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方法論記事

マウスにおけるインフルエンザAウイルス感染時のT濾胞ヘルパー細胞と胚葉センター応答の評価

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DOI:

10.3791/60523

⸱

2020年6月27日

 ,  ,  , 
1CAS Key Laboratory of Molecular Virology and Immunology, Institut Pasteur of Shanghai, Chinese Academy of Sciences, University of Chinese Academy of Sciences, 2School of Life Science, University of Science and Technology of China, 3State Key Laboratory of Cell Biology, CAS Center for Excellence in Molecular Cell Science, Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, Chinese Academy of Sciences, University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本論文では、インフルエンザウイルス感染のマウスモデルにおけるTfhおよびGC B応答を評価するプロトコルについて説明する。

要約

T濾胞ヘルパー(Tfh)細胞は、生殖中心(GC)の開発および高親和性抗体の生成に関する助けを提供することに特化した独立したCD4+T細胞サブセットです。インフルエンザウイルス感染では、強力なTfhおよびGC B細胞応答が誘導され、効果的なウイルス根絶を促進し、Tfh関連研究のための適格なマウスモデルを与える。本論文では、マウスにおけるインフルエンザウイルス感染時のTfh関連免疫応答の基本的な検出におけるプロトコルについて述べた。これらのプロトコルは、含まれます: インフルエンザウイルスの鼻内接種;フローサイトメトリー染色とポリクローナルおよび抗原特異的Tfh細胞の分析, GC B細胞および形質細胞;GCの免疫蛍光検出;血清中のインフルエンザウイルス特異的抗体の酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)これらのアッセイは、基本的にインフルエンザウイルス感染におけるTfh細胞の分化と機能を定量化し、分化メカニズムおよび操作戦略の解明に関する研究に役立つ。

概要

最近の10年間、新たに同定されたCD4+T細胞サブセット、Tfh細胞サブセットに多数の研究が焦点を当てられており、胚中心(GC)Bの開発におけるその本質的な役割について。B細胞リンパ腫6(Bcl6)は、主に遺伝子リプレッサーと考えられているが、Bcl6の異所性発現がTfh分化を促進するのに十分であるという証拠に対するTfh細胞の系統定義因子であり、Bcl6の欠乏は消失したTfh分化1、2、3をもたらす。炎症部位への移行によってエフェクター機能を実行する他のCD4+Tヘルパーサブセットとは異なり、Tfh細胞は、主に脾臓およびリンパ節のB細胞濾胞帯においてB細胞の助けを提供する。共刺激分子ICOSとCD40Lは、TfhとGC B細胞との相互作用において重要な役割を果たす。Tfh分化の間、ICOSは、同結合B細胞から必要なシグナルを伝達し、B細胞ゾーン局在4,5に対する傍観者B細胞からの移行シグナルを受け取る受容体としても機能する。CD40Lは、B細胞の増殖および生存のためのTfh細胞からのシグナルのメディターである6.CD40Lと同様の役割を果たすもう一つの要因は、主にTfh細胞によって分泌されるサイトカインIL21である。IL21はGC B細胞の高親和性抗体の開発と産生を直接調節するが、Tfh分化におけるその役割は依然として議論の余地がある7,8である。現在、フローサイトメトリー分析でTfh細胞を同定する際に最も頻繁に使用されているPD-1およびCXCR5は、このサブセットの分化と機能においても重要な役割を果たしています。CXCR5は、B細胞濾胞ケモカインの受容体であり、B細胞卵胞9におけるTfh細胞の局在化を媒介する。PD-1は、濾胞誘導機能を有するだけでなく、GCB細胞親和性成熟10の過程で臨界信号を伝達することも同定された。これらの知見に基づいて、これらの分子の発現を評価することは、基本的にTfh細胞の成熟および機能を反映することができる。

