温度を用いた微小管ベースの3D活性流体の流速制御

Summary

このプロトコルの目的は、温度を使用して3次元活性流体の流速を制御することです。この方法の利点は、その時点での流速を調整できるだけでなく、定期的に流量速度を上下にチューニングするなどの動的制御も可能にします。

Abstract

温度を用いてキネシン駆動の微小管系3次元(3D)活性流体の流速を調整する方法を提示する。この方法は異なった望ましい速度に達するために新しいサンプルを製造する必要性なしで座って速度を調整することを可能にする。さらに、この方法は速度の動的制御を可能にする。温度をサイクリングすると、液体は速く、ゆっくりと、定期的に流れます。この制御性は、キネシン微小管反応のアレニウス特性に基づいており、4~8μm/sの制御された平均流量速度範囲を示します。提示された方法は、チャネルの流量がバルブを必要とせずに局所的に調整できないマイクロ流体デバイスの設計への扉を開きます。

Introduction

活物質は、化学エネルギーを機械的な作業に変換する能力により、従来の受動物質と区別されます。このような能力を有する材料は、細菌、昆虫、コロイド、穀物、および細胞骨格フィラメント1、2、3、4、5、6、7、8、9、10などの生きているまたは非生きている実体から成ることができる。これらのマテリアル エンティティは、隣接するエンティティと対話します。より大きなスケールでは、乱流のような渦(アクティブ乱流)または材料流れが11、12、13、14、15、16、17、18、19、20のいずれかに自己組織化する。活性物質の自己組織化を理解することは、分子シャトル、光学デバイス、および並列^{計算21、22、23}における様々な応用につながっている。アプリケーションを次のレベルに引き上げるには、自己組織化を超えた制御が必要です。例えば、Palacciららは、手動で制御された青色光にさらされたときにのみ自走するヘマタイト封入コロイドを開発し、生きている^結晶24の出現につながった。Morin et al. は、調整不可能な外部電界を用いて圧延キンケコロイドの制御を確立し、その結果、競馬場状の^{チャネル25}にコロイド群れが生じる。これらの以前の作品は、アプリケーションにおけるローカル制御の役割を示し、アクティブな物質のナレッジベースを進めます。

この記事では、キネシン駆動、微小管(MT)ベースの3D活性流体の制御性に焦点を当てます。流体は、MT、キネシン分子モーター、および枯渇剤の3つの主要成分で構成されています。枯渇剤は、後でモータクラスタによってブリッジされるMTをバンドルするために枯渇力を誘発します。これらのモーターはプラス端に向かってMTsに沿って歩く。一対の橋渡しされたMTsisアンチパラレルの場合、対応するモータは反対方向に歩きます。ただし、モータはクラスタ内にバインドされ、離れて歩くことができないため、一対の M (インターフィラメントスライド、図 1A)を協調的にスライドさせます。これらの摺動ダイナミクスが蓄積し、座屈不安定点とブレーク(伸張バンドル、図1B)26に達するまで拡張するMTstoの束を引き起こす。壊れたバンドルは、その後再び伸びる枯渇力によってアニールされ、ダイナミクスが繰り返されます。繰り返しダイナミクスの過程で、バンドルの動きは近くの液体をかき混ぜ、ミクロンスケールトレーサーでドーピングすることによって可視化できる流れを誘導する(図1C)。Sanchez et al. および Henkin et al. はトレーサーの平均速度を特徴付けており、アデノシン三リン酸(ATP)、枯渇剤、運動クラスター、および MTs^19,27の濃度を変化させることによって速度が調整可能であったことを発見した。しかしながら、このようなタンビリティは活性流体合成の前にのみ存在していた。合成後、タンビリティが失われ、流体は独自の方法で自己組織化されました。合成後の活性流体活性を制御するために、Ross.etal.は、運動タンパク質の光活性化二量体化を用いた方法を報告し、^光28を用いて流体活性をオン/オフすることを可能にする。光制御は、流体を局所的に活性化するという点で便利ですが、この方法では、顕微鏡で光路を修正するとともに、運動タンパク質の構造を再設計する必要があります。ここでは、モータ構造をそのまま維持しながら、顕微鏡の改造を行わずに流体の流れを局所的に制御するための使いやすい方法を提供します。

キネシン-MT反応は温度29、30、31、32で増加することが報告されているので、局所的に活性流体の流れを調整する私たちの方法は、アレニウス法に基づいています。これまでの研究では、活性流体流れの平均速度の温度依存性がアレニウス方程式に従ったことを示した: v = exp(-E_a/RT)、Aは前指数因子、Rはガス定数、E_は活性化エネルギー、Tはシステム^温度33である。 従って、流体活性は温度環境に敏感であり、かつシステム温度がモータ性能を安定させるために一貫している必要があり、その結果、流体流量^速度34。この記事では、モータの温度依存性を使用して、システム温度を調整してアクティブ流体の流速を連続的に調整する方法を示します。また、活性流体サンプルの調製をデモンストレーションし、次にコンピュータソフトウェアを介して温度を制御する顕微鏡ステージにサンプルを取り付けます。温度を16°Cから36°Cに上げると、平均流量速度が4μm/sに速くなり、さらに、タンビリティは可逆的です:温度を繰り返し増減すると、流れを順次加速および減速します。実証された方法は、MT滑空アッ^{セイ29、30、31、32}などのアレニウス法に主な反応が従う広範なシステムに適用可能である。

