卵巣癌におけるノッチシグナル伝達の役割を理解するためのバイオインフォマティクスアプローチと実験的検証の統合

Summary

バイオインフォマティクスは、大規模なデータセットを処理するのに便利な方法です。バイオインフォマティクスアプローチの実装を通じて、研究者は洞察力に富んだ応用や科学的発見を迅速かつ確実に、効率的に得ることができます。本稿では、卵巣癌研究におけるバイオインフォマティクスの活用を実証する。また、実験によるバイオインフォマティクスの所見の検証にも成功しています。

Abstract

ノッチシグナル伝達は、多くの細胞プロセスに関与する高度に保存された調節経路である。このシグナル伝達経路の調節不全は、しばしば適切な発達との干渉につながり、特定の場合には癌の開始または進行をもたらすことさえある。この経路は複雑で多目的な機能を果たすので、多くの異なるアプローチを通じて広範囲に研究することができる。このうち、バイオインフォマティクスは、紛れもなくコスト効率が高く、親しみやすく、ユーザーフレンドリーな学習方法を提供します。バイオインフォマティクスは、大規模なデータセットから小さな情報を抽出するのに便利な方法です。研究者は、さまざまなバイオインフォマティクスアプローチの実装を通じて、これらの大きなデータセットを迅速かつ確実かつ効率的に解釈し、洞察力に富んだアプリケーションと科学的発見を生み出すことができます。ここでは、卵巣癌におけるノッチシグナル伝達の役割を調べるバイオインフォマティクスアプローチの統合のためのプロトコルが提示される。さらに、バイオインフォマティクスの所見は実験によって検証される。

Introduction

ノッチシグナル伝達経路は、生物内の多くの発達過程にとって重要な高度に保存された経路である。ノッチシグナル伝達は、細胞増殖および自己再生において重要な役割を果たすることが示されており、ノッチシグナル伝達経路の欠陥は、多くのタイプの癌を引き起こす可能性がある^{1、2、3、4、5、6}である。いくつかの状況において、ノッチシグナル伝達経路は、組織の成長および癌ならびに細胞死および腫瘍抑制⁷の両方に関連している。複数のノッチ受容体(NOTCH 1−4)およびco\u2012アクティベーターマスターマインド(MAML 1−3)は、すべて多様な機能を有し、複雑さのレベルを追加する。ノッチシグナル伝達経路は機能の点で洗練されているが、そのコア経路は分子ベース⁸で単純である。ノッチ受容体は、細胞外および細胞内領域9からなる膜貫通タンパク質として作用^する。ノッチ受容体の細胞外領域へのリガンド結合はタンパク質分解切断を促進し、ノッチ細胞内ドメイン(NICD)を核内に放出することを可能にする。次に NICD は co\u2012 アクティベーター マスターマインドに結合して下流遺伝子発現¹⁰を活性化します。

近年、ノッチシグナル伝達は、異なる種^6、11にわたるいくつかの種類の癌の開始および進行において様々な役割を果たすることが示されている。例えば、ノッチシグナル伝達は、ヒトNOTCH1遺伝子¹²を含む腫瘍形成に関連している。近年、NOTCH2、NOTCH3、デルタ様3(DLL3)、マスターマインド\u2012様タンパク質1(MAML1)、およびジシンテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン\u2012含有タンパク質17(ADAM17)遺伝子は、特^に患者の全体的な生存不良と強く関連していることが示された。

実験データと患者関連データの量が継続的に増加するにつれて、利用可能なデータの分析に対する需要も増加します。利用可能なデータはパブリケーションに分散され、矛盾した結果や矛盾する結果が得られる可能性があります。次世代シーケンシングなど、ここ数十年の新技術の開発に伴い、利用可能なデータの量は急激に増加しています。これは科学の急速な進歩と継続的な生物学的研究の機会を表していますが、研究の質問を解決するために一般に公開されているデータの意味を評価することは大きな課題です¹⁴.バイオインフォマティクスは、大規模なデータセットからより小さな情報を抽出するのに役立つ方法であると考えています。研究者は、さまざまなバイオインフォマティクスアプローチの実装を通じて、これらの大きなデータセットを迅速かつ確実かつ効率的に解釈し、洞察に満ちた発見を生み出すことができます。これらの発見は、潜在的な新薬療法標的または疾患バイオマーカーの同定から、パーソナライズされた患者治療^15、16まで及び得る。