GCは、二次リンパ器官における誘導過渡的な微小解剖学的構造であり、Tfh細胞に非常に依存し、Tfh応答を評価するのに最適な読み出しである。GCにおいて、サイトカインおよび共刺激分子によって媒介される信号を受信した後、B細胞はクラススイッチングおよび体細胞ハイパー突然変異を受けて高親和性抗体11を生成する。差動抗体クラス切り替えは、微分サイトカインニッチで起こり、IL4およびIL21はIgG1クラス切換を誘導し、IFNγはIgG2クラススイッチング12を誘導する。形質細胞は分泌された抗体の生産者であり、末端分化細胞である。Tfh細胞と同様に、GCにおけるB細胞の発達は、多くの重要な分子の動的発現と関連している。現在の研究に基づいて、GC B細胞はB220+PNA+Fas+またはB220+GL7+Fas+Fas+細胞および形質細胞と同定することができ、その前駆体と比較して、B220の発現を下方調節し、CD138発現13をアップコンジェクツする。さらに、これらの特性の両方をフローサイトメトリーおよび免疫蛍光分析において検出することができ、よってGC応答の適切な評価が行われる。

強い細胞および体液性応答は、インフルエンザウイルス感染において誘導され、TfhおよびTh1細胞がCD4+ T細胞応答を支配し、Tfh細胞分化研究に最適なモデルとなる。インフルエンザA/プエルトリコ/8/34 H1N1(PR8)は、一般的に使用されるマウス適応株であり、この研究では14、15、16によく使用される。ここでは、インフルエンザウイルス感染におけるTfh研究関連アッセイの基本的なプロトコルについて説明します: 1) PR8ウイルスの鼻腔内接種;2)抗原特異的Tfh細胞、GC Bおよび形質細胞およびIL21検出とフローサイトメトリーを用いた;3) GCの組織学的可視化;4)ELISAによる血清中の抗原特異的抗体抗体の検出。これらのプロトコルは、Tfh関連研究の新しい研究者に必要な技術を提供します。

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プロトコル

動物実験は、中国上海のパスツール研究所の施設動物ケアと使用委員会によって承認されました。すべての実験は、制度的動物管理および使用委員会が承認した動物プロトコルに基づいて行われた。

注:マウスのウイルス感染および臓器の隔離はABSL2状態下で行われるべきである。

1. PR8インフルエンザウイルスの接種とマウスの体重の記録

  1. ABSL2室で感染するために8週齢の雄C57BL/6マウスを準備する。
    注:このプロトコルは、雌マウスの実験にも適しています。
  2. PR8ウイルスの希釈:-80°C冷凍庫からウイルスを取り出し、液体に溶けるまで氷の上でインキュベートする。ストックウイルスを徹底的にボルテックスし、無菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS、135 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO 4、1.8 mM KH2PO4)を冷却済みの1.5 mLチューブで2PFU/μLに希釈します。
  3. マウス麻酔: 各マウスの重量を量り、使用するペントバルビタールナトリウム(2mg/mL)の体積(4倍(μL)のマウス重量(g)を計算します。ペントバルビタール腹腔内ナトリウムの計算された体積を注入する。
    注:このステップは、マウスが着実かつ平和的に呼吸するようにして、ウイルスの正確な刺激を鼻腔内に接種することです。ハートビートが速すぎるか遅すぎると、不適切な麻酔が行なえなくなることを示します。また、眼の乾燥を避けるために獣医軟膏の使用が推奨されます。
  4. 鼻腔内接種: 希釈PR8ウイルスを徹底的に渦液化する。ピペット10μLと慎重に一方のサイドドロップで鼻腔内接種を行います。この側の1つのケージ(最大5匹のマウス)内のすべてのマウスの接種を終えた後、反対側に接種を繰り返します(マウスの呼吸を穏やかで、接種を通して安定してください)。各マウスは、合計でPR8ウイルスの40 PFUに感染しています。
  5. より良い復活のために暖かいケージに胸骨の債務にマウスを置きます。
  6. マウスの体重を毎日 10 日間監視します。(感染日は0日目として記録されます)。

