方法論記事

窒化ケイ素膜上の細胞培養とシンクロトロンX線蛍光ナノ分析のための凍結製剤

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DOI:

10.3791/60461

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2019年12月10日

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1Inserm, UA7, Synchrotron Radiation for Biomedicine (STROBE), Université Grenoble Alpes, 2ID16A Beamline, ESRF, The European Synchrotron

この記事について

サマリー

ここで提示するプロトコルは、窒化ケイ素膜上での細胞培養およびX線蛍光イメージング前の突起凍結のためのプロトコルであり、シンクロトロン極低温X線ナノプローブを用いた。室温ナノ分析のみが提供される場合、凍結試料をさらに凍結乾燥させることができる。これらは、細胞内元素組成物に関する情報を得るための重要なステップである。

要約

細胞下レベルでの金属イオンの分布についてはほとんど知られていない。しかし、これらの化学元素は必須の調節機能を有し、その乱れた恒常性は様々な疾患に関与している。最先端のシンクロトロン蛍光X線蛍光ナノプローブは、細胞全体の2次元(2D)および3次元(3D)分布と濃度を解明するために必要な感度と空間分解能を提供します。オルガネラレベル。これは、細胞の物理病理学における金属の役割に関する調査の新しいエキサイティングな科学的分野を開きます。細胞製剤は、特に基本的な分析のために、重要でしばしば複雑な手順です。蛍光X線技術が普及し、様々な調製方法が用いられているが、細胞の元素含有量の保全をせいぜい調査した研究は非常に少なく、凍結製剤に関する段階的に詳細なプロトコルはない。蛍光ナノプローブのX線系外細胞はこれまでに放出されている。これは、極低温環境および転写が可能な場合に凍結水和状態の細胞のシンクロトロンX線蛍光ナノ分析を可能にする、高速凍結のための段階的な細胞製剤を提供するプロトコルの説明である。ナノ分析を室温で行う必要がある場合には、凍結乾燥付着細胞製剤を凍結乾燥するための追加手順が提供される。提案されたプロトコルは、乳癌細胞における有機金属化合物の2Dおよび3D細胞内分布の研究において、以前の研究で成功を上げている。

概要

新設計の蛍光X線X線(SR-XRF)ナノプローブは、完全に定量的な方法で元素の細胞内分布を可視化することを可能にします。一例として、この分析能力は、オスミウム系錯体2のようなナノ粒子1または有機金属分子の取り込みの調査を可能にし、強力な抗癌特性を有する金属系分子の細胞内取り込みに関する洞察を提供する。多元素技術として、ナノプローブを用いたSR-XRF3は、リン、硫黄、カリウム、カルシウム、鉄、銅、亜鉛などの細胞内で最も重要な元素を同時に定量および局在化する方法を提供します。確かに、硬いX線を使用すると、凍結した水和細胞全体をラベルフリーで画像化するための大きな浸透深さを提供します。さらに、目的とするほとんどの要素のKエッジへのアクセスを提供し、蛍光X線は最も効率的に励起される。極低温アプローチの使用は、放射線損傷の減少および細胞構造および元素分布の保存の最適化を可能にする。

細胞内の金属を研究するために利用可能な空間的に解決された分析技術のほとんどは、生成される細胞の非常に薄く平らなセクションを必要とする表面技術です。主に、エネルギー分散型X線分析(STEM-EDX)、エネルギー濾過透過型電子顕微鏡(EF-TEM)、ナノスケール二次イオン質量分析(nanoSIMS)を用いた走査透過型電子顕微鏡を含みます。後者は凍結した水和細胞切片では行えませんが、クライオ分析は卓越した空間分解能を持つ電子顕微鏡で行うことができますが、元素感度は低いです。粒子誘起X線放射(PIXE)は、全細胞における元素分布の研究を可能にした。ミクロンスケールでもサブミクロン分解能4でも、実質的な元素感度で完全に定量できるという利点がありますが、凍結水和細胞を研究する放射線損傷や極低温能力の欠如に苦しんでいます。これらの分析技術はすべて、細胞の元素イメージングにおいて互いに補完するが、すべての技術において、サンプル調製手順は重要なステップである。有意義な結果を得るためには、可能な汚染だけでなく、元素の再分配や漏出を制限するのは簡単にする必要があります。電子顕微鏡で実証されているように、細胞の凍結固定化およびクライオスキャン段階への凍結移動を含む極低温ワークフローは、天然状態5、6、7、8、9、10に可能な限り近い細胞内レベルで最適な元素保存を可能にする。この理解は、2Dまたは3Dで凍結水和細胞全体の超構造イメージングを生成するために、シンクロトロン凍結ソフトX線顕微鏡(例えば、完全な視野顕微鏡および走査顕微鏡)の開発に正常に実装されています。ローレンス・バークレー国立研究所12の先端光源のビームライン2.1(XM-2)、電子貯蔵リングBESSY II(ドイツ)13、アルバ光源(スペイン)14のビームラインMISTRAL、およびダイヤモンド光源15のビームラインB24で、様々な極低温ワークフローが開発されました。同様のワークフローは、最近、X線マイクロプローブ16、17を用いた細胞内元素分析のための最も信頼性の高い調製および保存方法であることが示された。

