このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

インビタル顕微鏡で評価されたマウスにおけるクレマスター筋の白血球浸潤

7.8K 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/60509

⸱

2020年4月15日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neonatology, Heidelberg University Children's Hospital

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、マウスクレマスター筋の毛細管後小胞に対して生体内顕微鏡を行う方法を示す。炎症および敗血症の異なるモデル、特にケモカインおよびサイトカインによって誘発されるものに一般的に適用され、我々は誇張された筋白血球浸潤を伴うムスコロパシーの研究におけるその関連性を強調する。

要約

インビボでの白血球採用カスケード内の生理学的および病態生理学的プロセスを監視するために、生体内顕微鏡(IVM)が広く使用されています。現在のプロトコルは、マウスの無傷の生物内の骨格筋由来組織における白血球のリクルートに至る白血球内皮相互作用を可視化する実用的で再現可能な方法を表す。このモデルは、顆粒球活性化と疾患におけるその役割に焦点を当てた研究のすべての分野に適用可能です。

私たちは、メソッドをガイドし、潜在的な落とし穴や技術的な困難を強調するために、ステップバイステッププロトコルを提供します。このプロトコルは、実験設定および必要な材料、マウスの麻酔、クレマスター筋の解剖、気管および頸動脈のカヌレーション、IVM記録およびオフライン分析をカバーする。接着白血球、転がりフラックス(RF)および転がりフラックス分率(RFF)のようなデータフォーマットは詳細に説明され、適切な適用が議論される。ジストロフィン欠損mdxマウスの代表的な結果は、結果セクションに提供される。

IVMは、インビボの設定で白血球の採用を評価するための強力なツールです。しかしながら、例えば内皮および白血球機能を解いて、流れチャンバ実験のようなex vivoのセットアップとの組み合わせを必要とするかもしれない。さらに、対象となる動物の遺伝的背景は、ベースラインの採用に大きな影響を与え、提供されるプロトコルの個々の微調整を必要とする。その制限にもかかわらず、IVMは、インビトロ所見を生きている脊椎動物生物に容易に翻訳するためのプラットフォームとして機能する可能性があります。

概要

インビタル顕微鏡(IVM)は、白血球生物学の分野で一般的に適用されるツールです。白血球のリクルートは、白血球の捕獲、圧延および接着によって開始された明確に定義された事象のカスケードに続き、最後に白血球の炎症部位へのトランスマイグレーションおよび飛散1.各ステップは、様々なケモカイン(例えば、IL-8/CXCL8)、受容体(例えば、LFA-1、Mac-1)および対応する内皮細胞接着分子(例えば、ICAM-1、VCAM-1およびE-Selectin)2、3によって媒介および制御される。2,3異なる調節部位の相互作用により、進行糖化末端製品の受容体様に白血球採用カスケードの制御因子およびメディエーター(RAGE)、細胞間接着分子1(ICAM-1)、C-X-Cモチーフリガンド(CXCL)1/2およびそれらの受容体CXCR2をIVM4、5、6、7、8、9を用いて発見した。4,5,6,7,8,9

IVMの方法は、腸10、皮膚11、リンパ節12、胚黄身袋1113等のような多くの異なる器官および組織について説明されている。しかし、IVMの最も広く研究されている方法は、クレマスターモデルであり、まずラット14に記載される。ラット15にまだ使用されているが、この方法は、異なるトランスジェニックラインの豊富さのために、今日では主にマウスに適用されている。我々のグループは最近、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)がジストロフィン欠乏mdxマウス16を研究するような炎症性ムスコロパシーの分野におけるクレマスターIVMの潜在的な役割を強調した。薄い織り交ぜられた容易に利用できる繊維組成物のために、クレマスター筋肉は光または蛍光顕微鏡を使用して全体の台座として研究される理想的な候補筋肉を表す。白血球の募集および外挿は主に毛細血管後の小胞で行われ、クレマスター筋の連続的な筋肉層で容易に同定することができる。