2. 脾臓リンパ節からのリンパ球の分離(mLN)

  1. マウス安楽死:小さなチャンバーにマウスを入れて、チャンバーの底から平和的にCO2 にポンピングすることによってマウスを安楽死させる。マウスが動かないときにマウスを取り出し、子宮頸部脱臼を行い、マウスが完全に死ぬことを保証する。75%エタノールでマウスを浸し、バイオセーフティフードに移します。
  2. 吸収性紙で覆われた解剖フォームプレートに解剖針でマウスを固定化します。腹部の中線と後ろ足に沿って皮膚を解剖ハサミで切り、ピンセットで皮膚を伸ばします。伸ばした皮膚を解剖針で固定化します。
  3. 各マウスのための2つの6 cmの皿を準備し、氷の上に保ちます。各皿に70μmの細胞ストレーナーを入れ、1%の胎児ウシ血清(DMEM(1%FBS)で補ったDMEMの5 mLを加える
  4. 脾臓分離:腹膜を切断し、腹腔を解剖ハサミで露出させる。脾臓を取り、準備した皿に入れます。
  5. mLN分離:胸腺の近くにダイヤフラムとケージリブの底をカットします。肋骨を脇に引っ張り、解剖針でピン留めして胸腔を露出させなさい。肺を右側に引き出し、ピンセットを使用してmLNを服用し、心臓の下と気管の腹側付近に取ります。
  6. 準備した皿にmLNを入れます。
  7. 単一細胞懸濁液を得る:70-μm細胞のストレーナーを通して3 mLシリンジのプランジャーと穏やかに脾臓またはmLNを噛み付く。新鮮なDMEM(1%FBS)の1 mLで細胞ストレーナーをすすいでください。細胞懸濁液を再懸濁し、15 mL遠心管に移します。
  8. 細胞懸濁液を4°Cで6分間350xgで遠心分離する。 上清を取り除き、DMEM(1%FBS)を1 mL追加します。
  9. 細胞ペレットを1 mL-ピペットで十分に再懸濁します。4 mLのDMEM(1%FBS)を脾臓細胞懸濁液に加え、次の操作のために氷の上に保管します。
    注:ペレットから単一細胞を完全に単離するためには、まず1mLの培地で細胞ペレットを再懸濁する必要があります。
    このステップ以降、すべての操作は通常の実習で実行できます。
  10. 脾臓細胞計数
    1. チューブを数回上下に回して細胞を再中断します。赤血球(RBC)のリシスバッファー(10 mMトリス-HCl pH 7.5、155mM NH4Cl)の90 μLに10 μLを取ります。室温(RT)で3分間インキュベートし、900 μLの冷たいPBSを加えて反応を終了させます。
    2. 4°Cで6分間400xgで遠心分離機を使用し、上清を除去します。100 μL の冷たい PBS で再中断します。10 μLの細胞を0.4%のトリパンブルーの10 μLに取り込み、ヘモサイトメーターで細胞を計る混合物から10 μLを取り出します。
    3. 計算: 通常の方法としてセルを計算します。簡単に言うと、ヘモサイトメーターの2つの斜めの角の正方形にセル番号を数え、各角の正方形のN1、N2を得る。5 mL細胞懸濁液の細胞濃度は、(N1+N2)/2 x 10 4/mLとして計算する必要があります。