バイオインフォマティクス自体は急速に進化しており、技術の進歩が医学や生物科学を席巻するにつれて、アプローチは絶えず変化しています。現在、一般的なバイオインフォマティクスアプローチには、DNAまたはタンパク質配列を分析し、特定の関連性または重要性の遺伝子を同定し、機能ゲノム^16を介して遺伝子および遺伝子産物の関連性を決定するための、公的にアクセス可能なデータベースおよびソフトウェアプログラムの利用が含まれる。バイオインフォマティクスの分野は確かにこれらのアプローチに限定されるものではありませんが、これらは臨床医や研究者が患者全体の利益のために生物学的データを管理するのに役立ちます。

この研究は、いくつかの重要なデータベースとそのノッチシグナル伝達経路に関する研究への使用を強調することを目的としています。NOTCH2、 NOTCH3、およびコ\u2012アクティベーター MAML1がデータベーススタディの例として使用されました。これらの遺伝子は、卵巣癌におけるノッチシグナル伝達経路の重要性が検証されたために用いられた。取得したデータの系統的分析は、卵巣癌におけるノッチシグナル伝達の重要性を確認した。さらに、ノッチシグナル伝達は種間で十分に保存されているため、ショウジョウバエのメラノガスターNICDとマスターマインドの過剰発現がショウジョウバエの腫瘍を誘発し、データベース所見と卵巣癌におけるノッチシグナル伝達の重要かつ保存的な役割を支持することが確認された。

Protocol

1. ゲノムプロファイル(PRECOG)からの臨床結果の予測

注:PRECOGポータル(precog.stanford.edu)は、遺伝子発現レベルおよび患者の臨床結果¹⁷を含む165の癌発現データセットから一般に利用可能なデータにアクセスする。具体的にはMeta\u2012Z分析を提供し、患者の全生存を示すために39種類の癌タイプの異なる遺伝子のZ\u2012スコアを提供する大規模なデータセットを組み込んでいます。生存率が低く、良好な生存率は、それぞれ正と負の Z\u2012score 値で示されます。

1. このデータベースにアクセスするには、アカデミックな関連メールを持つアカウントを作成します。アカウントに関連付けられている電子メール アドレスとパスワードを入力します。
2. Meta-Z解析見出しの下にある[詳細の表示]ボタンをクリックします。
3. 目的の遺伝子を検索バーに入力します。
4. 画面の下部にあるスクロールバーを使用して、対象となる特定のがんタイプの生存Zスコアを取得します。

2. CSIOVDB

注:CSIOVDB(csibio.nus.edu.sg/CSIOVDB/CSIOVDB.html)は、シンガポールのがん科学研究所が卵巣癌¹⁸を研究するために開発したマイクロアレイデータベースです。このデータベースには、異なる腫瘍部位からの癌腫のデータと正常な卵巣組織データが含まれています。さらに、CSIOVDBは、微分遺伝子発現レベルを有する患者の生存を評価するために、カプラン\u2012マイヤー生存プロットを提供します。CSIOVDBは、遺伝子発現レベルと卵巣癌段階/グレードとの関連を調べるために適用することができる。

1. 目的の遺伝子を入力し、[検索]ボタンをクリックします。
2. [病の状態] タブをクリックします。
   注:このタブは、卵巣癌疾患状態に関心のある標的遺伝子の遺伝子発現の要約統計を提供する。
3. [ヒストロジー ]タブをクリックします。
   注:このタブは、主要な卵巣癌の癌の遺伝性に関心のある標的遺伝子の遺伝子発現の要約統計を提供する。
4. [臨床病理学的パラメータ]タブをクリックします。
   注:このタブは、異なる卵巣癌の段階、グレード、および臨床応答間の遺伝子発現レベルをMann-Whitney検査と比較します。
5. [サバイバル]タブをクリックします。
   注:このタブは、全体的な生存と無病生存に関連するカプランマイヤープロットを提供します。このデータベースでは、無病生存期間は進行および再発のない生存^期間18と考えられている。全生存期間と無病生存率の多変量解析もこのタブの下にあります。多変量解析では、卵巣癌の予後(段階、グレード、外科的脱バルク、歴史学、年齢)および関心のある遺伝子に関連する特徴を比較します。
6. [サブタイプ] タブをクリックします。
   注:このタブは、卵巣癌の分子サブタイプに関心のある遺伝子の発現レベルの要約統計量とマン・ホイットニー検定を提供します。このタブはまた、卵巣癌の分子サブタイプに関心のある遺伝子の全体的な生存および無病生存に関連するカプラン・マイヤープロットを提供する。