インビボイメージングの他のインビトロアッセイと比較した利点は、生体におけるその生物学的文脈である。同時に、変化した白血球の採用に対する細胞特異的寄与を非行化するには、フローチャンバーや内皮アッセイのような追加のインビトロモデルが必要になる可能性がある。複数のメソッドを組み合わせて使用すると、最も説得力のあるデータが得られます。外科手術は白血球の人身売買や採用の増加につながるため、科学者はクレマスターモデルの限界を認識する必要があります。したがって、ベースライン採用はこの方法で見積もることは困難です。その広範なアプリケーションにもかかわらず、cremasterのIVMは困難であり、新しいセットアップは確立に時間とリソースを要する可能性があります。IVM の一般的なミスを回避するのに役立つ簡単なプロトコルを提供します。また、制限事項について説明し、適用可能な場合は無料の方法が強調表示されます。

クレマスターのIVMは、炎症性および感染性研究の分野で実施される理想的なアプローチを表す。より具体的には、cremasterモデルは、炎症性疾患の文脈で骨格筋生物学を研究している科学者に高い関心を持つ可能性があります。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

動物はIBF(インターファクルテア・バイオメディジンリッチェ・フォルシュンツェインリヒトゥン)、ハイデルベルクで制御され、特定の病原体のない状態で収容された。ここに記載されているすべての手順は、地元のIRBとドイツのバーデン・ヴュルテンベルク州のドイツのドイツのレジエルングスプラエシジウム・カールスルーエによって承認されました。

1. 麻酔投与

  1. 腹腔内(i.p.)125mg/kgケタミンおよび12.5mg/kgキシラジンのボーラス注射によってマウスを麻酔する。
  2. マウスを下に置き、加熱パッドの下方向リカンベント位置に固定して、マウスの体温(36.5~38°C)を維持します。前歯の周りに単純なループを巻き、縫合糸の接合端を加熱パッドにテープで貼り付けるには、非吸収性の無菌縫合糸(6/0)を使用します。この固定は、呼吸の乱れを避けるために口を開いたままにしておく事を目的としている。
  3. マウスの麻酔の適切な深さを、デジタル間のつまみ(離脱は見られない)で確認してください。
  4. 十分な麻酔に達したら、手術の準備に進みます.30分ごとに進行中の実験に沿って麻酔を繰り返し確認する。
  5. 生理塩溶液(PSS、組成物:132 mmol/L NaCl、4.7 mmol/L KCl、1.2ミリモル/L MgS0 4、2.0ミリモル/L CaCl2、18 mmol/L NaHCO3)を5%CO2 /95%N2で15分間平衡化する。422実験全体を通して5%CO22/95%N2でPSSを連続的に泡立て、37°Cに保ちます。2

2. 気管と頸動脈の外科的準備(オプション)