3. PD-1およびCXCR5を用いたポリクローナルTfh細胞の免疫染色

  1. ビオチン抗CXCR5抗体で染色する。
    1. チューブを上下に回して細胞懸濁液を再中断します。FACSチューブに2 x 106 セルを取り込み、2 mLの染色バッファ(PBS(1%FBS、1 mM EDTA)を加えます。渦振動装置上の渦で洗浄します。
    2. 遠心分離機 350 x g で 6 分 4 °C. 上清を液体に注ぎ出して捨て、チューブの口を吸収性紙に2回浸します。
    3. 残渣液で細胞ペレットを緩めます。チューブホルダーにチューブを氷の上に置きます。
      注:残渣液の体積は約25μLです。
    4. 各チューブに0.2 μLの抗マウスCD16/CD32(Fc受容体ブロッカー)を加えます。チューブの底を軽くタップし、氷の上で10分間インキュベートします。
      注:各チューブの5μLの染色バッファーで希釈することにより、複数のサンプル用の抗体混合物を調製してください。混合物のレシピは、希釈(n/10+1)x 0.2 μL Fc受容体ブロッカー(n/10+1)x 5 μL染色バッファーにして調製し、各チューブに5.2 μLの混合物を加える必要があります。
    5. 0.3 μLのビオチン抗マウスCXCR5をチューブ底部をタップして、各チューブと渦の30 μLの染色バッファーに加えます。
      注: ステップ 3.1.4 で説明したように、混合を準備します。
    6. 30分間チューブをタップして、優しく細胞を再懸濁して氷の上で1時間インキュベートします。
      注:30分で渦は、より良い染色のための細胞凝集を避けるためにです。
    7. 渦振動装置に2mLの染色バッファーと渦を加えます。4°Cで6分間350xgの遠心分離機を、ステップ3.1.2に記載されているように上清を捨てる。チューブをタップして渦を入れ、その後の染色のために氷の上でインキュベート。
  2. 他の表面マーカーで染色する。
    1. ステップ3.1.4に記載されたように抗体混合物(表1)を調製する。
    2. 各チューブに抗体混合物を加えます。チューブ底をタップして渦を30分間氷上でインキュベートします。
    3. 2 mLの染色バッファーで細胞を洗浄します。遠心分離機 350 x g で 6 分 4 °C.
    4. 上清を捨て、400 μLの染色バッファーを追加します。渦振動装置上のチューブをボルテックスし、フローサイトメトリー分析までチューブを暗く保ちます。

4. PR8インフルエンザウイルスNP特異的Tfh細胞の免疫染色

注: NP特異的なTfh細胞を染色するこのプロトコルは、以前の研究15、17からのものです。

  1. ステップ3.1で説明したビオチンCXCR5染色を行うが、染色のために採取した細胞数が3 x 106であり、フローサイトメトリーに記録される十分な抗原特異的細胞に対して106 個である。
  2. APC-コンジュゲート-IAbNP311-325 MHCクラスII(NP311-325)の0.3 μLを3.1.7からチューブに加えます。ステップ 3.1.4 のように、複数のサンプルの混合物を準備する
    注:CD4抗体と抗CD4抗体との結合が最適な四量体染色を妨げるため、抗CD4抗体を添加する前に四量体を染色することが重要です。
  3. チューブを軽くタップして細胞混合物を再懸濁し、RTで30分間暗闇の中でインキュベートします。
    注:蒸発を減らすには、チューブの口に濡れた紙をカバー
  4. 他の表面マーカー(表1)の混合物を加え、RTで30分間インキュベーションを続けます。
  5. ステップ 3.2.3 および 3.2.4 の説明に従って、細胞を洗浄して再中断します。

