方法論記事

ヘリアンサス・アンヌウスにおける大規模な熱画像スクリーニングによる植物蒸散の新規レギュレーターの同定

DOI：

10.3791/60535

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2020年1月30日

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1Department of Biology and Program in Molecular Biology, Pomona College

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

化合物ライブラリーの大規模スクリーニングにより、葉面蒸散起のモジュレーターを同定する方法を提供する。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

植物の生物的ストレスとアバイオティクスのストレスへの適応は、水の不足や病原体に応答して口孔の調節が重要な役割を果たす要因の様々なによって支配されています。したがって、口球運動を調節する小分子を同定することは、植物が環境に適応する生理学的基礎を理解するのに役立ちます。ストマタル運動の調節因子を同定するために使用されてきた大規模なスクリーニングアプローチには潜在的な限界があり、アブシジン酸(ABA)ホルモンシグナル伝達経路に大きく依存する人もいれば、ABAに依存するメカニズムを除くものもあれば、植物の成長や発達などの間接的で長期的な生理学的影響の観察に依存するものもあります。ここで提示されたスクリーニング方法は、熱イメージングによるそれらの蒸散の直接定量化と組み合わせた化学物質のライブラリーを有する植物の大規模な処理を可能にする。蒸散を通して水を蒸発させると、葉表面の冷却が生じるため、熱画像化は、時間の経過に伴う口内伝導の変化を調査するための非侵襲的なアプローチを提供します。このプロトコルでは、Helianthus annuus苗は水耕栽培され、根の供給によって処理され、そこで一次根が切断され、試験される化学物質に浸される。熱イメージングの後に、時間の経過に伴うコチレドン温度変化の統計解析により、口間開口を調節する生理活性分子の同定が可能になります。私たちの概念実証実験は、化学物質がカットルートからヒマワリ苗のコタイルドンまで10分以内に運ぶことができることを実証しています。また、植物をABAで正の対照として処理すると、数分で葉表面温度の上昇を検出できます。したがって、我々の方法は、口孔開口を調節する新規分子の効率的かつ迅速な同定を可能にする。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

植物におけるストレス耐性は、様々な分子、細胞、発達および生理学的特徴およびメカニズムの影響を受ける多原性形質である1.変動する環境の植物は、十分な水を維持し、病原体の侵入を防ぎながら、炭素の光合成需要のバランスをとるために、口球の動きを継続的に調節する必要があります。しかし、これらのトレードオフの「決定」がなされるメカニズムは、十分に理解されていません3.植物に生理活性分子を導入することは、生理学を調節し、調節の新しいメカニズムを探る上で役立ちます。

この小分子の大規模スクリーニングは、抗がん創薬および薬理学的アッセイにおいて、短時間で数百~数千の分子の生理学的効果を試験する有効な戦略である4,5。植物生物学において、ハイスループットスクリーニングは、例えば合成分子ピラバクチン6の同定に効果を示しており、また、アブシジン酸(ABA)7、8の長年の受容体の発見を示している。それ以来、ABA受容体のアゴニストおよびアンタゴニスト、およびABA誘導性レポーター遺伝子の発現を調節することができる小分子が9、10、11、12、13、14、15と同定されている。口蓋開口を調節できる小さな化合物を同定するために現在利用可能なハイスループットスクリーニングアプローチには、いくつかの欠点があります:(i)ABAシグナル伝達経路を中心に回転するプロトコルは、新しいABA独立メカニズムの同定を妨げる可能性があり、(ii)生理活性小分子の同定に使用される生体外戦略は、主に種子発芽または播種の成長に対する生理学的影響に依存する。

さらに、植物を生理活性分子で治療する方法はたくさんありますが、そのほとんどは口動の大規模な研究にはあまり適していません。簡潔に言えば、最も一般的な3つの技術は、噴霧または浸漬による葉面塗布、根系の治療、および根灌漑である。葉面の塗布は、葉面に液滴が存在すると大規模なデータ収集を妨げるため、口開度を測定する最も一般的で迅速な方法論とは互換性がありません。根灌漑の主な制限は、大きなサンプル量の要件、根圏の元素による化合物の潜在的な保持、およびアクティブなルート取り込みへの依存です。