3. 正常および腫瘍組織全体の遺伝子発現(GENT)

注:GENTポータル(医療\u2012genome.kribb.re.kr/GENT)は、韓国バイオサイエンス・バイオテクノロジー研究所(KRIBB)19によって開発され、維持されています。16,400 (U133A; 241 データセット) と 24,300 (U133plus2; 306 データセット) を一般に公開しているサンプルを収集します。標準化後、GENTは多様な組織にわたって遺伝子発現データを提供し、腫瘍と正常組織にさらに分かれています。

1. 画面上部の[検索]タブをクリックします。
2. 1 というラベルの付いたセクションで。[キーワード]で、ドロップダウン メニューから[用語] の[遺伝子シンボル] を選択し、[キーワード] セクションの空白領域に対象遺伝子の遺伝子シンボルを入力して、[種類]オプションで[組織] を選択します。
3. 1 の下部にある [検索] ボタンをクリックします。キーワードセクション。U133AおよびU122Plus2プラットフォームに基づく異なる癌タイプの正常組織および腫瘍組織における遺伝子発現の要約グラフを示す。
   注: サマリー グラフの上部にある[データ フィルタリング] オプションを選択して、調査する特定のデータベースを選択することはオプションです。
4. [結果データのダウンロード] の横にあるリンクをクリックして、遺伝子発現値、組織タイプ、およびデータ ソースに関する詳細情報にアクセスします。

4. 広域研究所がん細胞株百科事典(CCLE)

注:CCLE(portals.broadinstitute.org/ccle)は、ブロード研究所によって作成され、947ヒト癌細胞株²⁰のゲノムプロファイルと突然変異を提供します。

1. 目的の遺伝子を検索バーに入力し、[検索]ボタンをクリックします。
2. [データセットの選択 ]というラベルのセクションで、ドロップダウン メニューからmRNA 式 (RNAeq)オプションをクリックします。
   注: その他のオプションには、mRNA 発現 (Affy)、アキレス shRNA ノックダウン、およびコピー番号があります。
3. [すべてのトレースを切り替え]ボタンをクリックします。右側の灰色のボックスから目的の組織タイプを選択します。画面の一番下までスクロールし、[mRNA 式のダウンロード] ボタンをクリックします。
4. ダウンロードしたテキスト ドキュメントを開きます。すべてのテキストをコピーしてシート1に貼り付けます。シート 1のすべてのテキストをコピーします。
5. スプレッドシートの下部にあるスプレッドシート ソフトウェアの[シート 2]タブでシートをクリックします。[A]列を右クリックし、[形式を選択して貼り付け] を選択して、シート 2 の [移調] オプションを選択します。
6. シート 2でテキストが 2 つの列に転置されたら、[並べ替えとフィルタ] オプション見出しのドロップダウン矢印をクリックし、[フィルタ] オプションを選択します。[Gene]というラベルの付いた見出し領域に矢印が表示されます。矢印をクリックし、目的の組織タイプを入力します。
   注:このステップでは、すべてのデータをフィルタリングし、目的の組織タイプの遺伝子発現レベルのみを表示します。

5. cBioPortal

注:cBioPortal(www.cioportal.org)は、メモリアルスローンケタリングがんセンター(MSK)で開発され、大規模ながんゲノムデータ^21、22にアクセス、分析^、可視化します。具体的には、このポータルを使用して、研究者は遺伝子改変やシグナリングネットワークを検索することができます。

1. ランディング ページのクエリを使用して、[スタディの選択] というラベルのセクションで目的の臓器/組織をクリックします。目的の特定のスタディを選択し、[遺伝子で照会]ボタンを押します。
2. [ゲノムプロファイルの選択] セクションで、[変異]、[ GISTIC からの表現コピー番号の変更、またはmRNA 式] の 3 つのオプションから選択します。さらに、患者/ケースセットの選択のドロップダウンメニューから対応するデータを選択します。
3. [遺伝子の入力] のクエリ ボックスにターゲット 遺伝子シンボルを入力します。[クエリの送信] ボタンをクリックします。
4. ページ上部の[ネットワーク]タブをクリックして、目的の遺伝子ネットワークを取得します。
   注: シグナリング ネットワークは色分けされています。入力された遺伝子は、太い境界線を持つシードノードによって示されます。各遺伝子は赤い円で表され、赤い円の色の強度はその突然変異頻度を反映します。遺伝子は異なる色の線でつながっています。茶色の線は「同じ成分内」を意味し、同じ生物学的成分への関与を示す。青い線は「反応する」を意味し、遺伝子反応を示す。緑色の線は「状態変化」を意味し、ある遺伝子が別の遺伝子の状態変化を引き起こす可能性があることを示唆している。
5. 画像の上部にある [ファイル]タブをクリックして、ネットワーク イメージのダウンロードに [イメージとして保存 (PNG)]を選択します。