5. ポリクローナルTfh細胞におけるBcl6の免疫染色

  1. 表面マーカー(表2)をセクション3に記載したとおりに染色するが、最後に2mLのPBSで洗浄することを除き、緩衝液を染色する。
  2. 遠心分離機 350 x g で 6 分 4 °C. 上清を捨て、チューブの底を軽くタップして細胞ペレットを再中断します。
  3. 3.7%ホルムアルデヒド溶液(PBSで37%ホルムアルデヒドから希釈)の300 μLをチューブに加え、細胞固定を行います。渦振動装置の渦を20分間RTでインキュベートする。
  4. 洗浄用の2mLの染色バッファーを加え、4°Cで6分間500 x gで遠心分離機を加えます。 上清を捨て、チューブを軽くたたいて細胞を再中断します。
  5. 0.2%Triton-X 100の300 μLを加え、渦振動装置の渦によって細胞を再懸濁させます。RTで15分間インキュベートします。
  6. 洗浄用の染色バッファーを2 mL追加します。遠心分離機 500 x g で 6 分 4 °C. 上清を捨て、チューブの底を軽くたたいて細胞を再中断します。
  7. 各チューブに1.5 μLのPE-抗Bcl6抗体を加えます。チューブの底を軽くタップして混合物を再中断し、RTで2時間インキュベートし、30分ごとにチューブを軽くタップします。
    注:チューブの口に濡れた紙を覆い、混合物の蒸発を減らしてください。
  8. チューブに0.01%トリトンX 100を添加したPBSの2 mLを追加します。ボルテックスと遠心分離機を500xgで、4°Cで6分間
  9. ステップ5.8として洗浄を繰り返します。400 μLの染色バッファーで細胞を再懸濁します。フローサイトメトリー分析まで、細胞を氷の上で暗く保ちます。

6. IL21の細胞内染色

  1. PMA(12-ミシテン酸13-アセテート)とイオノマイシンを使用して細胞を刺激する。
    1. 脾臓細胞の懸濁液から2 x 106 細胞を取り、遠心分離機を350 x gで4°Cで6分間服用します。 上清を捨て、完全なT細胞培地の500 μLで細胞ペレットを再懸濁します。細胞を24ウェルプレートに移します。
    2. 完全な媒体18 の500 μLに20 nmol PMAおよび2 μmolイオノマイシンを加え、上下にピペットを入れて十分に混ぜます。
    3. ステップ6.2で調製した溶液を24ウェルプレートのセル懸濁液に加え、プレートを振って混合する。PMAとイオノマイシンを細胞に加えずに500 μL完全T細胞培地を添加することにより、非刺激制御を設定します。CO2インキュベーターを37°Cで4時間インキュベートします。
    4. 10 μmol BFA(ブレフェルディンA、メタノールで溶解)を各ウェルに加え、ゴルジ装置を介在させたタンパク質輸送を遮断する。プレートを細胞インキュベーターに戻し、2時間インキュベートします。
  2. セル表面マーカー染色を行います。
    1. 上下に軽くピペットを使用して細胞を再中断し、FACSチューブに細胞を移します。1 mLの染色バッファーをチューブに加え、遠心分離機を350 x gで4°Cで6分間加えます。
    2. Fc受容体ブロッカー染色をステップ3.1.4として行う。
    3. PBSの2mLで細胞を洗浄する以外のステップ3.2.1〜3.2.3に記載されているように、細胞表面マーカー染色(表3)を行う。
    4. 遠心分離機 350 x g で 6 分 4 °C. 上清を捨て、チューブの底をタップして細胞を再中断します。
  3. ライブ/デッドフィクタブルアクアデッドセル染色キットから0.2 μLの試薬を追加し、RTで10分間暗い場所でチューブをインキュベートして死んだ細胞の染色を行います。
  4. 2 mLのPBSをチューブに加え、渦振動装置の渦を加えます。4°Cで6分間350xgの遠心分離機を使用し、上清を捨てます。
  5. ステップ 5.3 および 5.4 の説明に従って、セル固定を実行します。
  6. 300 μLの染色バッファーを加えて細胞を再中断し、チューブを一晩4°Cの冷蔵庫に保管します。4°Cで6分間500xgの遠心分離機を用い、上清を除去する。
    注: この手順は省略でき、手順 6.5 以降の手順 6.7 に進みます。
  7. 1 mL のサポニンバッファー (0.2%(w/v) サポニンを補った染色バッファー) をチューブに加え、渦振動装置の渦を加えます。細胞透過を行うために20分間氷上でインキュベートする。
  8. 4°Cで6分間500xgの遠心分離機を使用し、上清を捨てます。
  9. 各チューブに0.5μLのヒトFc-IL21受容体を加えます。抗体混合物をステップ3.1.4として複数に調製するが、染色バッファーの代わりにサポニンバッファーを有する抗体を希釈した。
  10. 30分間細胞を再中断するためにチューブ底を軽くたたいてRTで1時間インキュベートします。
  11. 2 mLのサポニンバッファーを加えて、細胞を洗浄し、遠心分離機を 500 x g で 6 分間洗浄します。上清を捨て、一度洗い流しを繰り返します。
  12. 各チューブに0.1 μLのAPC-抗ヒトIg(H+L)を加えます。ステップ3.1.4として複数のサンプルの混合物を調製するが、染色バッファーの代わりにサポニンバッファーを有する抗体を希釈すること。
  13. サンプルを氷の上で30分間インキュベートし、ステップ6.11として洗浄します。
  14. 400 μLの染色バッファーで細胞を再懸濁します。フローサイトメトリー分析まで、氷の上でサンプルを暗く保ちます。