  1. 正中線にピンセットで優しく引っ張って、首の部分から皮膚を解剖します。はさみを使用して直径1〜2cmの円形カットを適用し、外科手術の準備に十分なスペースを与えます。
  2. ピンセットを使用して、周囲の筋肉、脂肪、結合組織を慎重に解剖します。
  3. 小さな外科用ハサミを使用して気管に横断カット(約1.3mm)を作り、上部気道を固定するために気管の尾端の内側にポリエチレンチューブ(I.D x O.D.0.0.0.0.0.0.0.0.0.050")を導入します。
  4. 気管内にあるチューブを単一の円形ノット縫合(6/0 USP)で固定します。
  5. 気管の右側に沿って頸動脈を見つけ、頸動脈壁から周囲の組織を解剖する。あるいは、頸部または尾静脈をi.v.アクセスに使用することもできる。迷走神経の損傷を避けるようにしてください, それは密接に位置しています.
  6. 頸動脈の下に縫合糸(6/0)を2個入れ。頸動脈の分岐に近い最初の頭蓋縫合を近くに置き、永久に結ぶ。第2縫合糸は、最初のものから約5〜8ミリメートルの遠位に位置し、後で頸動脈のチューブを固定するために使用されます。まだ結びついないでください。
  7. ポリエチレンチューブ(I.D x O.D. 0.011" x 0.024")を、末端部を生理食音(0.9%NaCl)で満たされた1mLシリンジ針に曲げて30cmの長さで調製します。準備中に空気塞栓を防ぐためには、厳密なフラッシュが重要です。
  8. 7 mm の容器クリップを使用して、第 2 縫合糸の頸動脈を遠位にクランプします。
  9. 頸動脈に小さな横切り(約0.5mm)を行い、滅菌ポリエチレンチューブを導入します。前に準備した第2縫合糸を使用して、動脈内のチューブを固定します。
  10. 容器クリップを取り外し、ポリエチレンチューブに接続された注射器に少し張力を加えます。この頸動脈カテーテルは、必要に応じて薬物を投与したり、血液サンプルを採取したりするために使用することができ、それぞれのデバイスで血圧や脈拍数のモニタリングも可能です。

3. クレマスター筋の手術準備

  1. 後の顕微鏡のためにステージを保持するカスタムメイドのプラスチックフレームに(加熱パッドと一緒に)加熱パッド上のマウスを転送します。マウスの陰嚢を顕微鏡ステージに向けて向けます。
    1. 先に進む前に麻酔の深さを再評価します。必要に応じて麻酔の4分の1〜半用量を再投与する。
  2. 陰嚢を局部化し、ピンセットを使用して最も遠位の部分に保持し、そっと引っ張り、直径約5mmの陰嚢皮膚の円形部分を切断します。クレマスター筋肉などの基礎構造に害を与えないようにしてください。開いた組織を生理食塩水でよく水分補給してください。
  3. 2つのピンセットを使用して緩い結合組織を解剖し、両方の精巣を局所化する。
  4. 1つのテストを遠回しに保持し、穏やかにそれを引き出し始め、周囲の結合組織を段階的に取り除きます。
  5. 精巣が外側に出されたら、その遠位端をステージを囲むゴムリングに固定します。外装時に、全体のプロセス中に生理食塩水で組織を水和します。
  6. 重要なステップ:基礎となるクレマスターの筋肉に害を与えることなく、結合組織を慎重に除去します。過剰な結合組織は、後の顕微鏡で視力を妨げ、ぼやけた画像を生成する可能性があります。
  7. 精巣の遠位部分を固定し、小さな横切り(約1mm)でクレマスター筋肉を開き、続いて非常に遠位から近位端までの縦切開を行います。その結果、クレマスターの筋肉は球状に開くはずです。これは、流体力学に影響を与える可能性があるため、マクロスコープで目に見える血管を切断すべきではありません。
  8. 慎重にガラスのステージの上に筋肉を広げ、ゴムリングに固定します。顕微鏡検査はここで行われるので、中央領域に触れたり害を与えたりしないようにしてください。
    注意: 過剰なストレッチは、血流を妨げる可能性があります。
  9. 残りのテストを脇に固定して、関心のある領域にアクセスします。PSSを繰り返し湿らせ、乾燥を防ぎます。取り付けられた筋肉は今顕微鏡の準備ができています。