ここでは、ABAや既知の干ばつ反応メカニズムを必ずしも伴わない新しい化合物を同定し、植物の効率的で信頼性の高い処理を可能にする大規模な方法を提示します。このシステムでは、Helianthus annuus植物は、水耕栽培された苗の主要な根を切断し、切断部位をサンプル溶液に浸す根を切断する根送りアプローチを使用して処理される。一度処理すると、植物の蒸散に対する各化合物の効果は、赤外線熱画像カメラを使用して測定される。葉面温度の主要な決定要因は葉からの蒸発速度であるため、熱画像データはストマタルコンダクタンスに直接相関させることができます。化学的処理後の葉面温度の相対的な変化は、このように植物の蒸散を定量化するための直接的な手段を提供する。

H.annuusは世界16の5つの最大の油糧種子作物の一つであり、この植物に直接行われた発見は、技術の将来の移転を容易にする可能性があります。さらに、H.アニュウス苗は、大きく平らなコチレドン、ならびにこのプロトコルの開発に理想的であった厚い一次根を有する。しかしながら、この方法は、他の植物および種々の化合物に容易に適合させることができる。

このプロトコルは、ストマタル閉包を引き起こす分子、またはストマタル開口部を促進することができる分子を効果的に同定するために使用することができ、これはストマタルコンダクタンスを調節する信号を理解し、環境への植物適応を理解するための大きな意味を持つ応力。

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プロトコル

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1. 植物の育成

  1. 4 cmの厚さの層のファインバーミクライトを標準の10 in.x 20 in(254 mm x 501 mm)の植物トレイに穴のないものに加えます。
  2. 植物トレイにシードホルダー(材料の表を参照)を2cm離して置きます。
  3. 種子ホルダーにバーミクライトを充填します。
  4. 各種子ホルダーに尖った端を下にしてヒマワリの種を置き、種子の半分が露出したままになるように押し下げる。
    注: ヒマワリの種は非対称であり、放射が現れるところから尖った端点は下向きにする必要があります。根と茎の方向が種子ホルダー内で不可能であるため、適切な種子配置が重要です。シードの丸い端部は、シードホルダーの上部を越えて伸びる必要があります。
  5. 種子が所定の位置に入ったら、さらに2cm厚さの高級バーミクライトの層でそれらを覆います。上から霧を出して水を。表面は1時間後に濡れたままであるべきです。その場合は、トレイを蓋で覆います。
  6. 成長室や温室で植物を育てます。推奨条件は、140 μmol光子・m-2・s-1の光強度と22°Cで16時間の光、20°Cで9時間の暗さ(5日間)です。
    注:水を入れる必要はありません表面が目に見えて乾燥した場合。

2. 水耕栽培システムのセットアップ

  1. 植物を水耕栽培に適したサイズの容器を見つける。容器のサイズは成長室または温室で利用可能なスペースに合わせるべきです。15cmの最小深度が推奨されます。
  2. 蒸留水で容器を充填し、製造業者によって示されるように一般的な水耕栽培肥料を追加します。得られた水耕液溶液は、空気ポンプと水ポンプを使用して達成することができる一定の動きで、通気する必要があります。
  3. 水耕栽培のフローターを準備します。
    1. 厚さ2cmの発泡ポリスチレン発泡体のシート(材料表参照)を容器の寸法にカットします。シートは藻類の成長を制限するために、容器の表面のほとんどをカバーする必要があります。木材燃焼ツールは、ポリスチレンフォームを切断するために有効であり、このプロトコルのために十分に汎用性があります。
      注意:ポリスチレンフォームの熱い切断中に放出される煙や蒸気は深刻な健康被害です。適切な呼吸保護を使用してください。ユーザーはまた、ヒュームフードの下で泡を切断することにより、換気要件を満たすことができます。
    2. 木材燃焼ツールを使用してポリスチレン発泡シートに穴(直径1〜2センチ)を作ります。2つの穴の中心間の距離は、実験のニーズに合わせて調整することができます。ただし、最小距離 2.5 cm をお勧めします。