Protocol

1. MTの作成

注意:このステップでは、牛の脳組織からチューブリンを浄化します。牛の脳は、変異型クロイツフェルトヤコブ病(vCJD)35を引き起こす可能性があります。したがって、脳廃棄物および関連するソリューション、ボトル、およびピペットチップは、バイオ廃棄物袋に収集し、施設のルールに従ってバイオ有害廃棄物として処分する必要があります。

1. 牛の脳から尿細管を浄化する (カストルディらから改変する^36).
   1. 地元の食肉処理場から大学の冷蔵室に新鮮な牛の脳の約1.5キロを輸送します。輸送中は、脳をリン酸緩衝液(20mM_NaH2PO 4、150 mM NaCl、pH 7.2)を氷上に保存します。
      注:チューブリンの最終的な収率を最大化するために、新鮮な脳組織における機能性チューブリンの初期量が重要である。新鮮な脳は、より機能的なチューブリンが含まれています.食肉処理場から新鮮な脳を得るためには、肉屋に最近虐殺された牛から脳を提供してもらうのを勧める。殺処分と処置開始の間の時間を減らすことはより良い収率を生み出すので、脳は処置を開始するとき3時間より古くてはならない。
   2. 均質化し、脳を明確にします。
      1. メスを使って血管や結合組織を小さく切り、手で脳から取り除いて脳をきれいにします。
         注:きれいにされた脳はピンクでなければなりません。
      2. 1Lの脱重合緩衝液(DB:50 mM2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸、1mM CaCl 2、pH6.6)1キログラムの脳に洗浄した脳組織を浸漬する。
      3. キッチンブレンダーで脳を均質化します。
      4. 10,000 x gおよび 4 °C で 150 分間均質化された脳溶液を遠心分離します。
   3. MT(第1重合)を重合する。
      1. 37°Cで次の溶液の等量で上清を収集し、混合する:グリセロール、高モルリティPIPESバッファー(HMPB:1 M PIPES、10 mM MgCl_2、20mMエチレングリコールビス(β-アミノエヒルエーテル)-N、N'、N'-テトラ酢酸[EGTA]、pH 6.9)
      2. 混合物に1.5 mM ATPと0.5 mMグアノシン三リン酸(GTP)を加えます。
      3. 混合物を37°Cで1時間インキュベートする。
   4. 脱重合M(最初のMT脱重合)。
      1. ペレットMTは151,000 x gで遠心分離し、30分間37°Cで行う。
      2. 上清を廃棄し、各MTペレットを4°CDBの10 mLで再サスペンドします。
      3. 氷の上で30分間インキュベートする。
      4. MT沈下を避けるためにピペットチップで5分ごとに混合物を攪拌します。
         注:混合物は、MT脱重合の完了を示す30分でクリアにする必要があります。
   5. MTを重合する(第2のMT重合)。
      1. 70,000 x gと 4 °C で 30 分間遠心分離して溶液を明確にします。
      2. 37°グリセロールとHMPBの等量で上清を収集し、混合します。
      3. 混合物に1.5 mM ATPと0.5 mM GTPを追加します。
      4. 37°Cで30分間インキュベートする。
   6. ステップ1.1.4を繰り返し、HMPBをブリンクリー再構成バッファー(BRB)80(80 mM PIPES、1 mM MgCl_2、1mM EGTA、pH 6.8)に置き換え、続いて79,000 x gおよび4°Cで30分間遠心分離してクリアした混合物を明らかにする。
   7. 上清を集める。分光器で280nmの吸光度を測定します。ビール・ランバート法(チューブリンの絶滅係数:1.15(mg/mL)-1^cm-1)37、38を用いてチューブリン濃度^を決定する。
   8. タンパク質は-80°Cで保存してください。
2. リサイクルチューブリン(カストルディ^ら36から改変)。
   注:チューブリン純度を高めるために、精製されたチューブリンを重合し、再び脱重合する。
   1. 精製チューブリン(ステップ1.1.7)を500μMジチオトライタートール(DTT)と20μM GTPと混合し、続いて37°Cで30分のインキュベーションを行い、Mを重合します。