7. GC Bおよび形質細胞染色

  1. 細胞を取り、3.1.1から3.1.4までのステップとして抗Fc受容体抗体染色を行う。
  2. インキュベーション時間が1時間ではなく30分であることを除いて、3.1.5から3.1.7までのステップとして表面マーカー染色(表4)を行います。
  3. 400 μLの染色バッファーで細胞を再懸濁します。フローサイトメトリー分析まで、氷の上でサンプルを暗く保ちます。

8. 血清を血液から分離する

  1. 14日目の感染後(d.p.i 14)は、顔面静脈から血液を採取し、血液サンプルを一晩4°C冷蔵庫に保管します。
    注:ABSL2状態で採血を行い、このステップ以降、すべての手順を通常のラボで行うことができました。
  2. 4°Cで10分間400xgで血液を遠心分離する。 赤細胞の汚染を避けるために、200 μL ピペットで血清を慎重に分離します。アリコートは各サンプルに対して3本のチューブに入れ、-80°Cで保存します。

9. ELISAによるHA特異的抗体抗体のアッセイ

  1. ELISAプレートに2μg/mL HAタンパク質溶液を50 μLのウェルでコーティングし、4°C冷蔵庫で一晩インキュベートします。
  2. PBS希釈0.05%トゥイーン(PBST)を200 μLで3回洗浄します。100 μLのPBST希釈5%スキムミルクを各ウェルに加え、RTで2時間インキュベートして非特異的結合をブロックします。
  3. 血清希釈およびインキュベーション:希釈緩衝液としてPBSに3%BSAを調製する。希釈バッファーで血清を 1:50、 1:150、 1:450、....1:36450(3倍シリアル希釈が推奨されます)希釈した血清を50μLずつウェルに加え、4°Cの冷蔵庫で一晩インキュベートします。
  4. 血清を捨て、各ウェルに200 μLのPBSTを加えて井戸を1回素早く洗います(柔らかく振ってから捨てます)。その後、200 μLのPBSTをそれぞれ5分間3回、シェーカーでゆっくりと洗浄します。
  5. 全IgG、IgM、IgG1、IgG2b、IgG2c(1:5000、PBSTで希釈)に特異的なHRP標識二次抗体の100μLを加え、RTで1時間インキュベートします。9.4に記載されているようにPBSTでプレートを洗浄します。
  6. 4 °CストレージからバッファAとバッファB(TMB)の等量を取り出し、使用前にRTで少なくとも30分間ウォームアップしてください。AとBを混ぜて、各ウェルに100 μLのTMBを加え、柔らかく振ってRTで10〜30分間インキュベートします。
    注:これはTMB基質試薬セット(BD,555214)マニュアルの簡単な説明です。
  7. ピペット100μLの2MH2SO4を各ウェルに入して反応を終了させた。計測器を通じて OD450 値を読み取ります。
  8. データ分析:バックグラウンド信号(空の井戸のOD450値)を減算して、最終的なOD450値を取得します。各サンプルの抗体アイソタイプに対応する曲線を、X軸に希釈係数、Y軸にOD450値を使用して描画します。