3. 養液栽培への苗の移動と植物の成長

  1. 5日齢の苗をバーミクライトからそっと引き出し、水で満たされた容器に直ちに30分間移します。このステップは余分なバーミクライトを除去し、残りのペリカープを柔らかくする。新たに出現するプライマリ ルートが表示されます。
  2. コチレドンの将来の拡大を最適化するために必要な場合は、手で壁を取り除きます。
  3. シードホルダー内の苗をポリスチレンフォームフローターに移します。光強度140μmol光子・m-2・s-1、相対湿度65%、20°Cで20°Cで16時間光の光周期を20°Cで成長させます。

4. 治療前の準備

注:この手順は、10 mM MES-KOH(pH = 6.2)で100 μM ABA(pH = 6.2)、1%(v/v)ジメチルスルホキシド(DMSO)をそれぞれ陽性および陰性対照として含む10mM MES-KOH(pH = 6.2)を含む、三重の小さな化合物ライブラリから20個の化学物質をテストするためのものです。

  1. 十分な植物が処理の準備ができていることを確認します。治療の準備ができている植物は、完全に展開されたコチレドンを持っているのに十分に成熟する必要がありますが、横根の増殖が最小限であるほど若い。標準スクリーニングを行うためには、69のそのような植物が必要である。
  2. 80°C冷凍庫から小さな化合物を含む96ウェルプレートを取り出します。室温で解凍します。
  3. 1M KOHで6.2のpHに調整された10 mM MES-KOHバッファの80 mLを準備します。
  4. ラベルキャップレス2 mLマイクロチューブ。陰性対照処理のために少なくとも6本のチューブを準備します(10 mM MES-KOH(pH = 6.2)1%(v/v)DMSOを含む)。ABA処理には3本のチューブ(10 mM MES-KOH pH = 6.2)、陽性対照を用います。残りの60本のチューブを使用して、3重の20種類の化学物質の効果を分析します。
  5. 各化学物質の10 μL(DMSOでは10 mM)を3つの適切に標識されたチューブのそれぞれに移します。10 mM ABAのピペット10μLをDMSOに溶解して3本のチューブに、10 μLのDMSOを6本の制御管に溶解させた。
    注意: 自然に, いくつかの化合物は、深刻な健康への影響を引き起こす可能性があり、ユーザーは適切な保護措置を取る必要があります。.
  6. 69本の各チューブに10 mM MES-KOH(pH = 6.2)の990 μLを加えます。MESバッファーと化学物質を混合するのに十分な力でMESバッファーを分配しますが、化学物質やMESバッファーがチューブから噴出するほどの力を使用しないように非常に注意してください。あるいは、低速で渦。

5. 熱画像カメラのセットアップ

  1. 熱画像カメラをコピースタンドに取り付けます。すべてのケーブルをラップトップに接続します。
    注:記録は温度(20 °Cから25 °C)、湿度(50〜70%)の条件下で行われます植物の成長に使用されるものと同様の光品質(110~140μmol光子・m-2・s-1)
  2. カメラの電源を入れ、ラップトップをオンにし、熱画像解析ソフトウェアを開きます。
    メモ:記録の後続の手順は、使用する特定のソフトウェアに適用されます(資料の表を参照)。
  3. 録音設定を調整します。
    1. 中央のウィンドウの上部にある赤いレコードボタンの上にマウスを移動します。ドロップダウンメニューが表示されます。レンチアイコン「レコード設定」をクリックします。
    2. 適切なレコードモードとオプションを選択します。レコードは定期的にオプションを選択し、1 分に 1 フレームがキャプチャされ、手動ストップを使用できます。ソフトウェアがビデオを保存するファイルの保存先をメモします。[レコード設定]ウィンドウを閉じます。