6. 所望の遺伝子型およびDAPI染色を伴うショウジョウバアラの解剖

注:所望の遺伝子型で女性ショウジョウバチを収集し、その後、イメージングのためのDAPI染色の手順を受けるためにフライ卵巣を解剖します。

1. フライストックtj-Gal4、Gal80ts/CyOを準備します。UAS-NICD-GFP/TM6B、 w*;UAS-mam.A;そしてw[1118] NICD-過剰表現(tj-Gal4、Gal80ts/+;UAS-NICD-GFP/+およびNICDおよびマム過剰表現 (tj-Gal4, Gal80ts/UAS-mam.A;UAS-NICD-GFP/+機能。
2. 時間的および局所的遺伝子発現ターゲティング(TARGET)技術を適用して、時空間遺伝子発現²³を制御する。大人になるまで18°Cでハエを上げ、解剖する前に酵母で48時間29°Cにシフトします。
   注:tj-Gal4は、Gal80tsによる阻害が緩和された場合にのみ、より高い温度下でUAS発現を駆動することができます。解剖の前に酵母を添加すると、収穫のために卵巣が拡大します。
3. 1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)の3 mL(137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na₂HPO 4、1.8 mM KH₂PO₄₎を胚回収皿に入れます。ハエを麻酔するためにCO₂パッドを使用してください。
4. メスフライを選択し、慎重に解剖鉗子のペアを使用してハエの下部胸郭をつかみ、胚コレクション皿の1x PBS溶液に水没させます。下腹部をつまみ、内臓を解放するために穏やかに引っ張るために鉗子の2番目のペアを使用してください。
5. 卵巣のペアを識別し、フライボディから取り外します。卵巣の後端にある筋肉鞘を破り、卵巣を分離する。
   注:より高品質の染色結果を達成するためには、卵巣を分離し、筋肉鞘を壊す必要があります。
6. 卵巣を1x PBSの500 μLを含む1.5 mL遠心管に入れます。すべての卵巣が採取されるまで、チューブは氷の上に残る必要があります。
7. 1x PBSを取り外し、0.5 mLの固定溶液(4%ホルムアルデヒド)をチューブに入れます。チューブをヌータに10分間置きます。
8. チューブから固定液を取り出し、適切な廃棄物容器に入れます。1x PBT(0.4%トリトン™X-100を補充した1x PBS)の1mLを使用して、卵巣を3x15分間洗浄します。
9. 最終的なPBT洗浄を廃棄し、PBTGの1mL(0.2%ウシ血清アルブミン、1x PBTで5%正常ヤギ血清)を加えて非特異的結合を防止する。
   注:このステップは、DAPI染色のためにスキップすることができますが、抗体染色のために不可欠です。詳細な免疫ヒストケミストリー染色はJia et al.²⁴に見られる。
10. 150 μL の DAPI (10 μg/mL) をチューブに入れ、10~15 分間のナットを行います。DAPIを廃棄し、1x PBTの1 mLを使用して卵巣1xを10分間洗浄します。PBTを取り外し、1x PBSを使用して2xを10分間洗浄します。
11. 約300μLのPBSが卵巣とチューブに残るまで、余分なPBSを取り除きます。卵室を解放するために、200°Lピペットを使用して卵巣を数回上下にパイプします。
12. チューブを軽く回転させ、卵巣を取り除かずにできるだけ多くの1x PBS溶液を慎重に取り除きます。取り付け液の120 μL(1g n-プロピルガレート、10X PBSの5ml、グリセロール40ml、dH2Oの5ml)をチューブに入れます。
    メモ:取り付け液は粘着性があるので、取り付け液を正確に120°Lチューブに転写することは困難です。この問題を軽減するために、1,000 μL ピペットチップを使用して、3 滴の取り付け液をチューブに追加できます。
13. 200 μL ピペットチップから約 0.33 mm を取り出し、新しくカットしたピペットチップを使用して、取り付け液を顕微鏡ガラススライドに配置します。
14. 取り付け液にカバースリップガラスをそっと置き、カバースリップの端を透明なマニキュアで密閉します。
    注:カバーガラスの端を密封することは、共焦点画像を撮影する際に卵室が取り付け溶液の内部に流れるのを防ぐために必要です。
15. 次の設定を使用して共焦点顕微鏡で画像を取得します: 対物レンズ = 10倍の倍率;数値絞り = 0.8;DAPI 発光波長 = 410−513 nm。