10. ヒストロジー

  1. d.p.i 10で脾臓を分離します。3.7%ホルムアルデヒド溶液をRTで1時間固定し、3回シェーカーで5分間PBSで洗浄します。
  2. 4°Cで4°Cで脾臓(10%スクロース)を脱水し、4°Cで乾燥させ、脾臓が15mLチューブの底に沈むまで柔らかく揺れる。
  3. 脱水した脾臓を取り出し、最適な切断温度化合物に埋め込み、凍結切断します。
  4. アセトンを-20°Cで予冷してください。 前チルドアセトンで組織切片を10分間インキュベートします。PBSで3回洗浄します。
  5. 0.2%トリトンX-100を20分間含有するPBSで組織切片を透過し、PBSで3回洗浄します。
  6. RTで10%正常なヤギ血清(ブロッキングバッファー)を10%含有するPBSで非特異的結合をブロックし、PBSで組織切片を1回洗浄する。
  7. ストレプトアビジン/ビオチンブロックキットで非特異的結合をブロックします。
    注:このステップ以降、サンプルを乾燥させないでください。
  8. 一次抗体による染色:ブロッキングバッファー希釈ビオチン-PNA(25 μg/mL)とラット抗マウスIgD(2.5 μg/mL)を組織切片に慎重に加えます。4°C冷凍庫で一晩湿ったチャンバーに組織切片をインキュベートします。
  9. 迅速にPBSTで組織の切片を一度洗います。PBSTの組織切片を5分間ゆっくりと振って素早く洗います。3回洗い出します。
  10. 希釈アレクサフルオール488-ストレプトアビジン(1:500)とアレクサフルオール555ヤギ抗ラットIgG(1:500)抗体をブロッキングバッファ付きで、慎重に組織切片に追加します
  11. RTで1時間インキュベートする。
  12. ステップ10.8として組織切片を洗浄し、慎重に延長溶液でマウントします。慎重にカバーリップで組織を覆い、共焦点分析まで4°Cで暗く保ちます。
  13. GC の反応の大きさを分析するには、エリアサイズあたりの GC 数を数えます。

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結果

インフルエンザウイルス感染におけるマウス罹患率の特徴
インフルエンザウイルス感染後、マウスは重度の体重減少によって反映される病気による活性および拒食症が少なく、マウスの罹患率19を監視するために一般的に使用される症状である。図1aに示すように、PR8ウイルス感染マウスは6日目に体重を減らし始め、8日目に最高の損失レベルに達し、10日目に初期レベルに戻った。予想通り、PBS処理対照マウスでは、全期間を通して体重減少は認められなかった。インビボ症状の場合、ウイルス感染は、この場合のmLNの排水リンパ節における強いリンパ球の拡大をもたらす。したがって、PR8ウイルス感染マウスでは対照マウスよりも有意に大きなサイズのmRNが観察された(図1b)。まとめると、これらのマウスはすべて期待される症状を示し、その後のTfh関連免疫応...

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ディスカッション

高親和性抗体を生成するためのB細胞の助けを提供する上で専門的な役割を果たしているため、Tfh細胞はワクチン設計のための新しい戦略を提供するために分化および操作のメカニズムにおいて広範囲に研究されてきた。インフルエンザウイルス感染は、TfhおよびGC B細胞の応答を活発に誘導し、この分野の研究に適したモデルとなる。本論文では、鼻腔内接種によるインフルエンザウイルス感染のプロトコル、フローサイトメトリーによるTfh関連応答の評価、免疫蛍光およびELISAについて述べた。これらのアッセイは、Tfh分化、GC Bの開発およびインフルエンザウイルス特異的抗体の検出を促進し、研究者が免疫応答における新しい重要な分子を探索し、同定するのに役立ちます。