6. プラントの準備と処理

  1. 化学物質を含むキャップレスチューブをチューブラックに入れる。あるいは、ポリスチレンフォームシートをカットし、カスタムチューブラックを作るために、ステップ2.3で説明したように木材燃焼ツールで突くことができます。各穴の直径は、しっかりと保持するために、キャップレスチューブの外径に非常に近い必要があります。
    注:カメラの視野は、キャップレスチューブを所定の位置に保持する方法を決定する際に考慮する必要がある制限要因です。
  2. 位置関連バイアス17を考慮して、ラック内の正と負の制御チューブと実験管を均等に分配する。
  3. 水耕栽培植物の隣に次の材料を準備する:マイクロディスセクションハサミ、水と浅い皿、繊細なタスクワイプ、異なる化学物質を含む69キャップレスチューブ。
  4. 処理するプラントごとに、次の手順を繰り返します。ヒマワリの芽は常に種子ホルダーに残ります。
    1. 慎重に種子ホルダーを持ち上げ、水を含む浅い皿に根を素早く浸します。
    2. 一次根を水中で切り、キャビテーションを防ぎます。切り傷は、種子ホルダーの最も基礎の端の下に0.8-1 cm発生する必要があります。
    3. 切り取りたての植物を化学物質を含むチューブの1つに差し込む。
    4. コチレドンに水滴がある場合は、繊細なタスクワイプで静かに乾かします。
      注: これらの 4 つの手順は、キネティックス スタディの不整合を防ぐために、できるだけ早く (10 分以下) 行う必要があります。
  5. 熱画像カメラの下に植物を移動し、すべての植物がカメラの視野内にあることを確認します。必要に応じて、カメラの高さとラックの位置を調整します。

7. 録音

  1. Ctrl + Alt + Aキーを押して、カメラをコタイレドンの表面に合わせます。
  2. 赤いボタンの上にマウスを置き、ムービーを記録するオプションをクリックします。録音を確認する新しいウィンドウが開きます。
  3. 1~2時間後に録音を停止します。
    注: ここでプロトコルを一時停止できます。

8. データ収集

  1. ファイルに移動|オープン |正しい .SEQファイルを開き、それを開きます。
  2. 映画の再生を停止します。
  3. メインウィンドウの左側で、測定カーソルのROI(3x3ピクセル)アイコンを追加をクリックします。ROI は、関心のある地域を表します。
  4. 最初の植物のコタイレドンの中心の上にマウスを置き、一度左クリックします。カーソル 1 が配置されます。手順を繰り返して、最初の植物の2番目のコタイレドンにラベルを付けます。ラベルの順序は注意する必要があります。
  5. 手順を繰り返します。すべての植物は、2つのカーソルでラベル付けする必要があります。
  6. [ROIの編集] アイコンをクリックします。メインウィンドウで左クリックして左上隅を押し、右下隅までスクロールしてすべてのROIを選択します。
  7. 統計ビューアアイコンの上にマウスを移動し、テンポラルプロットを選択します。新しいウィンドウが開きます。
  8. ムービーを実行します。グラフはデータを埋めます。
  9. このウィンドウで、右上隅にある二重矢印をクリックして新しいメニューを開きます。
  10. [保存] アイコンをクリックします。プロット(.csv) に X および Y の値として保存します。データがエクスポートされたら、ソフトウェアを閉じます。

9. データ分析

  1. データ分析ソフトウェア (Excel など) を使用して .csv ファイルを開きます。最初の 3 つの列 (A ~ C) は、フレーム番号、絶対時間、相対時間に関する情報を提供します。残りの列は、時間の経過に従って各ROIの温度を示します。
  2. 使用する統計ツールの性質を決定します。この決定は、実験計画を含むさまざまな要因に依存する。
    注: この例では、母集団の平均と母集団の標準偏差に基づいて、サンプルごとに標準スコア(Z スコア)が計算されます。各サンプルについて、z スコアから p 値が計算されます。この方法により、陽性および陰性のコントロールの確認と、さらにテストされる新しい化合物の同定が可能になります。

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結果

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赤い色素エリスロシンB(0.8 kDa)を用いた実験は、10分以内にヒマワリ苗のコタイレドンに切り根を通して目に見えて吸収される化学物質の能力を示しています(図1)。

