー値カウント率 8,104 が面積密度 100 ng/cm2 B-PE と等しいことを意味します。chlキャリブレーションはアナログ的に設定されます。関数は y = 8.94x でした。

図 7: B-PE の最終キャリブレーション曲線灰色の値のカウントは、1 s の露光時間に正規化され、面積密度に対してプロットされました。許可を得て再印刷28.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

スヴァールバルからのクライオコダイトサンプルとデータの実験室検証に関する応用
L.I.F.E.測定値の平均値と、アセトンを用いた従来の抽出および分光光度計を用いたその後の分析に由来する同じサンプルの単一測定値を図8に示す。

図 8: 自然サンプルを使用したデータ検証サンプル(MLB)は、実験室分光光度計(単一値)の結果に基づいて、1フィルタあたり4つのランダム領域で測定された蛍光データと比較して、含有量をchlによってランク付けされます。誤差範囲は、L.I.F.E.測定値の標準偏差を表します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

48μg/L-67 μg/Lの範囲のコンテンツは過小評価され、0.7μg/L-7 μg/Lから範囲の低いchlの内容は、L.I.F.E.プロトタイプによって過大評価されました。L.I.F.E.の測定値からの標準偏差は低かった。

その場所での測定からのスペクトルデータと実験室標準の比較
Chlスペクトルは、クリオコナイト試料とA.ニデュラン藻類から精製されたものとに匹敵した。すべてのサンプルにおける蛍光ピークは700 nm-710 nmであった。しかし、クライオコサイト試料に由来するスペクトルは、400nm~650nmと800nm~1,000nmの間のノイズ信号が、色素標準であるchlのスペクトルと比較して高いノイズ信号を示した(図9)。

図9:スペクトルデータの解釈405 nmレーザーで励起した後の4つのクリオコニット顆粒(青)およびchl標準顔料溶液(赤色)の測定。スペクトルは、サンプル収集の1年後に記録した。試料を凍結し、測定前に光にさらされなかった。波長キャリブレーションの問題に対応して、蛍光ピークは680 nmではなく700 nm-710 nmに位置しています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

自動クライオコニト粒分析
クライオコネット孔の自動分析の一例(図10)では、最も高い顔素面積密度が画素線50で観察された。532nmレーザーによる励起後のサンプルスペクトルは、センサの過飽和に応答して255のグレー値でカットオフしたピークを示した。このピークは緑色のレーザーに由来し、蛍光信号に由来しない。

図10:直径1mmの単一のクライオコニット顆粒の自動データ解析サンプルはヴェストレ・ブロッゲルブリーン(VBB)で採取し、Ny-Ålesundの北極駅(GB)施設の暗い実験室室でサンプリングした後、4時間以内に測定した。左側の列は B-PE 測定値を示し、右側の列は chl データを表します。生の画像が一番上に表示されます。レーザーによる蛍光応答は灰色で表示されます。赤色の領域は、標準顔料からの応答を示します。中央のセクションは、ターゲット顔料の空間分布を示しています。蛍光信号のスペクトル特性は、下部画像に表示されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

細菌マットの生産性に及ぼすレーザー励起の影響
レーザーのパワーや露光時間を増やすと、原発的な生産性も細菌の生産性も影響を受けませんでした(図11)。パワーの増加によるレーザー処理では有意な差は検出されなかった。

図11:スヴァールバルからのサンプルの生産性測定細菌マットは、様々なレーザー強度と露光時間の緑と青のレーザーで露出しました。データは、レーザー波長源(緑と青)に従って着色されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

著者たちは何も開示する必要はない。