方法論記事

Tg(Vtg1:mcherry)ゼブラフィッシュ胚を用いて内分泌破壊化合物のエストロゲン効果を試験する

DOI：

10.3791/60462

⸱

2020年8月8日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Aquaculture, Institute of Aquaculture and Environmental Safety, Faculty of Agricultural and Environmental Sciences, Szent István University, 2Institute of Cancer and Genomic Sciences, College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここに、エストロゲンの効果を検出するためのゼブラフィッシュ胚Tg(vtg1:mCherry)を使用するための詳細なプロトコルが存在する。このプロトコルは、魚の伝播と胚の治療をカバーし、内分泌破壊化合物(EDC)によって誘導される蛍光シグナルの検出、ドキュメンテーション、および評価を強調しています。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

環境中に多くの内分泌破壊化合物 (EDC) があります, 特にエストロゲン物質.これらの物質の検出は、その化学的多様性のために困難です。したがって、エストロゲン効果感受性バイオモニター/バイオ指標生物など、ますます効果検出方法が使用されています。これらの生物モニタリング生物には、いくつかの魚のモデルが含まれる。このプロトコルは、魚の伝播や胚の治療を含むバイオモニタリング生物としてのゼブラフィッシュTg(vtg1:mCherry)トランスジェニックラインの使用をカバーし、EDCによって誘導される蛍光シグナルの検出、文書化、評価に重点を置いています。この研究の目的は、Tg(vtg1: mCherry)トランスジェニックライン胚を使ってエストロゲンの効果を検出する方法を実証することです。この研究は、α-およびβ-ゼアラレノールの2つのエストロゲン物質を試験することによってエストロゲンの効果を検出するためのトランスジェラフィッシュ胚Tg(vtg1:mCherry)の使用を文書化した。記述されたプロトコルはアッセイを設計するための唯一の基礎である;テストメソッドは、テストエンドポイントとサンプルに応じて変更できます。また、他のアッセイ法と組み合わせることが可能であり、トランスジェニックラインの将来の利用を促進する。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

私たちの環境で最も危険な物質の一つである内分泌破壊化合物(EDC)のかなりの数があります。これらは主に天然資源から水を汚染するエストロゲン性化合物です。グループに属する物質の化学的多様性は、異なる分析方法が検出に必要なため、その存在のテストを困難にします。その化学構造に基づいて、物質が実際にエストロゲンとして機能できるかどうかを判断することは非常に困難です。また、これらの物質は環境中で純粋な形で存在することはないので、その効果は他の化合物によって影響を受ける可能性があります。この問題は、エストロゲンの,効果,22、3、4、53を示すバイオモニター/バイオ指標生物の使用などの効果検出方法によって解決することができる。45

近年、エストロゲンの効果を検出するために、種々の細胞株6および酵母ベースの試験システム2,33が開発されている。2しかしながら、これらは一般に、エストロゲン受容体22,33への物質の結合を検出することしかできない。さらに、生物の複雑な生理学的プロセスをモデル化したり、生命段階のホルモン感受性相を検出したりすることができない。したがって、誤った結果につながることがよくあります。

特定の遺伝子が生物のエストロゲンに敏感に反応することが知られている7.分子生物学法による遺伝子産物の検出は、タンパク質またはmRNAレベル88、99でも可能であるが、通常は動物の犠牲を伴う。動物保護法は厳しくなり、実験や動物モデルを別のモデルシステム10に置換する動物の数と苦しみを最小限に抑える代替試験システムの需要が高まっている。蛍光タンパク質の発見とバイオマーカーラインの作成により、トランスジェニック技術は良い代替11を提供します。これらのラインを使用すると、エストロゲン感受性遺伝子の活性化を生体内で試験することができる。

脊椎動物の中でも、環境リスク評価における魚の可能性は顕著である。彼らは哺乳類モデルよりも多くの利点を提供する:水生生物であること、彼らは全身を通して汚染物質を吸収することができ、多数の子孫を生み出し、その種のいくつかは短い生成時間によって特徴付けられる。彼らの内分泌系および生理学的プロセスは、他の脊椎動物、さらにはヒト12を含む哺乳類との間に大きな類似点を示す。