   2. ペレットのMT。
      1. 重心管の底部にグリセロールクッション(80 mM PIPES、1 mM MgCl_2、1mM EGTA、60%v/vグリセロール、pH 6.8)をロードします。
      2. クッションの上に重合したMTを置きます。
      3. 37 °C で 90 分間 172,000 x gで遠心分離。
   3. MTを脱重合します。
      1. 上清とクッションを取り外します。
      2. 各MTペレットを4°C MTバッファの150 μLで再サスペンドします(M2B:80 mMパイプ、2 mM MgCl_2、1mM EGTA、pH 6.8)。
      3. 氷上の混合物を30分間インキュベートする。
      4. ピペットチップで混合物を5分ごとに攪拌します。混合物は透明にする必要があります。
   4. 172,000 x gと4 °Cで30分間遠心分離して混合物を明らかにします。
   5. 上清を集める。タンパク質濃度を測定します。-80°Cで保管してください。
3. 尿細管に蛍光色^素39でラベルを付ける。
   1. MTを重合します。精製されたチューブリン(ステップ1.1.7)を500μM DTTと16.7 μM GTPと混合し、37°Cで30分間インキュベートします。
   2. ペレットのMT。
      1. 37°Cの高pHクッション(0.1 M NaHEPES、1 mM MgCl_2、1mM EGTA、60%v/vグリセロール、pH 8.6)の1 mLを遠心管に入れます。
      2. 重合したMTをクッションの上に置きます。
      3. 327,000 x gで 37 °C で 50 分。
   3. ラベルチューブリン。
      1. 各 MT ペレットを 700 μL の 37 °C ラベリング バッファー (0.1 M NaHEPES、1 mM MgCl_2、1mM EGTA、40% v/v glycerol、pH 8.6) で再サスペンドします。
      2. コハクシニミジルエステルで機能化した極赤色蛍光色素の10~20モル過剰と懸濁液を混合します。
      3. 暗闇の中で37°Cで混合物を30分間インキュベートし、MTが蛍光色素のエステルと反応できるようにします。
      4. 50mM K-グルタミン酸で中断色素のエステルを飽和させ、37°Cで5分間インキュベートして標識反応を停止する。
   4. ラベル付きの MT をペレット: ステップ 1.3.2 を繰り返し、高 pH クッションを低 pH クッション (80 mM パイプ、2 mM MgCl_2、1mM EGTA、60% v/v グリセロール、pH 6.8) に置き換えます。
   5. MTを脱重合する。
      1. 上清とクッションを捨てます。
      2. ペレットを4°C M2Bの700°Lで再サスペンドします。
      3. 懸濁液を氷の上でインキュベートします。
      4. 溶液が明確になるまでピペットチップで5分ごとに攪拌します。
   6. 184,000 x gおよび 4 °Cで 35 分間遠心分離することにより、クリアされた溶液を明確にします。
   7. ステップ1.2.1~1.2.4を繰り返して、標識チューブリン溶液の純度を高めます。
   8. タンパク質と蛍光色素の濃度を測定します。これらの測定値を使用して、チューブリン濃度と標識チューブリンの画分を決定し、尿細管に対する蛍光色素の濃度の比として定義する。
   9. 標識チューブリン溶液を-80°Cで保管してください。
4. MTを重合する(サンチェス^ら19から採用):
   1. リサイクルされたチューブリン(ステップ1.2.5)を、ラベル付きチューブリン(ステップ1.3.9)と混合し、3%の標識チューブリン画分を得る比率で行います。
   2. 8 mg/mL チューブリン混合物を 1 mM DTT と 0.6 mM グアノシン-5'[(α,β)-メチルエノ]トリリン酸(GMPCPP)と混合し、続いて 37 °C で 30 分のインキュベーションを行います。
   3. インキュベーション後、6時間暗闇の中で室温でMをアニールする。
   4. アリコートと-80°で保存します。