X線ナノプローブ技術は細胞元素解析に広く用いられ始めていますが、特に極低温SR-XRF機能の出現により、これまで研究コミュニティに段階的なプロトコルが普及していることは一切ありません。ここでは、極低温条件下で分析する窒化ケイ素膜上に単層として培養した凍結付付付着細胞を調製するための詳細な手順を提供する。X線分析を室温で行わなければならない場合にプロトコルの後に適用される凍結乾燥工程も提供される。提案されたプロトコルはヒト乳癌細胞MD-MB-2312で正常に使用され、凍結乾燥はマウスニューロン18、20、21上で他の間で実証されたが、様々なタイプのヒトまたは動物細胞に容易に拡張することができる。

プロトコル

実験手順は、CEAのライフサイエンス部門(CETEA、A14-006)の動物ケア委員会によって承認されました。彼らは1986年11月24日のフランスの法律と欧州共同体理事会指令(86/609/EEC)に従って実施されました。

1. 窒化ケイ素(Si3N4)膜支持準備

注:膜は壊れやすく繊細なので、その支持(200μm厚いシリコンフレーム)は、理想的には薄いカーボンピンセットまたはデュモンピンセット#5、ストレート自己閉鎖細かい先端で、穏やかに扱う必要があります。このプロトコルは、5 mm x 5 mm のフレームと 1.5 mm x 1.5 mm の膜サイズを持つ窒化ケイ素膜を使用しました。膜は、実験を開始する前に約12時間(すなわち、細胞播種)を調製する必要があります。膜は、一日の終わりに調製することができ、彼らは翌朝を使用する準備ができているので、クラスII層流フードの下で一晩乾燥を残すことができます。シリコンフレームの厚さ200μmは、窒化ケイ素窓を販売するほとんどの企業に標準装備されています。このプロトコルで使用される製品が利用できない場合、0.5-1.5 mmの範囲の膜サイズは5 mm x 5 mmの標準フレームサイズで使用できます。X線断層撮影を使用する場合は、より大きな膜サイズが好ましい。膜サイズ0.5mm、厚さ50nmのTEMグリッド型窒化ケイ素窓も使用できます。

  1. Si3N4膜支持体を含むカプセルを開きます(図1)。サポートを軽く緩めるためにカプセルを軽く絞ります。
  2. 薄いピンセットを使用して、シリコンフレームの角の1つを保持します。中央のSi3N4膜に触れないように注意してください。200または500 nmの厚い膜は容易に損傷を受けることができる。
  3. 薄いピンセットを使用して、Si3N4膜支持を無菌ガラスペトリ皿に穏やかに置き、シリコン窒化物窓の平らな表面(すなわち、皿の底に面している空洞)を向きます。
  4. ペトリ皿のふたを取り外し、膜を層流キャビネットの下に25~30分間UV光の下に置きます。
    注: UVC ライト(254 nm)は通常 200 μW/cm2に設定されます。
  5. 膜にポリL-リジンを10μL入れます。ドロップは、Si3N4膜をよくカバーする必要があり、シリコンフレーム上に少し広がることができます。標準的な組織培養インキュベーターで相対湿度100%、空気95%、CO2で25分間37°Cにしておきます。
    注:この場合、MDA-MB-231乳癌細胞にポリL-リジンコーティングを用いた。細胞株の種類に応じて、様々なコーティングを使用することができ、このステップはそれに応じて最適化する必要があります。
  6. 滅菌48ウェルプレートで、0.22μmの滅菌フィルターで濾過された超純粋および超微量水の200-250°Lで異なる井戸を充填します。通常、各ウェルは、最大2−3の膜をすすぐために使用することができます。微細ピンセットを使用して、シリコンフレームの隅で膜サポートをピックアップします。3つの連続した井戸に垂直10sを浸して膜を穏やかに洗い流す。
    注:膜サポートはインキュベーターから取り出され、クラスII層流フードによって定義される温度および湿度と室温で処理することができる。
  7. 無菌96ウェルプレートの空の井戸に膜支持体を垂直に入れ、それを覆い、クラスIIの層流フードの下で一晩乾燥させます。

