本論文では、インフルエンザウイルス感染のマウスモデルにおけるTfhおよびGC B応答を評価するプロトコルについて説明する。
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方法論記事
マウスにおけるインフルエンザAウイルス感染時のT濾胞ヘルパー細胞と胚葉センター応答の評価
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
T濾胞ヘルパー(Tfh)細胞は、生殖中心(GC)の開発および高親和性抗体の生成に関する助けを提供することに特化した独立したCD4+T細胞サブセットです。インフルエンザウイルス感染では、強力なTfhおよびGC B細胞応答が誘導され、効果的なウイルス根絶を促進し、Tfh関連研究のための適格なマウスモデルを与える。本論文では、マウスにおけるインフルエンザウイルス感染時のTfh関連免疫応答の基本的な検出におけるプロトコルについて述べた。これらのプロトコルは、含まれます: インフルエンザウイルスの鼻内接種;フローサイトメトリー染色とポリクローナルおよび抗原特異的Tfh細胞の分析, GC B細胞および形質細胞;GCの免疫蛍光検出;血清中のインフルエンザウイルス特異的抗体の酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)これらのアッセイは、基本的にインフルエンザウイルス感染におけるTfh細胞の分化と機能を定量化し、分化メカニズムおよび操作戦略の解明に関する研究に役立つ。
概要
最近の10年間、新たに同定されたCD4+T細胞サブセット、Tfh細胞サブセットに多数の研究が焦点を当てられており、胚中心(GC)Bの開発におけるその本質的な役割について。B細胞リンパ腫6(Bcl6)は、主に遺伝子リプレッサーと考えられているが、Bcl6の異所性発現がTfh分化を促進するのに十分であるという証拠に対するTfh細胞の系統定義因子であり、Bcl6の欠乏は消失したTfh分化1、2、3をもたらす。炎症部位への移行によってエフェクター機能を実行する他のCD4+Tヘルパーサブセットとは異なり、Tfh細胞は、主に脾臓およびリンパ節のB細胞濾胞帯においてB細胞の助けを提供する。共刺激分子ICOSとCD40Lは、TfhとGC B細胞との相互作用において重要な役割を果たす。Tfh分化の間、ICOSは、同結合B細胞から必要なシグナルを伝達し、B細胞ゾーン局在4,5に対する傍観者B細胞からの移行シグナルを受け取る受容体としても機能する。CD40Lは、B細胞の増殖および生存のためのTfh細胞からのシグナルのメディターである6.CD40Lと同様の役割を果....
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プロトコル
動物実験は、中国上海のパスツール研究所の施設動物ケアと使用委員会によって承認されました。すべての実験は、制度的動物管理および使用委員会が承認した動物プロトコルに基づいて行われた。
注:マウスのウイルス感染および臓器の隔離はABSL2状態下で行われるべきである。
1. PR8インフルエンザウイルスの接種とマウスの体重の記録
- ABSL2室で感染するために8週齢の雄C57BL/6マウスを準備する。
注:このプロトコルは、雌マウスの実験にも適しています。 - PR8ウイルスの希釈:-80°C冷凍庫からウイルスを取り出し、液体に溶けるまで氷の上でインキュベートする。ストックウイルスを徹底的にボルテックスし、無菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS、135 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO 4、1.8 mM KH2PO4)を冷却済みの1.5 mLチューブで2PFU/μLに希釈します。
- マウス麻酔: 各マウスの重量を量り、使用するペントバルビタールナトリウム(2mg/mL)の体積(4倍(μL)のマウス重量(g)を計算します。ペントバルビタール腹腔内ナトリウムの計....
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結果
インフルエンザウイルス感染におけるマウス罹患率の特徴
インフルエンザウイルス感染後、マウスは重度の体重減少によって反映される病気による活性および拒食症が少なく、マウスの罹患率19を監視するために一般的に使用される症状である。図1aに示すように、PR8ウイルス感染マウスは6日目に体重を減らし始め、8日目に最高の損失レベルに達し、10日目に初期レベルに戻った。予想通り、PBS処理対照マウスでは、全期間を通して体重減少は認められなかった。インビボ症状の場合、ウイルス感染は、この場合のmLNの排水リンパ節における強いリンパ球の拡大をもたらす。したがって、PR8ウイルス感染マウスでは対照マウスよりも有意に大きなサイズのmRNが観察された(図1b)。まとめると、これらのマウスはすべて期待される症状を示し、その後のTfh関連免疫応.......