魚のエストロゲンの効果を検出するためのいくつかの遺伝子も知られています。.最も重要なのは、アロマターゼb、絨毛ゲニン-H、およびヴィテロゲニン(vtg)7、13のエストロゲン受容体である7,13。最近では、ゼブラフィッシュ,,,,(Daniorerio)4、5、14、15、16、17など、実験室で使用される魚4,5のモデルから、いくつかのエストロゲン産生バイオセンサーラインも作成されています。14151617バイオセンサーラインを作る際のゼブラフィッシュの主な利点は、胚および幼虫の透明体であり、その後、蛍光レポーターシグナルは動物10を犠牲にすることなく生体内で容易に研究することができるからである。動物保護に加えて、治療18の異なる時間に同じ個体の反応を研究することができるので貴重な特徴でもある。

これらの実験は、ビテロゲニンレポータートランスジェニックゼブラフィッシュライン15を使用する。Tg(vtg1:mCherry)の開発に使用されるトランスジーン構造は、長い(3.4 kbp)天然のビテロゲニン-1プロモーターを有する。エストロゲン受容体 (ER) ステロイド/核受容体スーパーファミリーの代表であるリガンドによって活性化されるエンハンサータンパク質です。.ERは、エストラジオールや他のエストロゲン由来物質に応答して遺伝子発現をトランスアクティブ化する高親和性を有するエストロゲン応答元素(ERE)と呼ばれる特定のDNA配列に結合し、プロモーター内のEREが多いほど強い応答を引き起こす19。Tg(vtg1:mCherry)トランスジーン構築物のプロモーター領域には17のERE部位があり、それらは天然vtg遺伝子15の発現を模倣することが期待されている。性的に成熟した女性の蛍光シグナルの連続的な発現がある。しかし、男性や胚では、肝臓での発現はエストロゲン物質による治療時にのみ見える(図1)。

figure-introduction-1
図1:17-ß-エストラジオール(E2)誘導に続くvtg1:mCherryトランスジェニック成ゼブラフィッシュおよび5 dpf胚の肝臓における赤色蛍光シグナル。E2(25μg/L暴露時間:48時間)で治療された女性および男性では、色素な皮膚を通しても肝臓の強い蛍光が見える。未処理の男性(A)では蛍光シグナルは見えません。E2誘導(50μg/L露光時間:0-120hpf)に続いて、5dpf胚の肝臓における赤色蛍光シグナルも観察され、対照胚(B)では見えない。蛍光シグナルは成人女性に継続的に存在するが、主に男性および胚の系統はエストロゲンの効果を検出するのに適している。(BF:明視野、mCherry:赤色蛍光フィルタビュー、単一平野画像、スケールバーA:5mm、スケールバーB:250μm)この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

内因性ビテロゲニンと同様に、mCherryレポーターは肝臓でのみ発現される。ビテロゲニンはエストロゲンの存在下でのみ産生されるため、コントロール内に蛍光シグナルはありません。発現は肝臓のみであるため、結果の評価は15がはるかに簡単である。

このラインの胚の感受性と使いやすさは、様々なエストロゲン性化合物混合物および環境サンプル15、20、そしてほとんどの場合15,、用量応答関係が文書化された(図2)。しかしながら、毒性が高い場合、主に肝毒性、物質(例えば、ゼアラレノン)は、治療された胚の肝臓に極めて弱い蛍光シグナルしか見えないし、極めて小さな濃度範囲内で蛍光シグナルが生じる極めて弱い蛍光シグナルに達することができ、これは用量効果関係を確立することが困難となる20。

figure-introduction-2
図2:肝臓(B)の用量応答図(A)および蛍光画像(mCherry)を17-α-エチニルエストラジオール(EE2)に曝露し、5dpf vtg1:mCherry幼虫で示した。結果は、信号強度と患部のサイズ(±SEM、n = 60)から生成された一体型密度として表されます。100%は、観察された最大値を指す。蛍光シグナル強度は濃度とともに徐々に増加した。スケールバー= 250 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

環境内に存在するエストロゲン物質がいくつか存在し、 17-β-エストラジオール(環境濃度:0.1-5.1 ng/L)21、17-α-エチニルエストラジオール(環境濃度:0.16~0.2 μg/L)22,ゼアラレノン (環境濃度: 0.095-0.22 μg/L)23, ビスフェノール-A (環境濃度: 0.45–17.2 mg/L)24.21mCherryトランスジェニック胚の助けを借りて純粋な活性形態でこれらの物質をテストするとき、 蛍光サイン検出のための最も低い観察効果濃度(LOEC)は、17-エストラジオールで100ng/L、17-α-エチニルエストラジオールの場合は1ng/L、ゼアラレノンの場合は100 ng/L、ビスフェノールA(96-120 hpf)の場合は1mg/Lであった。Tg(vtg1:mCherry)トランスジェニックラインは、直接暴露後の排水サンプル中のエストロゲン性を検出するのに役立ちます。このラインは、一般的に使用される酵母エストロゲン試験と同じくらい敏感であり、生物発光酵母エストロゲン(BLYES)アッセイ15.このラインの助けを借りて、ゼアラレニン誘導毒性に対するβ-シクロデキストリンの保護効果が、化学混合物20を用いて確認されている。