2. 細胞播種

  1. 滅菌4ウェルプレートに、膜を平らな側面を上に向けて置きます。
  2. MDA-MB-231細胞は、フェノールレッド/グルタマックスIを用いてDMEMの単層培養中に維持され、5%CO2空気加湿インキュベーターで10%胎児子牛血清と1%ペニシリンおよびストレプトマイシンを37°Cで補充した。
  3. 細胞が60−70%の合流性に達したら、皿またはフラスコからメディアを取り除きます。
  4. Ca2+またはMg2+なしでダルベッコのリン酸緩衝生理食塩分10mlで1xを洗浄します。
  5. 0.05%トリプシン/EDTA溶液の3 mL/T75フラスコを追加し、単層全体がトリプシン溶液で覆われていることを確認します。
  6. 細胞が剥離し始めるまで37°Cで3−5分間インキュベートする。細胞を過度にトリプシン化せず、細胞を早期に剥離させないように注意する必要があります。
  7. 10%胎児の子牛血清と1%ペニシリンとストレプトマイシンまたは完全な媒体を補充したDMEMの8mlを追加し、ピペットによって細胞を収集します。メディア内の血清はトリプシンを中和します。
  8. 室温で250 x gで3分間スピンダウンします。上清を吸引する。
  9. 細胞ペレットを含む15mlチューブに8mlの新鮮な完全な媒体を加え、細胞が単一の細胞懸濁液に分散するまで細胞を上下にパイプします。
  10. 完全な媒体でヘモサイトメーターを使用して細胞をカウントし、完全な媒体でmLあたり5 x 106細胞の濃度に希釈する(0.85%の胎児子牛血清および1%ペニシリンおよびストレプトマイシンを補充した0.85%NaCl溶液中の200mM L-アラニル-L-グルタミンジペプチドのフェノールレッド/1%のDMEM)。
  11. MDA-MB-231細胞懸濁液の10°Lを取り、膜に付着します。これは MDA-MB-231 の場合、50,000 セル/10 μL に相当します。ドロップは、Si3N4膜をよくカバーする必要があり、シリコンフレームに少し広がることができます。マイクロピペットの先端でSi3N4膜に触れないように注意してください。
    注:細胞株の種類や実験や測定値に応じて、細胞密度が異なる場合があり、それに応じてテストする必要があります。ここで、Si3N4膜を播種するための細胞密度の提案は、MDA-MB-231細胞2の実験条件及びさらにSR-XRFナノ分析に最適であることがわかった。
  12. 海馬ニューロン(HN)の場合、胚発生日18.5マウスから海馬脳組織を除去し、ヘペスHBSS(5.3 mM KCl、 0.44 mM KH2PO4, 137.9 mM NaCl, 0.34 mM NaH2PO4, 5.56 mM グルコース) 37 °C で 15 分18,19.
  13. P1000チップとP200チップを備えたP1000ピペットを使用し、ピペットで円錐内容を数回描画して放出することにより、機械的解離を行います。このステップでは、気泡はニューロンに有毒であるため、媒体中に気泡を作成しないように注意してください。
  14. 骨材がチューブの底に落ち着くまで数分待ちます。
  15. 分散した細胞を含む上清を滅菌エッペンドルフ管に移す。凝集体を含む培養培地の~25°Lを残す。
  16. 解光した細胞をヘモサイトメーターで数えます。単離されたHNニューロンは、ポリL-リジン(1mg/mLポリ-L-リジン)コーティングされた窒化ケイ素膜上に7 x 104細胞cm-2の濃度でめっきされる。
  17. HNを有する膜に対してのみ、10%の胎児ウシ血清を補充した最初のDMEMでニューロンをインキュベートする。DMEMでHNをめっきした後1時間、培地は神経基底めっき培地(0.85%NaCl溶液中で200mM L-アラニル-L-グルタミンジペプチド、およびB27サプリメントd=1/50をニューロバサルで希釈)18、19に変更する。
  18. MDA-MB-231細胞の場合、膜支持体をインキュベーター(相対湿度100%、空気95%、CO25%)で37°Cに25分間入れます。これにより、細胞が沈着し、基板に付着し始める。これは、使用する細胞株に応じて適応され得る。
  19. 必要な完全培養培地の1 mLを追加する(フェノールレッド/1%の200 mM L-アラニル-L-グルタミンジペプチドを10%胎児で補充したNaCl溶液中のDMEM 子牛血清および1%ペニシリンおよびストレプトマイシン)は、プラスチックウェルの壁にピペット先端を置き、膜を覆っている間に媒体を非常にゆっくりと放出することによって、MDA-MB-231細胞の各ウェルに。
  20. 膜を4ウェルプレートの壁に垂直に置き、Si3N4膜の井戸腔に閉じ込められた気泡を取り除きます(図2)。これを行うには、細かいピンセットを使用し、非常に穏やかに泡を押し出し、膜に触れたり損傷を与えたりしないように、Si3N4の裏面フレームに平行に移動します。
  21. 膜をウェルの底部に水平に戻し、使用する細胞株の増殖速度に応じて必要な時間、4ウェルプレートをインキュベーターに残します。MDA-MB-231細胞を一晩インキュベートした。

3. 治療または中程度の変化

  1. 4ウェルプレートから培地を取り出します。
  2. 37°Cで1mLのPBS溶液で1回すすす。PBSを廃棄し、1 mLピペットチップを使用して所望の処理の存在または不在(コントロール)で温めた完全な新鮮な媒体の1 mLを追加し、井戸プレートの壁に対して非常にゆっくりと液体を放出します。Si3N4膜は、膜の動きや持ち上げを避けるために、妨害なくゆっくりと水没する必要があります。

4. 突発凍結による細胞製剤のクライオ固定化

注:必要なインキュベーション時間の終わりに、治療の有無において、細胞は慎重にすすり、凍結されなければならない。約30分前に、プランジ凍結の前に細胞製剤をすすいでブロットし、最初にセットアップし、自動プランジマシンを冷却します。極低温を操作する場合は、適切な極低温手袋、安全メガネ、クローズドシューズ、実験室コートの使用が必要です。液体窒素は適切なDewarsで輸送する必要があり、作業場所は酸素モニターの存在と十分に換気する必要があります。理想的には、20−30%の低湿度レベルは、サンプル(すなわち、非晶質氷層)のガラス化に有害である材料、デューワーズ、および凍結原の氷汚染を制限するのに役立ちます。理想的には、研究者の経験レベルに応じて、1つのセッションで最大10−12サンプルを、同じ二次クライオゲン液体エタンカップを使用して調製することができます。セッション間では、自動プランジ冷凍庫には1時間の自動ベークアウト手順が必要です。理想的には、サンプルは同一のインキュベーション条件で処理する必要があります。それでも、コントロールは最初に処理でき、その後に特定の治療条件を持つサンプルが続きます。