2. キネシンクラスターの合成

注:細菌はユビキタスに存在し、媒体中で成長し、調製プロセスを汚染することができます。汚染を防ぐために、細胞培養物との接触(例えば、ピペット)を含む作用は、炎の近くで行われなければならない。フラスコ、ピペット、ピペットチップ、メディア、プレートなどのツールは、使用前にオートクレーブする必要があります。

1. 大腸^菌40のエクスプレスキネシンモーター.
   1. セルを変換します。
      1. K401-BCCP-H6プラスミドのピペット1μLを10μLの有能な細胞にする。
      2. 氷の上で5分間インキュベートする。
      3. 45°Cで42.5°Cのヒートショック
      4. 氷上の細胞を2分間インキュベートし、回復を可能にします。
      5. 300 μL の抗生物質フリー 2XYT (5 g/L NaCl, 10 g/L 酵母エキス, 16 g/L トリプトン) と細胞を混合します。
      6. 細胞を37°Cで1時間インキュベートする。
         メモ:指定しない限り、インキュベーション中に細胞増殖を監視する必要はありません。
   2. プレートメディアを接種します。
      1. 2XYTプレート(10g/L NaCl、5 g/L酵母エキス、10g/Lトリプトン、15 g/L寒天、100 gg/mLアンピシリン、25μg/mLクロラムフェニコール)に細胞培養を広げます。
      2. プレートを37°Cで一晩逆さまにインキュベートします。
   3. 液体媒体を接種する。
      1. 一晩のプレートから、ピペットチップで1つの孤立したコロニーを収穫します。
      2. 先端を2XYTの50 mLを含むフラスコに取り出します。
      3. 培養媒体を37°C、200rpmで12~16時間インキュベートし、振ります。
   4. セルを展開します。
      1. 2XYTの500 mLで細胞培養物の2.5 mLを混合する。
      2. 500 mL培養物を37°Cで振り、3~6時間で250rpm振ります。
   5. タンパク質発現を誘導する。
      1. インキュベーション中に、600nmで吸光度を測定し、2XYTを基準として細胞の成長を監視する。OD₆₀₀ = 0.3に達するまで、60分ごとに吸光度を測定します。次に、0.5~0.6に達するまで30分ごとに吸光度を測定します。
      2. 吸光度がOD₆₀₀ = 0.5~0.6に達するまで細胞を増殖させる
      3. 細胞培養に24μg/mLビオチンと1mMイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を加えます。
         注:IPTGは、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質(BCCP)および6つのヒスチジン(H6)でタグ付けされたキネシンモータのタンパク質発現を誘導するために使用されます。H6タグは精製プロセス(ステップ2.2)で使用され、BCCPは、発現されたキネシンモータをビオチン化するために添加されたビオチン分子に結合します。
      4. 細胞培養物を20°C、250rpmで12~20時間振る。
   6. 5,000 x gと4 °Cで10分間遠心分離して細胞を収穫し、上清を廃棄します。細胞ペレットを-80°Cで保管してください。
2. キネシン運動タンパク質を精製する(スプリスタースバッハ^ら41から改変):
   1. 細胞ペレット(ステップ2.1.6)を同じ体積のリシスバッファー(50 mM PIPES、 4mM MgCl₂、50μM ATP、10 mM 2-メルカプトエタノール(βME)、20mMイミダゾール、pH 7.2)、続いてプロテアーゼ阻害剤1錠、フッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)の2mg、および2mgのリゾイムを添加した。
   2. 液体窒素(LN)3xでフラッシュ凍結して細胞をリサーし、細胞混合物を解凍する。
      注:ライジング後、混合物は粘性になるはずです。
   3. 230,000 x gおよび 4 °Cで 30 分間遠心分離することにより、lys化細胞混合物を明らかにします。
   4. 上清を収集し、重力カラムを通して流し、続いて10mLのリシスバッファーでカラムを洗浄します。
      注: キネシン K401-BCCP-H6 などの H6 タグを持つタンパク質は、列に残す必要があります。
   5. 5 mL の溶出バッファー (50 mM PIPES、4 mM MgCl_2、50μM ATP、500 mM イミダゾール、pH 7.2) でタグ付きタンパク質を溶出します。フロースルーを 1 mL の分数で順番に収集します。タンパク質含有画分を決定するには、トリフェニルメタン色素の100μLで各画分の3μLを混合します。タンパク質含有分数は青色に変わるはずです。これらの画分を組み合わせ、リシスバッファーで5倍希釈します。
   6. タンパク質溶液を濃縮します。
      1. 遠心フィルターチューブに溶液をロードします。
      2. 遠心分離機は3,000 x gで4°Cで10分間。
      3. チューブをゆっくりと振り、溶液の体積が<3 mLになるまでもう一度遠心分離します。
   7. 分光計でタンパク質濃度を測定する (絶滅係数: 0.549 (mg/mL)^-1cm^-1)^42,43.35%w/vスクロースを加えながら、タンパク質を1mg/mLに希釈します。
   8. -80°Cで保管してください。
3. 電気泳動ゲルでキネシン濃度を測定する(Taylorらから^改変)。
   注:電気泳動ゲルでキネシン濃度を測定するために、尿細管は、その高純度及び分光計を介した測定可能濃度(図2A)36のために理想的な濃度ラダーである。
   1. 濃度0.25、0.5、0.75、1.00、および1.25 mg/mLのチューブリンサンプルを調製します。各チューブリンサンプルとキネシンサンプル(ステップ2.2.8)の15μLを、5μLのサンプルバッファー(200 mM Tris-HCl、8%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、400 mM DTT、0.2%ブロモフェノールブルー、40%グリセロール、pH 6.8)とインキュバテテテを別々に混ぜる。
   2. 電気泳動を準備します。
      1. 電気泳動ゲルをゲルボックスにロックします。
      2. ランニングバッファ(50 mM MOPS、50 mMトリスベース、0.1%SDS、1 mMエチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)、pH 7.7)でボックスを埋めます。
         メモ:バッファレベルがゲルの上部開口部より上にあることを確認してください。
   3. タンパク質標準はしご、チューブリンサンプル、キネシンサンプルを10μLを別々のウェルにロードし、ゲル全体に200Vを45分間塗布します。
   4. ゲル染色。
      1. 沸騰したゲルをインキュベートしてロックし(約95°C)、染色液A(0.5g/Lトリフェニルメタン色素、10%v/v酢酸、25%イソプロパノール)を5分間熟成させ、脱イオン化(DI)水でゲルをすすぐします。
      2. 染色溶液B(0.05g/Lトリフェニルメタン色素、10%v/v酢酸、10%イソプロパノール)、C(0.02g/Lトリフェニルメタン色素、10%v/v酢酸)、およびD(10%v/v/v酢酸)を順次繰り返します。一晩DI水でゲルをインキュベートし、ロックします。
   5. ゲルをスキャンします。ゲル画像をグレースケール画像に変換し、その後に白黒反転とコントラストの強調を行い、黒の背景に明るいタンパク質バンドを表示します。
   6. ピクセル値を合計して、各バンドの明るさを測定します。線形フィットC =aB +bを適用し、Bはチューブリンバンドの明るさ、Cは対応する濃度、aとbはフィッティングパラメータです。キネシンバンドBkの明るさを用いてキネシンCkの濃度を求め、線方程式を計算する:C=aB _k+b。
4. キネシンモーターをクラスター化します。
   1. 120 μM DTT および 120 nM ストレプトアビジンを使用して、1.5 μM キネシン (ステップ 2.2.8) を混合します。氷の上で30分間インキュベートする。
   2. -80°Cで保管してください。