インフルエンザウイルス感染マウスモデルの研究では、体重減少はマウス罹患率の一般的に使用される指標です。インフルエンザウイルス感染マウスにおける期待体重変化動態は 、図1aに記載されているように、マウスに誘導された適切な免疫応答を反映している。しかし、異常な症例は定期的に起こり、マウスは体重...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

上海のパスツール研究所のフローサイトメトリー施設、ABSL2施設、SPF動物施設のスタッフの皆様に、技術的なアドバイスとアドバイスをいただき、ありがとうございました。この研究は、中国科学アカデミーの戦略的優先研究プログラム(XDB29030103)、中国国家キーR&Dプログラム(2016YFA0502202)、中国国立自然科学財団(31570886)によって支えられました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Tfh細胞、NP特異的Tfh細胞およびBcl-6
37%ホルムアルデヒドSigmaF1635
抗CD16/32マウスサーモフィッシャーサイエンティフィック14-0161-86
APC-conjugated-IAbNP311-325 MHC class II tetramerNIH
Bcl-6 PEBiolegend358504クローン:7D1
Biotin-CXCR5Thermo Fisher Scientific13-7185-82クローン:SPRCL5
CD4 Percp-eFluor 710Thermo Fisher Scientific46-0041-82クローン:GK1.5
CD44 eVolve 605Thermo Fisher Scientifi83-0441-42クローン:IM7
CD44 FITCThermo Fisher Scientifi11-0441-82クローン:IM7
CD62L FITCBD Pharmingen553150クローン:MEL-14
ICOS BV421Biolegend564070クローン:7E.17G9
PD1 PE/Cy7Biolegend135216クローン:29F.1A12
ストレプトアビジン BV421BD Pharmingen563259
Streptavidin PEBD Pharmingen554081
IL21
37% ホルムアルデヒドΣF1635
抗ヒト IgGジャクソン免疫研究所109-605-098
ブレフェルジン AΣB6542
ヒト FCc IL-21 受容体R&Dシステム
イオノマイシンSigmaI0634
生/死 固定可能なアクア 死細胞染色キットサーモフィッシャーサイエンティフィックL34966
PMASigmaP1585
サポニンMP102855
GC B および形質細胞染色
B220 APCサーモフィッシャーサイエンティフィック17-0452-81クローン:RA3-6B2
CD138 PEBD Pharmingen561070クローン:281-2
CD95 (FAS) PE/Cy7BD Pharmingen557653クローン:Jo2
IgD eFluor 450サーモフィッシャーサイエンティフィック48-5993-82クローン:11-26c
PNA FITCSigmaL7381
ELISA>
PR8-HASino Biological11684-V08H
BSASSBC
ヤギ抗マウスIg (SBA Clonotyping System-HRP)SouthernBiotech5300-05
ヤギ抗マウスIgM (SBA Clonotyping System-HRP)SouthernBiotech5300-05
ヤギ抗マウスIgG1(SBAクロノタイピングシステム-HRP)サザンバイオテック5300-05
ギ抗マウスIgG2b(SBAクロノタイピングシステム-HRP)サザンバイオテック5300-05
ギ抗マウスIgG2c(SBAクロノタイピングシステム-HRP)サザンバイオテック5300-05TMB
基質試薬セットBDファーミンゲン
<ストロング>組織学
Alexa Fluor 555-ヤギ-抗ラット IgGLife TechnologyA21434
抗マウス IgDBiolegend405702
ビオチン化 PNAVector laboratoriesB-1075
dilute Alexa Fluor 488-streptavidinLife TechnologyS11223
正常なヤギ血清SouthernBiotech0060-01
プロロングゴールド退色防止試薬サーモフィッシャーサイエンティフィックP3630
ストレプトアビジン/バイオチンブロッキングキットベクターラボラトリーズSP-2002
の免疫染色 によるHA特異的抗体価のアッセイ<ヤヤ555214

参考文献

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