注: プランジフリーズの場合、次の手順は MDA-MB-231 または HN セルの両方に適用されます。

  1. 細胞の急速な凍結のためにクライオプランジャーを設定します。
    1. 自動プランジ冷凍庫をオンにします。
    2. パラメータ(温度、湿度パーセント、自動ブロッティングを使用する場合はブロッティング時間、極低温容器への転送を容易にするためにサンプルをクライオゲンの表面に持ち上げる位置など)をコンソールとパラメータから直接入力します。設定メニュー。本例では、湿度室のパラメータを37°C及び湿度80%に設定した。
      注:迅速かつ慎重な手動ブロッティングを使用して、このプロトコルとX線イメージングのためにより良いガラス化結果が得られました。したがって、プロトコルは自動ブロッティングシーケンスプログラムを使用しません。
    3. 加湿器室を取り付け、湿度を保つために、まず60mLの二重蒸留水を使用してそれを満たし、次に自動プランジ冷凍庫コンソールで求めのある20 mLを使用します。
      メモ:気化器システムに損傷を与える可能性があるため、超純水の使用は避けてください。バルブを閉じ、加湿器の裏側にチューブを取り付けたままにします。
    4. 黒いエタンカップをホルダーに取り付け、プラスチックキャップで覆います。
    5. LN2で冷たい部屋のデュワーを埋め、作業領域内のグリッドのレベルにそれを持って来ます。
    6. EM-GP作業領域の専用の場所に保持され、エタンカップホルダーの近くに保持された転写容器に凍結後に膜を格納するために専用のクライオボックスを置きます。
      注:専用のクライオボックスは、グルノーブルのヨーロッパ放射光のナノプローブビームラインID16Aでの社内開発です。仕様の図面は、ご要望に応じてご利用いただけます(図3)。それらはLN2デュワーの長期貯蔵のための50 mL円錐形の管で一度に4つ貯えることができる。別の可能性は、単一のSi3N4膜支持体を格納するためにドームキャップ付きの小さな0.2 mL規則的なPCR薄い壁管を使用することである。LN 2がチューブを充填できるようにするには、加熱された注射針を使用して壁管の上部に〜2mmの穴を開ける必要があります。
    7. 転写容器にLN2を充填し、専用のアルミ蓋で覆います。コンソールの LN2レベルモニタディスプレイを 100% に保つ LN2 (通常は ~2 L が必要) でコールドチャンバーを埋め続けます。最終的に必要な温度に達するまで待ちます。
    8. プラスチックキャップを取り外し、エタンボトルに接続された液化剤でエタンカップを覆います。エタンカップの温度が温度設定値に平衡化するまで待ちます。到達したら、二次凍結ゲン(すなわち、液化エタン)の使用を開始する。
      注:使用したセットポイントは-180°Cで、エタン融点(-182.8°C)をわずかに上回った。それはエタンカップの霜の形成と汚染の源となり得るので、エタン液化剤を予冷する必要はありません。
    9. 高純度のエタンボトルメインバルブを開き、エタンのゆっくりとした霧が得られるまで圧力レギュレータを非常にゆっくりと開きます。液体エタンが蓄積するまで、この非常に低い流れを保ちます。カップを上端までいっぱいにします。圧力レギュレータとエタンボトルのメインバルブを閉じます。ライカ液化剤を慎重に取り外し、ヒュームフードの下の小さなポリスチレンサポートに置いておきます。作業領域とエタン容器の霜汚染を防ぐために、機械に付属の黒いポリスチレンキャップで作業領域を緩く覆っておいてください。
    10. サンプルの手動ブロッティングの直前に、黒いポリスチレンキャップを取り外し、コンソールプレス「下房」のメニューから、極低温の作業領域に接触して環境室をもたらします。
  2. サンプルをブロットする準備をします。
    1. 培養培地から塩の痕跡を除去するのに十分な緩衝液を準備します。このプロトコルには、酢酸アンモニウム緩衝液をMDA-MB-231細胞のリンスに用いた。
      注:酢酸アンモニウム緩衝液は、ほとんどの細胞タイプに適しており、蛍光X線信号には添加しません(Z>9の元素を考慮)。神経細胞のようないくつかの特定の細胞株は、専用の緩衝液の使用を必要とし得る。例えば、一次皮質ニューロンの場合、0.5MNa2HPO4の1.8体積および0.5M NaH2PO4の1.9体積からなる生理線溶液を15個使用することができる。一方、緩衝液に含まれるリンまたは塩素は、XRFスペクトルに寄与する。スプリアスX線放出ラインのこの制限は、検出される対象の要素に応じて留意する必要があります。
    2. 酢酸アンモニウム超純度溶液から150mMの酢酸アンモニウム溶液を調製し、pH(7.0~7.3)と浸透圧(270~300mM/kg)を確認
      注:上記の浸透圧は、カルシウムとマグネシウムを含まないダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(D-PBS)に相当し、マイクロオストメータを使用して確認することができます。
    3. 酢酸アンモニウムバッファーで12ウェルプラスチックプレートから必要な数の井戸を記入してください。
    4. プレカット穴が付いた1番フィルターペーパーから、または15mmの中央穴を持つ直径55mmの手動パンチングフィルターペーパーから、ブロッティング用の4分の1のフィルターペーパーをカットします。
    5. リンスし、膜を突っ込む前に、最後の瞬間に37°Cでインキュベーターに保存された必要なサンプルを取り出します。
    6. クイックリリース鉗子(通常はデュモンクランプリング高精度医療ピンセット)の黒クランプリングを使用してピンセットのロックを解除し、培養からSi3N4膜サポートをつかみます。
      メモ:シリコンフレームの中央をつかみ、ピンセットの先端を膜の近くに保ちます。黒いクランプリングを最初のストライプに下に移動して、ピンセットをロックします。
    7. Si3N4膜支持体を酢酸アンモニウム緩衝液に垂直に浸漬し、37°Cで~5sに保たれます。
      注: サポートはバッファ内で垂直のままにする必要があります。なお、プレートの各ウェルにおける緩衝液は、同じインキュベーション条件に対して最大3つの膜に使用することができる。
    8. フィルターペーパーで手動でブロットし、膜リンジング溶液(図4)から余分な緩衝液を排出し、細胞を覆う酢酸アンモニウム水溶液の薄く均質な層を残すために。
      メモ:これを行うには、まず窓の裏側を濾紙に押して、井戸と背面に残っているほぼすべての水性緩衝液を取り除きます。次に、ピンセットの両側から始めて前面をブロットし、次にフレームの両側をブロットします(図4)。膜に触れないでください。排水されたバッファの過剰は、濾紙上に形成されたアウレオールで監視することができる。
    9. 環境室のドアを開き、ピンセットを素早く取り付け、鉗子のインターロックにスライドさせ、ドアを閉じます(図5)。
    10. 「ブロット/Aプランジ」を押してください。Si3N4膜を保持するピンセットは、すぐに凍結原に突っ込みます。
    11. 予冷鉗子で搬送容器のふたを取り外します。
    12. 「転送」を押します。Si3N4膜は、凍結原の上にわずかに上に移動します。
    13. 単一のクイックムーブメントでは、鉗子のインターロックからそれらをスライドさせてピンセットを取り外し、インターロックからわずかに傾けて、LN2で満たされた転送コンテナ内のクライオボックスの空のスロットに直接持ち込みます。黒いクランプリングを放して膜を解放します(図5)。
      注 : 転送コンテナは常に LN2で覆う必要があります。補充が必要な場合は、LN2とエタンの混合を避けるために、機械に付属のプラスチック蓋でエタンカップを覆います。
    14. 転写容器を蓋で覆い、LN2で満たされた小さな白いポリスチレンカップを使用して、LN2で満たされたポリスチレンボックスに移します。
      注:膜を含むクライオボックスまたはチューブは、LN2で満たされた50 mL円錐形チューブに保存し、長期保存LN2デュワーに移すことができます。次のサンプルを凍結し始める前に、氷の結晶との汚染を避けるために、ヘアドライヤーまたはホットプレート/クライオツールドライヤー(45°)ですべての冷たく曇ったピンセットを温めます。