3. ポリアクリルアミドコーティングガラススライドとカバーリップを準備する(Lauら^{から改造45)}

1. 新しいガラススライドとガラスカバーリップを対応する容器にロードします。DI水にスライドとカバーリップを1%v/v洗剤に沈め、電子レンジで水を沸騰させます。
2. スライドとカバーリップを5分間超音波処理し、DI水で洗い流して洗剤を取り除きます。
3. DI水で5分間エタノールでスライドとカバーリップを水没させ、超音波処理します。
4. DI水で5分間、100 mMの水酸化カリウム(KOH)でスライドとカバーリップを水没させ、超音波処理します。
5. シラン溶液(1%酢酸、0.5%3-(トリメトキシシリル)プロピルメタクリレートをエタノール中にインキュベートし、DI水でリンスします。
6. アクリルアミド溶液中のスライドとカバーリップ(2%w/wアクリルアミド、0.7 mg/mL過硫酸アンモニウム、およびDI水中の0.0035%v/vテトラメチルエチレンジアミン)を≥3時間でインキュベートします。
7. スライドとカバーリップをアクリルアミド溶液に保管します。

4. キネシン駆動、MTベースの活性流体を準備する

1. 活性流体を調製する(Sanchez^ら19から改変)。
   注:次の手順は、サンプルストックを使用して活性流体の100°Lを調製するプロセスを示しています。最終体積はスケーラブルであり、各成分の最終濃度が維持される限り、サンプルストックの濃度を調整することができます。
   1. 16.7 μL の 8 mg/mL MTs (ステップ 1.4.4) と 6.7 μL の 1.8 μM キネシン モーター クラスター (ステップ 2.4.2)、および高塩 M2B で 500 mM DTT の 1.1 μL (M2B + 3.9 mM MgCl₂₎を混合します。
   2. 7%w/wポリエチレングリコール(PEG)の11.4 μLを添加して、MPを束ね。
   3. 50 mM ATPの2.8°Lを追加してキネシンモータをアクティブにします。
   4. 2.8 μL のストックピルビン酸キナーゼ/乳酸デヒドロゲナーゼ (PK/LDH) と 200 mM ホスフェノールピルビン酸 (PEP) の 13.3 μL を加えて ATP 濃度を維持します。
   5. 20 mM トロックスの 10 μL、3.5 mg/mL カタラーゼの 1.1 μL、20 mg/mL グルコースオキシダーゼの 1.1 μL、および 300 mg/mL グルコースの 1.1 μL を加えることによって光漂白効果を低減します。
   6. 0.025% v/v トレーサー粒子の1.6°Lを追加して、流体の動きを追跡します。
   7. 高塩M2Bを加え、総体積100°Lを達成します。
      注: 手順 4.1.1 ~ 4.1.6 の混合注文は交換可能です。しかし、ATP、MT、モータが混在すると、モーターはMTに沿って歩きながらATPを消費し始めます。サンプルは限られた燃料(ATPおよびPEP)のために有限の寿命で活性化されるので、実験は速やかに開始されるべきである。最終的な活性流体には、1.3 mg/mL MT、120 nMキネシンモータクラスタ、5.5 mM DTT、 0.8% w/w PEG, 1.4 mM ATP, 2.8% v/v PK/LDH, 27 mM PEP, 2 mM トロックス, 0.038 mg/mL カタレーゼ, 0.22 mg/mL グルコースオキシダーゼ, 3.3 mg/mL グルコース, 0.0004% v/v コロイド高塩塩中
2. 流路でサンプルを調製する(チャンドラカール^ら46から改変):
   1. DI水でポリアクリルアミドコーティングガラススライドとカバースリップ(ステップ3.7)をすすいでください。メガネを加圧空気で乾かします。清潔で平らな面に置きます。
   2. 3mm幅、ガラスカバースリップ(20mm)と同じ長さのワックスフィルムを2本カットします。スライドとカバースリップの間にストリップをチャンネルスペーサーとして挿入します。
   3. ガラスワックス複合体を80°Cのホットプレートに置いてワックスフィルムに付着させ、ワックスを溶融します。溶融中に、ピペット先端でカバースリップを軽く押し、ワックスフィルムをガラス表面に均一に付着させます。密着後、ガラス錯体を室温まで冷却する。
   4. アクティブな流体(ステップ 4.1)をフロー チャネルにロードします。UV接着剤でチャネルをシールします。