最近の報告では、トランスジェニックラインのin vivo使用が2つのエストロゲンゼアラレノン(ZEA)代謝産物、α-およびβ-ゼアラレノール(α-ZOLおよびβ-ZOL)25の助けを借りて実証された25。プロトコルベースラインは、Tg(vtg1:mCherry)胚に対するいくつかの化合物または環境サンプルのエストロゲンの影響を研究するのに適している。

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プロトコル

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動物議定書はハンガリー動物福祉法の下で承認され、治療された個人が自由な給餌段階に達する前にすべての研究が完了しました。

1. 胚の収穫と治療

  1. Tg(vtg1:mCherry)ゼブラフィッシュを25.5±0.5°C、pH = 7±0.2、導電率525±50μS/m、酸素レベル≥80%の飽和、14時間光と10時間の暗いサイクルに維持します。
  2. システム水で交配タンクを満たし、卵を収穫する前に午後に交尾するための魚を設定します。
  3. 雄と雌の魚をタンクに入れ、仕切りの助けを借りてそれらを分離します。
  4. 翌朝のライトのスイッチとして、タンクから仕切りから仕切りを取り外します。15~20分ごとに卵の交配タンクを確認してください。
  5. ティーストレーナーまたは密に織られた細かいメッシュを使用してすべての胚を収穫し、E3バッファー(5 mM塩化ナトリウム、0.17 mM塩化カリウム、0.33mM塩化カルシウム、0.33mM硫酸マグネシウム)または透明なシステム水を備えた1つの大きなペトリ皿に組み合わせます。
  6. 25.5 ±0.5°Cに設定したインキュベーターに胚を入れる。
  7. 1~1.5時間後、解剖顕微鏡でプラスチック転写ピペットで未受精卵または不十分に分割した卵を取り除いて捨てます。
    注:未受精卵は不透明です。受精卵は透明である。開発の後の段階で治療を開始するには、治療を受けている個人の正常な発達に注意を払う。
  8. 既に標識され、異なる濃度の被験物質で満たされた治療容器(例えば、ペトリ皿または組織培養プレート)に、選択した胚を配置する。
  9. 実験終了まで胚を25.5±0.5°Cでインキュベートする。
    注:胚は様々なエストロゲン化合物に対して有意な個別感受性で反応することができるので、実験を適切に評価するために、少なくとも3つの繰り返し治療で少なくとも15個の胚を使用することが推奨される。容器を選択する際、胚の発生には少なくとも200μLの水26が必要であることを覚えておいてください。この実験では、胚を25.5±0.5°Cで120hpfまでインキュベートした。
  10. 治療濃度を維持するために必要な場合は、試験溶液をリフレッシュしてください。胚にダメージを与えないように、試験溶液を交換する際には注意してください。
    注: 実験中に死亡率や致死性の症状を調べることもできます。使用濃度は、信頼性の高い結果を得るために、できるだけ安定したままにする必要があります。これは、テスト ソリューションを更新することで簡単に実現できます。リフレッシュの頻度は、被検物質によって異なる場合があります。したがって、分析測定により被験物質の濃度をチェックし、溶液の更新頻度を決定することをお勧めします。

2. 写真撮影のための幼虫の準備

  1. 4%メチルセルロースをMS-222(トリカインメタンスルホン酸塩)で事前に調製します。
    1. これを行うには、4 mg/mL MS-222〜100 mL二重蒸留水を最終濃度0.168mg/mLに加え、溶液を4°Cにします。その後、メチルセルロースを4g添加する。磁気攪拌機でかき混ぜ、一晩4°Cにしておきます。
    2. 次の日、もう一度かき混ぜて、溶液を使用する準備が整いました。メチルセルロースが完全に溶解していない場合は、4°Cに戻し、さらに数時間待ちます。
  2. 5日齢の幼虫をパスツールピペットで治療グループあたり5cmのペトリ皿に入れます。
  3. プラスチックピペットで幼虫から治療溶液を取り出し、ペトリ皿に0.02%MS-222麻酔液の2 mLを充填します。
    注:麻酔は通常1分以内に有効です。幼虫は触れ合いに応じて泳ぎ去らない場合は麻酔を受ける。MS-222の過剰摂取は幼虫を殺すことができます。
  4. 特別に設計された10cmペトリ皿の各正方形を4%メチルセルロースをMS-222で充填する(図3)。
    注:プラスチックシート(高さ1mm、幅5mm)を使用して、ペトリ皿の底に2つの1.5 x 1.5 cmの正方形の領域を接着します。20頭の幼虫を四角に並ぶことができます。特別に設計されたペトリ皿の代わりに、別の低エッジ容器を使用して胚の位置を固定することができます。