5. 窒化ケイ素膜上で培養したプランジ凍結細胞の凍結乾燥

メモ:凍結乾燥の場合、MDA-MB-231細胞とHN細胞の両方に以下の手順が適用されます。凍結乾燥機を冷却するには、約40分から1時間待つ必要があります。

  1. 凍結乾燥機の設定
    1. 機器の背面パネルにあるロッカースイッチで電源を入れたり、電源を入れたりつきます。
    2. LCDメニューに続くパラメータの入力を開始します: セグメント 1 = -120 °C で 2 h;セグメント 2 = -120 °C から -80 °C までの 2 h ランプ;セグメント 3 = -80 °C で 2 時間;セグメント 4 = -80 °C から 50 °C までの 2 h ランプ;セグメント 5 = -50 °C で 2 時間;セグメント 6 = -50 °C から 30 °C までの 6 h ランプ。
    3. パラメータの設定の最後に、設定を保存し、チャンバーのふたを閉じて"START"を押します。
    4. 単位は1.10-5 mbarまでポンプでくみ上げる。この圧力に達すると、ディスプレイのコマンドラインに「今すぐ冷却を開始し、START」と表示されます。
    5. 液体窒素デュワーを定期的に充填し、温度トリプルポイント設定以下のステージを冷却します。
      メモ:ステージトリプルポイント温度は-140°Cに設定されています。このプロトコルのサンプルをロードする前に、約1時間と-160°Cの温度段階を待つのが最善です。
    6. "読み込みサンプル" の準備ができたら、"ENTERキーを押す" と表示されます。
    7. LN2充填ポリスチレンデュワー内の液体窒素温度、サプライヤーが提供するサンプル転写ホルダー、および2つの追加真鍮円筒形Si3N4膜ホルダーに冷却します。
    8. ポリスチレンデュワーのサプライヤーが提供するサンプル転写ホルダーの上にSi3N4膜真鍮ホルダーを取り付けます(図6A)。LN2のレベルを最初の真鍮片の上端より約1−2mm下に保ちます。
    9. イノックスまたはテフロンコーティングされた予冷された自己閉鎖ピンセットを使用して、クライオボックスまたはPCRチューブからSi3N4膜サンプルサポートをピックアップします。
    10. 真鍮ホルダー番号の空洞に上を向いた細胞サンプル側で膜を堆積させます。
    11. 2枚目の真鍮片をふたとしてアセンブリを覆います(図6C)。
      注:厚さ5mm、直径50mm、直径11mmの中央11mmの穴を持つ2枚の真鍮ディスクを設計しました。最初の真鍮ディスクはサポート(5 mm x 5 mm)を収容するために14機械化された長方形(8 mm x 6 mm)の位置を有する。各スロットは平らで、2 mmの深さでよく磨かれています。2番目の真鍮ディスクはSi3N4膜真鍮サポートをカバーするために平らであり、コールドトラップエンクロージャとして機能する。
    12. LN2充填ポリスチレンフォームボックスの転写ロッドを予冷し、それを使用して完全なアセンブリにロックします(図6D,E)。
    13. 凍結乾燥機の前面パネルにある「ENTER」を押します。
    14. ターボおよび回転ポンプは停止し、チャンバーは部屋のふたを開くことを可能にするために乾燥した窒素ガスで部屋をパージする。
    15. すぐにスプリングロードされたトランスファーロッドでサンプル転写アセンブリを凍結乾燥機室に移し、銅LN2コールドステージでクリップします。
      メモ:転写ロッドを持つ完全なアセンブリをチャンバーに残します。
    16. すぐに凍結乾燥室のふたを閉じ、「START」を押して凍結乾燥サイクルを続行します。
    17. 凍結乾燥機のLN2貯蔵所を2時間ごとに手動で満タンにします。
      メモ:自動LN2充填システムは、この貯蔵所に接続されている場合があります。
    18. 凍結乾燥サイクルの終了時に、STOPを押してチャンバーを通し、完全なアセンブリを取り外して凍結乾燥サンプルにアクセスします。