5. サンプル温度の制御

1. 温度制御のセットアップを構築する(Lowensohnらの設計から変更^{され、47、48、49)。}
   1. アルミニウム冷却ブロックを準備します。
      1. 約30mm×30mm×5mmの寸法を持つアルミニウム板をミル。
      2. プレート(図3A)を通して内部チャンネルをドリルし、チャンネル端にホース継手を取り付けます。
      3. 各フィッティングを水管にフックします。
      4. 一方のチューブを貯水池の水槽内の魚タンクポンプに接続し、もう一方のチューブを貯水池に延長します。
         メモ:ポンプは、ほぼ室温でブロック温度を維持するために、アルミニウム内部チャネルを介して貯水池の水を循環させます。
   2. 温度コントローラに熱電冷却器(TEC)とサーモセンサーを配線します。USBポートを使用してコントローラをコンピュータに接続します(図3B)。
   3. 温度コントローラを直流(DC)電源に配線します。電源をコンセントに差し込み、コントローラの電源を入れます。
   4. コントローラの製造元のガイドに従って、TEC の初期セットアップを実行します。TEC 出力をテストします。メーカーが提供するソフトウェアを介して温度コントローラを制御し、サーモセンサデータ記録と温度コントローラの操作を容易にすることをお勧めします。
   5. TEC の冷暖房面を特定します。
   6. サーマルペーストを使用して、TECの冷却側を冷却ブロック(ステップ5.1.1)に取り付けます。
   7. サーマルペーストを使用して、TECの加熱側にサファイアディスクを取り付けます。
   8. セットアップが完了しました。サファイア表面とサーモセンサーは、サンプルに接触して、温度と目標温度に基づいてサンプルを冷却し、加熱することができます。
      メモ:TECと冷却ブロックには、明視野顕微鏡を使用してサンプルをイメージングするための中央穴を揃えてお勧めします(図3C)。
2. 温度制御設定を使用して、サンプル^温度33を制御します。
   1. サンプルをセットアップにマウントします。
      1. アクティブな流体サンプル(ステップ4.2.4)をサファイア表面に配置し、スライド側でサーフェスに接触させます。
      2. ガラスのスライドを紙テープで固定します。
      3. 銅テープを使用して、サーモセンサーをカバースリップ面に取り付けます。
   2. カバースリップ側を目的に向けた顕微鏡ステージにセットアップを取り付けます。例えば、反転顕微鏡では、カバースリップ側が下を向く必要があります。必要に応じて、紙テープと顕微鏡ステージ針クランプでセットアップを固定します。
      メモ:提示された温度段階は、反転または直立した一般的な顕微鏡で動作する必要があります。実験中に温度段階が移動しないようにするには、温度段階をテープで顕微鏡段階に固定するのが最善です。
   3. サンプル温度を制御します。
      1. 温度コントローラと魚タンクポンプをオンにします。
      2. 製造元のガイドに従って、目標温度を設定し、温度制御を有効にします。コントローラは、温度センサによって評価される目標温度とサンプル温度に基づいて加熱または冷却電力を調整します。
   4. サンプル温度を記録します。
      1. 実験中に熱センサーの温度データを記録するには、製造元のガイドに従ってください。
         メモ:サンプル温度はコントローラによって制御され、コンピュータによって記録されます(図3D)。

6. 活性流体活性を特徴付める(ヘンキンらおよび呉^ら20,27)による方法から改変する)

注: 前のセクションでは、アクティブな流体サンプル(セクション 1 ~ 4)を準備し、その温度を制御するために使用します(セクション 5)。アクティブな流体活動を制御するために温度の使用を実証するには、流体の挙動を観察し、その活動を分析し、温度に対する応答を特徴付けます。

1. トレーサーを監視します。
   1. 緑色蛍光タンパク質(GFP)蛍光を用いて一定間隔Δtで試料を画像化し、トレーサー粒子の動きを捕捉する。
      注: トレースャーの動きを追跡できるようにするには、Δtを選択する必要があります。100 s などの大きな Δt値はトレーサー軌道を失いますが、0.1 s などの短い Δt値は、トラッキング アルゴリズムがフレーム間のトレーサーの動きを検出するのを防ぎます。作業 Δtでは、フレーム間のトレーサーの変位を~9 ピクセル以内にする必要があります。4xの目的を使用して10 μm/sで移動するイメージングトレーサーの場合、Δtは1~5sにすることをお勧めします。
   2. イメージを TIFF ファイルとして保存し、フレーム番号に基づいてファイルに名前を付け、別のフォルダに保存します。これらのプロセスは、取得したイメージが提供されている MATLAB スクリプトを使用して正しく分析されるようにするために必要です (手順 6.2.2)。
2. ウエレット^ら50、51によって開発された追跡ソフトウェアを採用する追跡トレーサー:
   1. スタンフォード大学環境複雑研究所(https://web.stanford.edu/~nto/software.shtml)から追跡ソフトウェアをダウンロードします。各 MATLAB ファイルが同じフォルダにあることを確認します。
   2. カスタム MATLAB スクリプトを使用してトレーサーを追跡します: particle_tracking.m.このスクリプトはトレーサーイメージを読み取り(ステップ6.1)、ウエレットらのソフトウェアを使用してトレーサーの動きを^{追跡します。}これは、画像の背景を表す1)background.tif、および2)各フレームの粒子軌道と速度を含む2つのファイルを出力します(図4A)。
3. カスタム MATLAB スクリプト analysis.m を使用して、トレーサー平均速度を分析します。このスクリプトは、トラッキング ファイル (Tracking.mat) を読み取り、トレーサーと時間の平均速度と、指定された平均ウィンドウ (図 4B)³³の平均平均速度を出力します。
4. 時間平均平均速度を記録します。
5. 実験(ステップ4、5.2、6.1~6.4)を10~40°Cで繰り返して、平均平均速度を測定します。記録された平均速度を使用して、平均速度と温度をプロットします (図 4C)³³。

Results

キネシン駆動のMTベースの活性流体を準備するには、キネシンとMの両方が必要です。MTを、牛の脳から精製した標識チューブリン(ステップ1.3および1.4)から重合し、続いてリサイクルして純度を高めた(ステップ1.2、図2B)。キネシン運動タンパク質を大腸菌(ステップ2.1および2.2、図2B)41、52から発現および精製した。 調製したキネシンストックの濃度を、リサイクルされたチューブリンと既知の濃度との主バンド輝度と比較してSDSゲルで測定した(ステップ2.3、図2Bインセット)。チューブリンバンドの...