figure-protocol-1
図3:10cmペトリ皿、1.5 x 1.5 cm幅、1mm厚いプラスチックシートスクエアを貼り付け、写真撮影用の幼虫の準備を行います。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

  1. 麻酔をした幼虫を2つの正方形の1つに少量の水でメチルセルロースに移します。最初の正方形から幼虫を第2の正方形に移す。
    注:この転写の助けを借りて、写真撮影に使用される4%メチルセルロースは希釈されず、幼虫はイメージング中に回転しません。
  2. 2番目の正方形では、幼虫を左側に回転させて向き、2cmまで切ったマイクロローダーピペットチップでセルロースの底までそっと押し下げます。
    注:幼虫に損傷を与える原因となるため、他のピペットチップは使用しないでください。

3. 顕微鏡

注:写真は動物を殺すものではありません。動物はメチルセルロースから取り出し、淡水または処理液に入れることで目覚めることができるので、同じ個体を治療中に数回検査することができます。

  1. 発現したレポーターの信号を評価するために、同じビューと設定で胚を画像化する。
    メモ:最適な胚位置については、ステップ2.6を参照してください。原稿の写真は、記載の条件の下で撮影されました。明るいフィールド:60倍の倍率、6ミリ秒の博覧会、アイリス100%、ゲイン:1.1、蛍光写真:60倍倍、300ミリ秒博覧会、アイリス:100%、ゲイン:1、mCherryフィルター、蛍光灯光源:水銀金属ハライド電球。蛍光体顕微鏡の撮影には、専用カメラ、顕微鏡用ソフトウェアを用いた。
  2. ペトリ皿を顕微鏡のステージに置きます。
  3. 胚の肝臓に焦点を当て、関連するソフトウェアを使用して明るいフィールド画像をキャプチャ.
  4. 顕微鏡をmCherryフィルターに切り替え、関連ソフトウェアを使用して蛍光灯下の肝臓の蛍光画像を撮ります。
    注:暗闇の中ですべての蛍光ステップを実行します。画像の分析に役立つため、明視野と蛍光画像を撮影する間の倍率、焦点、または胚の位置を変更しないでください。
  5. 実験内のすべての胚が画像化されるまで、ステップ3.3と3.4を繰り返します。

4. 統合密度の決定

注:蛍光シグナル強度を比較するための最良の指標の1つは、統合された密度値(すなわち、面積の積と平均グレー値)です。統合密度を判断する最も簡単な方法の 1 つは、 ImageJ プログラム27を使用することです。プログラムは、インターネット上で利用可能であり、コンピュータにインストールすることができます。

  1. イメージを開いて、画像をドラッグアンドドロップするか、または[ファイル]をクリックして、分析する蛍光画像をアップロードします。を開きます。
  2. 画像をクリックします|色|RGBカラーチャートに従って蛍光フィルタによって作られた画像を分割するチャンネルを分割します。
  3. 赤チャンネルの画像スペクトルを操作し、他のチャンネルを閉じます。
  4. 偽信号が評価に干渉しないように、画像内の同様のサイズの楕円領域を指定します。楕円ツールを使用して、ハイライト表示された肝臓領域の上に楕円をできるだけ正確に描画します。
  5. シグナルが弱い場合は、光顕微鏡画像(すなわち、蛍光画像の明視野対)を使用して、肝臓の位置を決定する。
  6. 分析をクリックしてください|信号強度と患部のサイズを測定します。統合密度値は、ソフトウェアによって自動的に計算されます (グラフの IntDen カラム)。
  7. 処置群内のすべての胚の蛍光画像が分析されるまで、ステップ4.1~4.6を繰り返して分析を続けます。
  8. データを保存し、統合密度値を分析します。
    注: 解析時には、必ず画像内で同じ面積サイズを選択してください。分析する領域のサイズは、拡大率、画像解像度、撮影のその他の設定などによって異なります。分析は、パーソナル マクロを使用して分析を高速化したり、より正確にしたりすることができます。たとえば、マクロを使用すると、検査された画像で選択した領域が常に同じになるようにすることができます。特定の写真設定に基づいて最適な画像解析を可能にするマクロを作成するための詳細な説明は、ImageJのウェブサイトにあります。