結果

ポリL-リジン被覆Si3N4膜支持体にサブ培養した凍結水和MDA-MB-231細胞の典型的な光学ビデオ顕微鏡図を図7Aに示す。真空チャンバ内の試料の光学図は、ESRF22のID16Aビームラインの専用オンラインビデオ顕微鏡を用いて反射モードで得られた。電子または軟X線顕微鏡検査では、細胞を埋め込んだ氷層ができるだけ薄くなる必要がありますが(通常は<0.5μm)、硬質X線(>10 keV)は、はるかに高い浸透深さと低用量堆積の利点を有します。したがって、氷の厚さは、セルを埋め込む氷の厚さが数μmになるように、通常はセルを含む<10 μmより大きくなる可能性があります。これは、500nm厚のSi3N4膜の吸収を考慮して、試料を含まない強度と比較して透過中の測定されたX線強度を介して推定することができる。この氷の厚さは、本プロトコルに記載されているように手動ブロッティングによって達成することができる。ニュートンリング領域では、氷の厚さはさらに薄くすることができます(測定されません)。

凍結水和細胞のX線蛍光元素マッピングは、カリウム(K)、硫黄(S)、亜鉛(Zn)などの生理要素の代表的な分布を用いて図7Bに示す。これらのマップは、元素の実質量(すなわち、元素投影質量)を表します。本場合には行われていないが、このような地図は、試料投影質量23の推定を提供するX線伝播ベースの位相コントラストイメージングを通じて正規化することができる。多くの研究によって報告されるように、その近いネイティブ状態で保存された細胞における高度に拡散性の高いKイオンは、細胞23、24、16全体に均一に分布していると仮定された。図7Bの2DX線蛍光元素画像に示すように、密結合元素Sは、Kと同様に細胞内に均等に分布し、細胞質量プロファイルの良好な推定値を表す。Zn分布は、細胞質よりも核内の方が高いシグナルを有し、核を明確に概説した。なお、小さなZn濃縮領域は、核領域の空間分解能(50nm)で検出することができる。

既存のX線ナノプローブや構築されるものは、必ずしも極低温能力に対応できるとは限りません。この場合、サブ100nm空間分解能で細胞のX線蛍光画像を得るための最良の代替手段は、細胞の突入凍結後にこのプロトコルに記載の凍結乾燥手順を実行することです。図8Aは、Si3N4膜上で直接培養された結果の凍結乾燥一次マウス海馬ニューロンの典型的な明視野顕微鏡図を示す。この場合、清潔な乾燥チャンバーに保存する場合、サンプルは1-2週間前に調製し、目的の領域の登録のための通常の直立光学顕微鏡で観察することができる。凍結乾燥サンプルによって捕捉され、X線ナノビームの下で損傷を引き起こす可能性があるため、周囲の湿度にさらされるのを防ぐため、注意が必要です。この手順は、非常に敏感な細胞(すなわち、神経細胞)に正常に適用され、癌細胞のような他のより堅牢なタイプの細胞でさらに良い結果が得られた。突発凍結細胞に関しては、凍結乾燥細胞ディスプレイ全体におけるK、S、Znの蛍光X線画像は、上述のものと同様である。これらは、50-100 nmの空間分解能で様々なタイプの凍結乾燥セルに見られる元素分布を表します。全細胞の凍結乾燥は元素の完全性を保つための代替手段であるが、細胞形態16、特に細胞膜の完全な保存を犠牲にしている。