Discussion

その場所でアクティブな物質を制御することは、アクティブ^{マター4、5、24、28、54}の指向的な自己組織化への扉を開きます。本稿では、^{システム29、30、31}のアレニウス特性に基づいて、温度を使用して現場でキネシン駆動のMTベースの活性流体を制御するためのプロトコルを提示する。このシステムはタンパク質ベースであるため、実験全体を通じてタンパク質の機能を維持することが、プロトコルを正常に適用する鍵となります。システムの主なタンパク質は、MTとキネシンクラスターです。前者は16°C以下で脱重合し、後者^...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(±)-6-ヒドロキシ-2,5,7,8-テトラメチルクロマン-2-カルボン酸	Sigma-Aldrich	238813	Trolox
2-メルカプトエタノール	Sigma-Aldrich	M6250
3-(トリメトキシシリル)プロピルメタクリレート、98%、ACROS Organics	フィッシャーサイエンティフィック	AC216550050
3.2mm I.D. タイゴンチューブ R-3603	HACH	2074038	水管
直径 31.75 mm コーティングなし、サファイアウィンドウ	Edmund Optics	43-637	サファイアディスク
3M 1181 銅テープ - 1/2 IN 幅 X 18 YD 長さ - 2.6 MIL 総厚さ - 27551	R.S. HUGHES	054007-27551	銅テープ
酢酸	Sigma-Aldrich	A6283
アクリルアミド溶液 (40%/電気泳動)、Fisher BioReagents	フィッシャーサイエンティフィック	BP1402-1
アデノシン 5'-三リン酸二カリウム塩水和物	Sigma-Aldrich	A8937	ATP
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)	Thermo Fisher Scientific	A20006	遠赤色蛍光色素。Alexa 647は、微小管(1.3.3.2)と混合する前に、ジメチルスルホキシド(DMSO)に事前に懸濁することができます。
アミコンウルトラ-4遠心フィルターユニット	シグマ・アルドリッチ	UFC801024	遠心フィルターチューブ。カットオフ分子量:10 kDa
硫酸アンモニウム、100g、MP Biomedicals	フィッシャーサイエンティフィック	ICN802829	APS
アンピシリンナトリウム塩(結晶性粉末)、フィッシャーバイオ試薬	フィッシャーサイエンティフィック	BP1760	アンピシリン
防振テーブル	ニコン	63-7590S
Avanti J-E遠心分離機	ベックマンコールター	369001
バクト寒天販売剤、BD診断	VWR	90000-760	天
ビオチン	アルファAesar	A14207
ケツプラスチック白-2ガロン	Bon	84-715	水バケツ
塩化カルシウム	グマアルドリッチ	746495
牛の肝臓シ	グマアルドリッチ	C40
CFIプランアポラムダ4x ObjからのCaCl2カタラーゼ	Nikon	MRD00045	4x エア対物レンズ
C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero Shift	Nikon	96372	GFP フィルターキューブ
CH-109-1.4-1.5	TE Technology	CH-109-1.4-1.5	熱電冷却器 (TEC)
クロラムフェニコール、98%、ACROS Organics	フィッシャーサイエンティフィック	C0378
冷却ブロック	N/A	N/A	カスタムミルドアルミニウム
Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400	Bio-Rad	1610400	トリフェニルメタン色素
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
ジメチルスルホキシド (認定 ACS)、Fisher Chemical	Fisher Scientific	D128	DMSO
DL-1,4-Dithiothreitol、99%、生化学用、ACROS Organics	Fisher Scientific	AC165680050	DTT
DOWSIL 340 ヒートシンク コンパウンド	ダウ	1446622	サーマルペースト
エチルアルコール、200 プルーフ ACS/USP/NF グレード 5 ガロン ポリキューブ	Pharmco by Greenfield Global	111000200CB05	エタノール
エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸	Sigma-Aldrich	E3889	EGTA
エチレンジアミン四酢酸	Sigma-Aldrich	798681	EDTA
フィッシャーバイオ試薬微生物学培地 添加剤:トリプトン	フィッシャーサイエンティフィック	BP1421	プトン
フィッシャーバイオ試薬 微生物学培地 添加物:酵母エキス	フィッシャーサイエンティフィック	BP1422	エキス
フルオレスブライトYGマイクロスフィア、キャリブレーショングレード3.00 & マイクロ;m	Polysciences	18861	トレーサー粒子
アスペルギルス属のニジェール	Sigma-Aldrich	G2133
グリセロール	Sigma-Aldrich	G5516
GpCpp	Jena Bioscience	NU-405L	グアノシン-5'[(α,β)-メチルノ]三リン酸(GMPCPP)
GS Powerの18ゲージ(True American Wire Ga)、100フィート、99.9%撚り線無酸素銅OFC、赤/黒2導体接着ジップコード電源/スピーカー電気ケーブル車、オーディオ、ホームシアター用	アマゾン	B07428NBCW	銅線グア
ノシン5'-三リン酸ナトリウム塩水和物	Sigma-Aldrich	G8877	GTP
Hellmanex III	Sigma-Aldrich	Z805939	洗剤
HEPES ナトリウム塩 (白色粉末), Fisher BioReagents	フィッシャーサイエンティフィック	BP410	NaHEPES