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結果

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本稿で示した実験では、Tg(vtg1:mCherry)ゼブラフィッシュ胚で5日間受精から始まる5つの濃度で2つのエストロゲン物質の効果を試験した。我々は、物質のために暴露時間の終わりまでに魚の肝臓に蛍光シグナルが現れたかどうか、そして2つの物質のエストロゲン性に違いがあるかどうかを調べた。結果は蛍光画像と積分濃度値に基づいて評価した。一般に、両方の物質は、個人が生存した試験濃度での曝露時間の終わりまでにトランスジーンの発現を誘導した。未処理の対照魚の場合、蛍光シグナルは見えなかった。

α-ZOLの場合、最も高い試験濃度(8μM)で全ての個体が死亡し、この場合蛍光シグナルは検査できなかった。より低い濃度(0.5 μM~4 μM)では、強い蛍光シグナルが胚の肝臓で観察された(図4A)。蛍光強度と蛍光領域の大きさに有意差は認められなかった(p<0.05)。α-ZOLの集積密度値(図4C)は、物質が蛍光シグナルの出現を誘導したことを示す。統合密度値...

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ディスカッション

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エストロゲンの効果のためのバイオモニター/バイオ指標の使用は、毒物学的研究で広がっています。.生体内モデルは、インビトロ検査とは異なり、細胞または受容体の応答に関する情報を提供するだけでなく、生物の複雑なプロセスの調査を可能にするため、顕著な役割を果たす。エストロゲンの効果を研究するためのいくつかのトランスジェニックラインはゼブラフィッシュから作製されています, そのうちの1つは、これらの研究のために使用されたTg(vtg1:mCherry).ここで説明する方法は、純粋な有効成分における生体内のエストロゲン活性を検出するために、このラインの胚の試験のためのプロトコルを示す。

雄と胚のラインはエストロゲンの効果を検出するのにも適しているが、胚は使いやすさを促進するいくつかの利点を有する。特に、身体は透明であり、肝臓における蛍光シグナルが容易に観察され得る。ゼブラフィッシュ肝臓は、受精後6時間(6 hpf)を発症し始め、50時間後に働き始める(50 hpf)。まず、肝臓の左葉が形成され、96時間(96hpf)で肝臓の右葉も現れる。肝臓の最終形状は、5日目(120

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、国立研究開発・イノベーション基金(NKFIA)の国立研究開発・イノベーション事務所(NKFIH)によって支援されました。助成金契約:NVKP_16-1-2016-0003、EFOP-3.6.3-VEKOP-16-2017-00008欧州連合(EU)が共同出資するプロジェクト、およびツェント・イストバン大学のテーマ・エクセレンス・プログラムNKFIH-831-10/2019、イノベーション・テクノロジー省から授与されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
24ウェル組織培養プレートJet BiofilTCP011024
塩化カルシウム(CaCl2)Reanal Laborvegyszer Ltd.16383-0-27-39
GraphPad Prism 6.01ソフトウェアGraphPad Software Inc.
ImageJソフトウェア米国国立衛生研究所(NIH)パブリックアクセスソフトウェア、ダウンロード可能:
http://imagej.nih.gov/ Leica Application Suite Xキャリブレーション済みソフトウェアLeica Microsystems GmbH.実験で説明したソフトウェアを使用しましたが、どの写真ソフトウェアも
ライカM205 FA実体顕微鏡、ライカDFC 7000TカメラLeica Microsystems GmbH実験で説明した機器を使用しましたが、どの蛍光実体顕微鏡も硫酸
マグネシウム(MgSO4)。20342-0-27-38
mCherryフィルターライカマイクロシステムズGmbH。
メヒルセルロースSigma Aldrich Ltd.
マイクロローダーピペットチップEppendorf GmbH.
パスツールピペットVWRインターナショナルLLC。612-1684
ペトリ皿ジェットバイオフィルTCD000060
塩化カリウム(KCl)Reanal Laborvegyszer Ltd.18050-0-01-33
塩化ナトリウム(NaCl)Reanal Laborvegyszer Ltd.24640-0-01-38
カン-メタンスルホン酸(MS-222)シグマアルドリッチ株式会社E10521
のテストに準拠しています。の試験に適しています2744295242956003トリ

参考文献

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