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図1:蛍光X線ナノ分析のための典型的なサンプルサポート保護カプセル内のSi3N4膜支持。このタイプの基板は、室温分析(プランジ凍結セルラー調製後に低温および低真空凍結乾燥プロセス)または極低温蛍光分析に使用できます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:細胞播種後の窒化ケイ素窓の概略図細胞は、Si3N4膜支持体のポリ-L-リジン被覆平坦面上に直接培養される。時には気泡は、Si3N4膜支持の裏側の空洞に閉じ込められ、プロトコルに記載されているように除去されなければならない。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:液体窒素デュワーにおけるプランジ凍結Si3N4膜支持の長期保存のための3Dプリントクライオボックスを自社開発。(A)クライボックスは、コンテナとキャップ(下部)と(B)ロックされたキャップ付きの組み立てられたクライオボックスで分解しました。キャップはピンセットで操作でき、回転によって開いたりロックしたりすることができます。ESRF ID16Aからのご要望に応じて、3Dプリンティングの詳細なプランをご覧いただけます。設計は窒化されたシリコンTEMの格子を収容するためになされた。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:Si3N4で培養した細胞のブロッティング。 Si3N4膜上に培養した細胞単層を突っ込んで凍結する前に、酢酸アンモニウム溶液(A)でリンスし、濾紙(B)を用いて慎重に手動でブロットする必要があります。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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図5:自動突入凍結EM-GPマシン(A) 自動プランジ冷凍庫。(B) ピンセットがロックされた環境室 (C) エタンボトルに接続されたライカ液化剤で覆われたエタンカップ。(D)液化エタンの完全な黒いカップと、ガラス化されたSi3N4膜のLN2にさらなる貯蔵のためのクライオボックスを示すプランジ凍結エンクロージャ。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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図6:凍結乾燥手順のためのサンプル凍結転写アセンブリ。(A)Si3N4膜の最初の真鍮受領者は、凍結乾燥機サプライヤーによって提供されるサンプル転写ホルダーの上に取り付けられる。(B) および (C) は、2 枚目のフラット ブラス ディスクがカバーとして使用され、凍結乾燥機の真空エンクロージャに挿入されるコールド トラップ エンクロージャとして機能することを示します。(D) バネ付きトランスファーロッドを備えたフルアセンブリ。(E)Si3N4膜上で成長したガラス化細胞製剤を担持する試料ホルダーは、さらにLN2-冷却凍結乾燥機に挿入されなければならない。アセンブリを取り付けるためのすべてのステップは、発泡スチロールボックスのLN2で行われます。わかりやすくするために、すべての画像はLN2の不在で生成されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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図7:硬いX線ナノプローブを用いた凍結水和細胞のクライオX線蛍光画像。(A)ESRF ID16Aビームラインの専用光学ビデオ顕微鏡を用いた反射モードでの典型的なオンラインビュー。手動ブロッティング後、約5〜10μmの総氷厚が達成され、凍結した水和細胞の明確な視界が可能となった。ニュートンリングが非常に薄い氷を示す領域が顕著です。(B)代表的なクライオX線蛍光細胞分布は、生理学的元素カリウム(K)、硫黄(S)、亜鉛(Zn)である。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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図8:硬いX線ナノプローブを用いた凍結乾燥神経細胞の蛍光X線画像。(A)結果として生じる凍結乾燥原発皮質神経細胞の典型的な明視野顕微鏡図をSi3N4膜上に直接培養した。スケールバー=200μm(B)代表的な室温X線画像は、単一の凍結乾燥海馬ニューロンの蛍光画像、生理学的元素カリウム(K)、硫黄(S)、および亜鉛(Zn)の分布を示す。スケール バー = 2 μm.ここをクリックすると、この図の大きなバージョンが表示されます。

ディスカッション

クライオ電子顕微鏡(cryo-EM)は、2017年ノーベル化学賞を受賞し、溶液25における生体分子の高分解能構造決定のための生体材料のガラス化に関してJ.デュボシェが行った開発を行った。デュボシェがノーベル講演で報告したように、「水滴を生き生きとさせる方法を知ることは別のことだ」25.凍結製剤ステップは、放射線量の損傷を軽減し、彼らの母国に近い細胞を研究するための標準的な技術と考えられています。しかし、準備は退屈なままです。これは、電子顕微鏡は、その卓越した空間分解能のために、サンプル調製中に発生する任意の超構造アーティファクトに敏感であるためです。シンクロトロン・クライオナノプローブは現在、高エネルギーX線範囲26で13nmの低い空間分解能に下がる同様の困難に近づいている。ハードX線顕微鏡は細胞全体を分析できる一方、電子顕微鏡は電子の浸透深さが悪く、非常に薄い細胞スライスしか観察できない。

細胞の単層は、液体エタン中の突っ込み凍結によって、水ガラス化に必要な冷却速度が達成されるように十分に薄い。理論的には、108 K/sの高い冷却速度は、急激な凍結のためにあまりにも厚い標本のガラス化を可能にする高圧凍結27を使用して可能です。周囲圧力28で試料の完全なガラス化を可能にするために必要な105K/sの冷却速度は、ここで提示される自動プランジ凍結機およびパラメータを使用して再現的に到達する。これにより、研究者は、液体エタン中の突っ込み凍結によって、細胞12、13、14、15、29、30などの薄い生体標本(<10μm)を活性化することができます。

このプロトコルの重要な課題は、細胞内の化学的完全性を可能な限り維持し、2Dまたは3Dの細胞内の信頼性の高い元素分布を提供することです。他の場所で公開されているように2,16,17,31,細胞下レベルでの元素イメージングの場合, 凍結水和細胞の分析を考慮する必要があります。.それ以外の場合は、細胞のプランジ凍結と凍結乾燥の組み合わせを室温分析に使用できます。後者の場合、アモルファス氷は昇華の過程を通じて除去され、結合した水分子は脱着の過程を通じて除去される。このプロセスは、細胞膜の可能な変化およびいくつかの細胞内構造32の形態に起因する凍結水和試料と比較して理想的ではないかもしれない。また、種分化研究のために、水抽出は金属種分化アーティファクトにつながる可能性がある。それでも、サブ100nmレベル2、16、17、18、20、33、34、35、36での元素イメージングのための凍結水和サンプルに代わる最良の代替手段として成功している。