Results

PRECOGポータルを使用してステップ1で説明した手順を用いて、卵巣癌におけるNOTCH2、NOTCH3、およびMAML1のZスコアが得られた(それぞれ1.3、2.32、1.62)。 負のZ\u2012score値は、3つの遺伝子の発現レベルが高い患者の全体的な生存率が悪いことを示しています。スプレッドシート ソフトウェアの条件付き書式を使用すると、Z\u2012score 値が図 1の色付きの棒グラフに表示されます。

CSIOVDB データベースを使用して結果を確認しました。ステップ2の指示を用いて、NOTCH2、NOTCH3、およびMAML1をCSIOVDBデータベース検索領域に順次入力し、「生存」タブの下にある患者の生存データを取得した。 全生存データに加えて、CSIOVDBは無病生存率

Discussion

バイオインフォマティクスの利用には数え切れないほどのアプローチや手法があるので、一般の方がオンラインで利用できるデータベースは数多くあります。これらの各データベースから豊富な情報を抽出できますが、特定の入力に基づいて患者の生存期間を評価するなど、特定の目的に最適な情報があります。異なる個々のデータベースから取得したデータの系統的な分析は、重要な科学的知見を説得力を持って生み出すことができます。

現在の分析は、バイオインフォマティクスアプローチの利用を通じて卵巣癌におけるノッチシグナル伝達の役割に焦点を当てています。例えば、PRECOGポータルデータベース上のMeta-Z分析は、臨床癌研究における患者の生存結果を示すZスコアを得るために使用された。CSIOVDBは、卵巣癌患者の生存結果を研究するために使用された別のメタ分析データベースです。CSIOVDBデータは、NOTCH2、NOTCH3、およびMAML1が患者全体の生存に不可欠であるというPRECOGポータルからの所見を正常に検証しました。その後、GENTおよびCCLEデータベ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩)	Invitrogen	D1306	1:1000 希釈
PBS、リン酸緩衝生理食塩水、10X 粉末、pH 7.4	ThermoFisher	FLBP6651	ddH2Oで溶解して1X PBS
ヤギ血清	Gibco	16210064	血清
胚皿	電子顕微鏡科学	70543-45	解剖皿
ナットミキサーフィ	ッシャーブランド	88861041	ニューテ
ーターtj-Gal4、Gal80ts / CyO;UAS-NICD-GFP/ TM6B	フロリダ州立大学のウーミン・デン博士	N/A	フライストック
w*;UAS-mam.A	ブルーミントン ショウジョウバエ ストック センター	#27743	フライ ストック
w[1118]	ブルーミントン ショウジョウバエ ストック	センター#5905	フライストック
PRECOG ポータル	スタンフォード大学	precog.stanford.edu	がん発現データセットの公開データベース
CSIOVDB	シンガポールがん科学研究所	csibio.nus.edu.sg/CSIOVDB/CSIOVDB.html	卵巣がんの研究に使用されるマイクロアレイデータベース
正常組織および腫瘍組織(GENT)ポータル	生物科学バイオテクノロジー研究所(KRIBB)	medical–genome.kribb.re.kr/GENT	腫瘍組織と正常組織に分けられた多様な組織にわたる遺伝子発現データの公開データベース。
ブロード研究所 がん細胞株百科事典 (CCLE)	ブロード研究所とノバルティス生物医学研究所	portals.broadinstitute.org/ccle	ヒトがん細胞株のゲノムプロファイルと変異を提供
cBioPortal	メモリアル スローンケタリングがんセンター (MSK)	cioportal.org	研究者が遺伝子変異とシグナル伝達ネットワーク
を検索できるポータルZeiss 710 倒立共焦点顕微鏡	カールツァイス	ID #M 210491	蛍光標識標本の検査と画像収集