4. 生体内顕微鏡

  1. 取り付けられたクレマスターの筋肉を直立した顕微鏡に入れ、40xの目的を用いて顕微鏡を行う。
  2. 高スループットのイメージングスペクトルを使用してデータを取得し、エクスポートします。
  3. PSS17を予熱(35-37 °C)で連続的な重ね合わしの下で録音を行う。顕微鏡の直立目的にテープで留められた小さなチューブで重ね合わせて、筋肉組織に目的と一緒にPSSの連続滴下を可能にします。
  4. 毛細管後の小胞(2つの小さい血管の合流)を特定し、直径20~40μmの小胞の微小循環を測定します。
  5. 30 s の時間範囲でクレマスター筋肉からの微小循環の高解像度画像を記録します。記録中に筋肉組織のわずかな収縮と弛緩があるかもしれないので、焦点を継続的に調整してください。一般的に、マウスは約2時間安定した循環を示す傾向がある。異なる地域から異なる血管のいくつかの記録を取得することが可能です。その後、一方または両方のテストを使用できます。
    注:これは炎症のモデルであるため、誘導の一般的な方法は、全身的な適用またはプロ炎症性メディエーターの局所的な陰嚢注射だけでなく、例えばN-フォルミルメチオニル-ロイシルフェニルアラニン(fMLP)との重ね合わしです。局所TNF-α刺激は、白血球の採用を引き起こすために一般的に使用されます。LPS誘導性内毒素症は、SIRS重篤な全身性炎症のモデルである。

5. 白血球の可視化

注: 接着性および転がり白血球は、さらなる可視化なしで容易に見ることができる。自由に動く白血球の中心線速度を決定するために、微分染色を行う。

  1. eGFP標識マウスを用いる場合は、蛍光顕微鏡で直接分析する。
  2. 非eGFP標識マウス株の場合は、ローダミン染色を使用してください。
    1. 0.2 mg/kg体重でローダミン6Gを投与する。反復投与は、十分な染色強度を達成するために必要とされ得る。大きいボリュームが血行力学パラメータに影響を与える可能性があるため、少量は必ず保管してください。
    2. 白血球の即時染色のために、頸動脈を介して染色を投与する。頸動脈解離が行われていない場合、i.p.の適用により十分な染色が達成され得る。頸動脈カテーテル法の代替として、他の静脈カテーテル法を行うことができる。
      注:ロダミン染色は、eGFP標識とは異なり、蛍光強度の時間減衰と、より高濃度の白血球の約80%の全体的な染色最大値を示していることに注意してください。
    3. 蛍光顕微鏡で自由に動くローダミン染色白血球を可視化します。

6. 実験終了

注: このプロトコルの全体推定所要時間は 90 分から 150 分です。

  1. 頸椎脱臼による安楽死の実験を終了する。
  2. トランスマイグレーションなどのさらなる分析では、PFAのクレマスター筋肉を固定しながら、ステージ上で引き伸ばされ、必要に応じて占体に染まられます。

7. オフライン分析

  1. ビデオ再生中に単純なカウントとして、次のパラメータを分析します。
    1. 転がり流束を計算する [数/分]: 虚数線/分を通過する転がるセルの数
    2. 接着性を計算する[数/mm2]:視野内の血管壁に接着する細胞の数≥ 30 s/血管表面[mm2]。
  2. ImageJを用いて測定した以下の血行力学および微小血管パラメータを測定する。
    1. 内壁径として容器径[μm]を計算します。
    2. 容器の中心線長として容器長[μm]を計算します。
    3. 自由に動く白科学方程式の速度測定のためのマイクロメートル/秒記号[μm/s]。血球を中心線で動かすフレーム間ビデオ解析から得られる中心線速度を計算する。
  3. 次の方程式を推定として使用します。
    1. [mm2]:血管長 [μm] x 容器径 [μm] x π x 10-6で血管表面を計算する。
    2. 壁せん断速度静的平衡解析;ΣFx=0 記号;コンセプトイラスト;物理学教育。を計算する: 4.9 x (8 x 中心線速度科学方程式の速度測定のためのマイクロメートル/秒記号[μm/s]。x 0.625/容器径 [μm])。
    3. 平均血流速度科学方程式の速度測定のためのマイクロメートル/秒記号[μm/s]。を計算する : 中心線科学方程式の速度測定のためのマイクロメートル/秒記号[μm/s]。速度 x 0.625.
    4. 総白血球フ実験データ解析のための毎分数の単位で速度測定を表した式ラックスを計算する: 全身白血球数ラボ計算で使用されるマイクロリットルあたりの数[数/μL]単位での濃度測定。x(平均血流速度科学方程式の速度測定のためのマイクロメートル/秒記号[μm/s]。x 60/1000)x π x. 血管径の計算式、微小血管の測定と分析のための図。
    5. 転がり流束分率[%]:転がり流束/全白血球フラックスx 100を計算します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