37と報告されているように、凍結保存細胞製剤の品質は、カリウム対ナトリウムK/Na比を介して評価することができる。残念ながら、元素のX線蛍光光光子(E≥1.3 keVマグネシウム)の検出に使用されるシリコンドリフト検出器のエネルギー遮断が低いため、ここで使用される硬いX線ナノプローブでは未だ決定できません。実際、TOF-SIMS、EPMA、または核マイクロプローブPIXE16、37を用いて測定できる高いK/Na比(>10)は、生細胞37における期待されるK/Na25と比較して細胞の保存された化学的完全性を示す。これは、付随する低 Cl/K比38によってサポートできます。それでも、不完全なガラス化は、特にサンプル冷却の速度が低すぎる場合、細胞膜やオルガネラに損傷を与える大きな氷結晶の形成につながり、その結果、化学元素の分布を変化させる可能性がある。この潜在的な損傷と細胞内分布への影響を監視する日常的な手順はありませんが、上記の元素比とX線相コントラストまたはクライオソフトX線顕微鏡を用いて細胞を高解像度で画像化する可能性は、要素完全性の併用を伴う細胞内コンパートメントの良好な保存をサポートするための最良のアプローチであり得る。これらの技術と新たに開発されたクライオカ相対蛍光光学顕微鏡の使用の組み合わせは、この損傷がどの程度発生し、細胞内元素分布に影響を与えるかを評価するのに役立ちます。

全体として、蛍光X線蛍光ナノ分析のための細胞サンプルを調製するための詳細かつ包括的なプロトコルが提示される。研究コミュニティにとって良い出発点であり、(クライオ)硬いX線ナノプローブで2Dおよび3D元素イメージングのための適切な細胞サンプルを調製する方法の難しい問題を解決するのに役立ちます。これらのアプローチは、細胞の詳細な相関化学的および構造イメージングのための光学蛍光および電子顕微鏡機能と融合することができる。

開示事項

著者は利害の対立を持っていない。

謝辞

ナノイメージングビームラインID16Aに関する実験は、ESRF提案LS2430、LS2303、およびLS2765のフレームで行った。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
酢酸アンモニウム溶液、BioUltra、分子生物学用、H2OSIGMA09691-250mL品位の酢酸アンモニウム粉末と超純水から必要な溶液を調製でき、pHと浸透圧はとにかく調整する必要があります。
B27 supplement, 50xLife Technologies, Invitrogen17504-044for hippocampal neuron culture
)リン酸緩衝生理食塩水、DPBS、([-] CaCl2、[-] MgCl2)GIBCO14190-094
Letter Red/Glutamax I (Medium ATCC modification)GIBCO21885025cell culture
Dulbecco'海馬ニューロン培養用31966-02Life Technologies,
Dumont Tweezers #5, Straight Self-closing, 0.05x0.01mm Tips, BiologyWorld Precision Instrument501202
Emitech K750X Peltier-Cooled EM Freeze DryerQuorum TechnologyEK3147
Ethane N45Air Liquidp0505s05r0a001C2H6 > 99,995 %
ウシ胎児血清、Performance Plus、認定ワンショットフォーマット、米国原産GIBCOA31604-02細胞培養
HBSS 10x海馬ニューロン培養用Invitrogen14185-052
カ GP クイックリリース鉗子ライカ16706435
MDA-MB-231 細胞株、上皮、ヒト腺癌乳がん細胞ATCC ATCCHTB-26細胞培養
Neurobasal mediumLife Technologies, Invitrogen21103-049for hippocampal neuron culture
Nunc 4-Well PlateThermo Fisher176740細胞培養
Osmo1 シングルサンプル マイクロ浸透圧計Advanced InstrumentsOsmo1Alternative は、Fisher scientific (Wescor Inc. VAPRO®蒸気圧浸透計)
ペニシリン-ストレプトマイシンSIGMAP4333細胞培養
ポリ-L-リジンSIGMAP4707膜上で培養する細胞の種類に依存する他のタイプのコーティングを使用でき、フィブロネクチン、コラーゲン、ポリオルニチンなどの他の接着因子をそれに応じて試験することができます。細胞は窒化ケイ素膜上で直接培養することができますが、窒化ケイ素膜はわずかに疎水性であり、膜が親水性(グロープラズマ放電)に処理されない限り、接着因子が推奨されます。
プランジ冷凍ロボット ライカEM GP本体ライカ16706401自動プランジャーの代替品は、Vitrobot Mark IV(FEI)、CryoPlunge 3(Gatan)、MS-002 Rapid Immersion Freezer(EMS)です。手動の自家製システムを使用することもできますが、環境制御されたチャンバーはプランジ冷凍の資産です。
窒化ケイ素膜(Si3N4)シルソン(株)SiRN-5.0(o)-200-1.5-500-NoHCl提案された窒化ケイ素膜タイプは、ID16A ESRF X線ナノプローブでの分析に最適化されており、膜の厚さ500 nmは、このプロトコルで詳述されている細胞操作および凍結固定に対してより堅牢であることが選択されました。厚さが200nm以下の膜も非常に壊れやすいものの使用でき、窒化ケイ素膜の他の設計は、SislonまたはNorcada、SPIサプライ、Ted Pella、EMS、LabTech、Neycoなどの他の会社から購入できます(たとえば、TEM互換膜...)。
トリパンブルー溶液0.4%GIBCO15250061細胞培養
トリプシン-EDTA、0.05%GIBCO25300-054細胞培養
超微量元素分析グレード、超純水フィッシャーケミカルW9-1MilliQ水を使用できますが、ICP-MS分析などを使用して微量元素レベルの汚染をテストする必要があります。
Whatman No. 1 濾紙 ライカ16706440代替濾紙は、外径55mmでなければならず、ライカの濾紙システム用パンチ(ref.16706443)が使用できます。
で~5M 高Dulbecco' (海馬ニューロン培養のための B27 サプリメント、50x Life Technologies、Invitrogen 17504-044Invitrogen Modified Eagle Medium (DMEM) Life Technologies、 ライズ

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