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ディスカッション
高親和性抗体を生成するためのB細胞の助けを提供する上で専門的な役割を果たしているため、Tfh細胞はワクチン設計のための新しい戦略を提供するために分化および操作のメカニズムにおいて広範囲に研究されてきた。インフルエンザウイルス感染は、TfhおよびGC B細胞の応答を活発に誘導し、この分野の研究に適したモデルとなる。本論文では、鼻腔内接種によるインフルエンザウイルス感染のプロトコル、フローサイトメトリーによるTfh関連応答の評価、免疫蛍光およびELISAについて述べた。これらのアッセイは、Tfh分化、GC Bの開発およびインフルエンザウイルス特異的抗体の検出を促進し、研究者が免疫応答における新しい重要な分子を探索し、同定するのに役立ちます。
インフルエンザウイルス感染マウスモデルの研究では、体重減少はマウス罹患率の一般的に使用される指標です。インフルエンザウイルス感染マウスにおける期待体重変化動態は 、図1aに記載されているように、マウスに誘導された適切な免疫応答を反映している。しかし、異常な症例は定期的に起こり、マウスは体重.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
上海のパスツール研究所のフローサイトメトリー施設、ABSL2施設、SPF動物施設のスタッフの皆様に、技術的なアドバイスとアドバイスをいただき、ありがとうございました。この研究は、中国科学アカデミーの戦略的優先研究プログラム(XDB29030103)、中国国家キーR&Dプログラム(2016YFA0502202)、中国国立自然科学財団(31570886)によって支えられました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Tfh細胞、NP特異的Tfh細胞およびBcl-6 | |||
| 37%ホルムアルデヒド | Sigma | F1635 | |
| 抗CD16/32マウス | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 14-0161-86 | |
| APC-conjugated-IAbNP311-325 MHC class II tetramer | NIH | ||
| Bcl-6 PE | Biolegend | 358504 | クローン:7D1 |
| Biotin-CXCR5 | Thermo Fisher Scientific | 13-7185-82 | クローン:SPRCL5 |
| CD4 Percp-eFluor 710 | Thermo Fisher Scientific | 46-0041-82 | クローン:GK1.5 |
| CD44 eVolve 605 | Thermo Fisher Scientifi | 83-0441-42 | クローン:IM7 |
| CD44 FITC | Thermo Fisher Scientifi | 11-0441-82 | クローン:IM7 |
| CD62L FITC | BD Pharmingen | 553150 | クローン:MEL-14 |
| ICOS BV421 | Biolegend | 564070 | クローン:7E.17G9 |
| PD1 PE/Cy7 | Biolegend | 135216 | クローン:29F.1A12 |
| ストレプトアビジン BV421 | BD Pharmingen | 563259 | |
| Streptavidin PE | BD Pharmingen | 554081 | |
| IL21 | |||
| 37% ホルムアルデヒド | Σ | F1635 | |
| 抗ヒト IgG | ジャクソン免疫研究所 | 109-605-098 | |
| ブレフェルジン A | Σ | B6542 | |
| ヒト FCc IL-21 受容体 | R&Dシステム | ||
| イオノマイシン | Sigma | I0634 | |
| 生/死 固定可能なアクア 死細胞染色キット | サーモフィッシャーサイエンティフィック | L34966 | |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| サポニン | MP | 102855 | |
| GC B および形質細胞染色 | |||
| B220 APC | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 17-0452-81 | クローン:RA3-6B2 |
| CD138 PE | BD Pharmingen | 561070 | クローン:281-2 |
| CD95 (FAS) PE/Cy7 | BD Pharmingen | 557653 | クローン:Jo2 |
| IgD eFluor 450 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 48-5993-82 | クローン:11-26c |
| PNA FITC | Sigma | L7381 | |
| ELISA> | |||
| PR8-HA | Sino Biological | 11684-V08H | |
| BSA | SSBC | ||
| ヤギ抗マウスIg (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| ヤギ抗マウスIgM (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| ヤギ抗マウスIgG1(SBAクロノタイピングシステム-HRP) | サザンバイオテック | 5300-05 | |
| ギ抗マウスIgG2b(SBAクロノタイピングシステム-HRP) | サザンバイオテック | 5300-05 | |
| ギ抗マウスIgG2c(SBAクロノタイピングシステム-HRP) | サザンバイオテック | 5300-05TMB | |
| 基質試薬セット | BDファーミンゲン | ||
| <ストロング>組織学 | |||
| Alexa Fluor 555-ヤギ-抗ラット IgG | Life Technology | A21434 | |
| 抗マウス IgD | Biolegend | 405702 | |
| ビオチン化 PNA | Vector laboratories | B-1075 | |
| dilute Alexa Fluor 488-streptavidin | Life Technology | S11223 | |
| 正常なヤギ血清 | SouthernBiotech | 0060-01 | |
| プロロングゴールド退色防止試薬 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | P3630 | |
| ストレプトアビジン/バイオチンブロッキングキット | ベクターラボラトリーズ | SP-2002 |
参考文献
- Johnston, R. J., et al. Bcl6 and Blimp-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation. Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).
- Nurieva, R. I., et al. Bcl6 mediates the development of T follicular helper cell....
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再版と許可