提供されたプロトコルに従ってIVMは骨格筋の白血球の徴用のカスケードに独特な洞察をもたらす。結果セクションでは、IVM によって得られる一般的な結果に焦点を当て、発生する可能性のある問題を強調します。

生体内顕微鏡の実験セットアップの概要を図1に示します。クレマスター筋肉の調製と結合組織の除去は、均一な表面を有する焦点を合った顕微鏡画像を得るために重要である。過剰な結合組織は、IVMを実行するときに、最終的にぼやけた顕微鏡画像(補足ビデオ1)につながります。図2は、IVMを用いて得ることができる代表的な顕微鏡画像を示す。まず、直径20~40μmの毛細血管後の小胞は、2つの小さな血管の合流によって識別されます。接着性および転がり白血球のみが視覚化することができ、循環白血球は記録されたビデオのスローモーション再生でのみ追跡することができる。付着性白血球の数は、30秒間の静止白血球と定義され、血管表面のmm2あたり...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

IVMは、さまざまな器官の異なる細胞型を研究するために広く使用されており、広く説明され、議論されてきた19.この研究の主な目的は、クレマスター筋肉でIVMをセットアップし、実行するための効率的なアプローチを提供することです。この方法を実践すれば、信頼性が高く再現性の高い結果が得られます。したがって、計画と標準化は、技術を習得するための重要な要素です。とりわけ、この技術は血行力学的および微小血管パラメータに非常に依存しており、注意深く監視し、制御する必要がある。したがって、グループ間の異なるヘモダイナミクスは誤解を招く結果をもたらす。

生理学的および病理学的状態を研究する役割にもかかわらず、IVMだけでは、炎症における白血球のリクルートに対する特定の細胞タイプの個々の寄与を完全に解明できない可能性がある。これを行うには、他の補完的な方法をIVMと組み合わせてもよい。例えば、流れチャンバー実験のようなex vivo法は、内皮または白血球の効果の間に線引し得る。また、フローチャンバーは、例えば新生児20<...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この研究は、PRIMALコンソーシアムの一環として、ドイツ連邦教育研究省(BMBF)01GL1746Eによって支援されました。著者らは、ブリッタ・ヘックマンとシルビア・ペザーが巧みな技術支援を認めている。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Material
Ketanest SPfizer Pharma GmbHPZN:08509909麻酔。ジェネリック/ IUPAC名:ケタミン
キシラジンCP-Pharma GmbHArticle-nr.:1205 麻酔。ジェネリック/ IUPAC名:キシラジン(hidrochlorideとして)
生理食塩水B.ブラウンメルズンゲン PZN 02737756外科的製剤。ジェネリック/ IUPAC名:塩化ナトリウム
シリンジ針オムニカンF.ブラウンメルズンゲン 手術準備9161502 REF 
縫合糸 6/0 USPResorbaREF 4217手術用製剤 
ポリエチレンチューブ#10 BD GmbHサプライヤー No. 427401手術用製剤 
ポリエチレンチューブ#90 BD GmbHサプライヤーNo.427421手術用製剤 
ローダミン6Gシグマ-アルドリッチケミーGmbHCAS番号989-38-8 白血球染色。ジェネリック/ IUPAC名:エチル2-[3-(エチルアミノ)-6-エチルイミノ-2,7-ジメチルキサンテン-9-イル]安息香酸
セットアップ装置
直立顕微鏡 オリンパス BX51W1顕微鏡
40倍対物レンズ ZeissAchroplan 40 × /0.80 W顕微鏡 ImSpector
softwareLavision Biotec GmbHver. 4.0.469software
ImageJNational Institute of Health, USAver. 1.51j8software