高性能ブレンダーマシン	AIMORES	AS-UP1250	ブレンダー
His GraviTrap	GE ヘルスケア	11003399	グラビティカラム
イミダゾール	Sigma-Aldrich	I5513
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758	イソプロピル β-D-1-チオガラクトピラノシ
アルコール 99%	Pharmco by Greenfield Global	231000099	Isopropanol
JA-10 ローター	ベックマン・コールター	369687
L-グルタミン酸カリウム塩 一水和物	Sigma-Aldrich	G1501	K-グルタミン酸
リゾチーム 鶏卵白	Sigma-Aldrich	L6876
塩化マグネシウム六水和物	Sigma-Aldrich	M2670	MgCl2•6H2O
MESナトリウム塩	Sigma-Aldrich	M5057	2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸ナトリウム塩
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254	3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸
MP-3022	TEテクノロジー	MP-3022	熱電対
N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン 99%、ACROS Organics	フィッシャーサイエンティフィック	AC138450500	TEMED
Nanodrop 2000c UV-VIS 分光光度計	サーモフィッシャーサイエンティフィック	E112352	分光計
ニコン Ti2-E ニコン倒立顕微鏡	ニコン	MEA54000
ノーランド 光学接着剤 81	ノーランド製品	NOA81	UV接着剤
Novex シャープ 染色済みタンパク質標準	サーモフィッシャーサイエンティフィック	LC5800	タンパク質標準
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.5 mm, 10-well	Thermo Fisher Scientific	NP0335BOX	SDS gel
Optima L-90K 超遠心分離機	Beckman Coulter	365672
Parafilm PM996 Wrap, 4" Wide; 125 ft/Roll	Cole-Parmer	EW-06720-40	Wax film
Pe 300 ultra Illumination System Single Band, 3mm Light Guide Control Pod power supply	Nikon	PE-300-UT-L-SB-40	クールLEDイルミネーター
ニルメタンスルホニルフッ化物	Sigma-Aldrich	78830	PMSF
ホスホエノールピルビン酸モノカリウム塩、99%	BeanTown Chemical	129745	PEP
Pierce Coomassie(Bradford)タンパク質アッセイキット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	23200
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A32953
PIPES	Sigma-Aldrich	P6757	1,4-ピペラジンジエタンスルホン酸
プルロン酸F-127	Sigma-Aldrich	P2443
ポリ(エチレングリコール)	Sigma-Aldrich	81300	PEG.平均分子量 20,000 Da
水酸化カリウム (ペレット/認定 ACS)、フィッシャー ケミカル	フィッシャー サイエンティフィック	P250-500	KOH
PowerEase 300W 電源 (115 VAC)	サーモフィッシャー サイエンティフィック	PS0300	ゲル ボックスの DC 電源
PS-12-8.4A	TE テクノロジー	PS-12-8.4A	温度コントローラー
の DC 電源ウサギの筋肉からのピルビン酸キナーゼ/乳酸デヒドロゲナーゼ酵素	Sigma-Aldrich	P-0294	PK/LDH
Quiet One Lifegard Fountain Pump、296-Gallon Per Hour	Amazon	B005JWA612	Fish tank pump
Rosetta 2(DE3)pLysS コンピテントセル - Novagen	Millipore Sigma	71403	コンピテントセル
シャープマイクロ波 ZSMC0912BS シャープ 900W カウンタートップ電子レンジ、0.9 立方フィート、ステンレス鋼	アマゾン	B01MT6JZMR	水を沸騰させるための電子レンジ
塩化ナトリウム(結晶性/認定ACS)、フィッシャーケミカル	フィッシャーサイエンティフィック	S271-500	NaCl
ドデシル硫酸ナトリウム	シグマアルドリッチ	L3771	SDS
リン酸ナトリウム 一塩基性	シグマアルドリッチ	S8282	NaH2PO4
ストレプトアビジンタンパク質	サーモフィッシャーサイエンティフィック	21122
ショ糖	Sigma-Aldrich	S7903
TC-720	TE Technology	TC-720	温度調節器
トリスベース、分子生物学グレード - CAS 77-86-1 - Calbiochem	Sigma-Aldrich	648310	Tris-HCL
Type 45 Ti ローター	ベックマン・コールター	339160
タイプ 70 Ti ローター	ベックマン・コールター
タイプ70.1 Ti	ベックマンコールター	342184
VWR 汎用研究所ラベリングテープ	VWR	89097-916	紙テープ
VWR マイクロカバー メガネ、正方形、No. 1 1/2	VWR	48366-227	ガラス カバースリップ
VWR プレーンおよびつや消しマイクロ スライド、プレミアム	VWR	75799-268	ガラス スライド
XCell SureLockミニセル	サーモフィッシャーサイエンティフィック	EI0001	ゲルボックス
ZYLA5.5 USB3.0カメラ	ニコン	ZYLA5.5-USB3	モノクロCCDカメラ