参考文献

  1. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
  2. Zanardo, R. C. O., et al. A down-regulatable E-selectin ligand is functionally important for PSGL-1-independent leukocyte-endothelial cell interactions. Blood. 104 (12), 3766-3773 (2004).
  3. Woodfin, A., et al. ICAM-1-expressing neutrophils exhibit enhanced effector functions in murine models of endotoxemia. Blood. 127 (7), 898-907 (2016).
  4. Frommhold, D., et al. RAGE and ICAM-1 cooperate in mediating leukocyte recruitment during acute inflammation in vivo. Blood. 116 (5), 841-849 (2010).
  5. Braach, N., et al. RAGE controls activation and anti-inflammatory signalling of protein C. PloS One. 9 (2), 89422(2014).
  6. Frommhold, D., et al. RAGE and ICAM-1 differentially control leukocyte recruitment during acute inflammation in a stimulus-dependent manner. BMC Immunology. 12 (1), 56(2011).
  7. Braach, N., et al. Anti-inflammatory functions of protein C require RAGE and ICAM-1 in a stimulus-dependent manner. Mediators of Inflammation. 2014, 743678(2014).
  8. Girbl, T., et al. Distinct Compartmentalization of the Chemokines CXCL1 and CXCL2 and the Atypical Receptor ACKR1 Determine Discrete Stages of Neutrophil Diapedesis. Immunity. 49 (6), 1062-1076 (2018).
  9. Smith, M. L., Olson, T. S., Ley, K. CXCR2- and E-selectin-induced neutrophil arrest during inflammation in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 200 (7), 935-939 (2004).
  10. Emre, Y., Jemelin, S., Imhof, B. A. Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time. Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).
  11. Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear. Microvascular Research. 19 (3), 374-379 (1980).
  12. von Andrian, U. H. Intravital microscopy of the peripheral lymph node microcirculation in mice. Microcirculation. 3 (3), New York, N.Y. 287-300 (1996).
  13. Hudalla, H., et al. LPS-induced maternal inflammation promotes fetal leukocyte recruitment and prenatal organ infiltration in mice. Pediatric Research. 84 (5), 757-764 (2018).
  14. Grant, R. T. Direct observation ok skeletal muscle blood vessels (rat cremaster). The Journal of Physiology. 172 (1), 123-137 (1964).
  15. Thiele, J. R., Goerendt, K., Stark, G. B., Eisenhardt, S. U. Real-time digital imaging of leukocyte-endothelial interaction in ischemia-reperfusion injury (IRI) of the rat cremaster muscle. Journal of Visualized Experiments. (66), e3973(2012).
  16. Kranig, S. A., et al. Dystrophin deficiency promotes leukocyte recruitment in mdx mice. Pediatric Research. 11, 4457(2019).
  17. Bagher, P., Segal, S. S. The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation. Journal of Visualized Experiments. (52), e2874(2011).
  18. Reichenbach, Z. W., Li, H., Gaughan, J. P., Elliott, M., Tuma, R. IV and IP administration of rhodamine in visualization of WBC-BBB interactions in cerebral vessels. Microscopy Research and Technique. 78 (10), 894-899 (2015).
  19. Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. Intravital microscopy in historic and contemporary immunology. Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).
  20. Nussbaum, C., et al. Neutrophil and endothelial adhesive function during human fetal ontogeny. Journal of Leukocyte Biology. 93 (2), 175-184 (2013).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

白血球動員マウスモデル内皮細胞相互作用ローリングフラックス接着白血球総頸動脈カニューレ挿入気管カニューレ挿入
インビタル顕微鏡で評価されたマウスにおけるクレマスター筋の白血球浸潤
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。