植物をABAで処理すると、数分以内にヒマワリコチレドンで葉の温度の上昇が検出されます。この葉の温度の上昇は、口開きおよび口内伝導性の低下に関連している。10 μM ABA (p値 = 0.02) で処理した後、15 分、5 μM ABA (p 値 = 0.003) で 20 分の経過観察を行います (図 2)。全体として、これらの結果は、熱画像による葉の温度の測定がストマタル開口およびコンダクタンスを測定するための優れたプロキシであることを示している。

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ディスカッション

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所定の日にテストできる化合物の数は、主に(i)植物を成長させ、画面を実行するために利用可能な環境制御スペース、ならびに(ii)プロトコルのステップ6に関与することができる個体の数に依存する。統計的治療後の結果の解釈を統合するために、3つの実験反復を使用することをお勧めします。典型的な日には、1〜2人の個体が、例えば[60化学物質+6陰性(DMSO)コントロール+3陽性(ABA)コントロール]を午前、正午、午後に試験することにより、困難なく三剤中の60化合物をスクリーニングすることができる。

この方法は、完全に開発されたコチレドンを有する健康な苗に依存する。イメージングが上から起こるように、理想的な苗は、できるだけ多くの情報を収集するために、低ココチルとコチレドンブレードの間に90°の角度を示す必要があります。この角度は主に光によって調節されるため、成長条件を調整することで最適化する必要があります。我々の結果は、化学物質がコチレドンに到達するまでに約10分かかり、ABAなどの化学物質に反応するのにさらに数分かかることを示しています。この観察により、ステップ 6.4 はプロトコルの中で...

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開示事項

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著者たちは開示するものは何もない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、ポモナ・カレッジのスタートアップ・ファンドとヒルシュ・リサーチ・イニシネーション・グラント・ファンド(FJへ)、ポモナ・カレッジ分子生物学プログラム(恒星サマー・リサーチ・アシスタント・プログラム)によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
のない1020プラスチック成長トレイ標準10 x 20インチトレイ
2.0 mLマイクロチューブ、キャップレスジェネシーサイエンティフィック22-283NC
アブシジン酸(ABA)シグマアルドリッチA1049
エアポンプアクティブアクアAAPA7.8L2 アウトレット、3W、7.8 L/分
エアストーン
化合物ライブラリMicroSource DiscoveryNatural Product Collection
Creative Versa-Tool (薪焚き工具)Nasco9724549
ジメチルスルホキシド(DMSO)、植物細胞培養試験済みSigma-AldrichD4540
矮性黒点 ヒマワリの種Outsidepride.com
エリスロシン BSigma-Aldrich200964
水耕栽培肥料セット(FloraBloom、FloraGrow、FloraMicro)一般的な水耕栽培GL51GH1421.31.11
Kimwipesデリケートタスクワイパーキンバリークラークプロフェッショナル34155
ラップトップDell
MESハイドレートSigma-AldrichM2933
マイクロダイセクションはさみ
Microsoft Excelマイクロソフト
水酸化カリウム (KOH)Sigma-AldrichP5958
ResearchIR ソフトウェアFLIR
R-Tech 硬質ポリスチレンフォームボードインスルフォーム
シードホルダーアラポニックスN/A
スーパータブ (プラスチック製ユーティリティタブ)MaccourtST3608水耕栽培に使用される36 x 24 x 8インチの浴槽
T450sc LWIR(長波赤外線)ハンドヘルド熱画像カメラFLIRFLIR-T62101
水フィルターSunSunHW-304B Proキャニスターフィルター
排水穴ラップトップバーミキュライトに接続するために必要な充電ケーブルとUSBケーブルが付属しています

参考文献

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  1. Basu, S., Ramegowda, V., Kumar, A., Pereira, A. Plant adaptation to drought stress. F1000Research. 5, (2016).
  2. McLachlan, D. H., Kopischke, M., Robatzek, S. Gate control: guard cell regulation by microbial stress. The New Phytologist. 203 (4), 1049-1063 (2014).
  3. Leung, J., Bazihizina, N., Mancuso, S., Valon, C. Revisiting the Plant's Dilemma. Molecular Plant. 9 (1), 7-9 (2016).
  4. Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 188-195 (2011).
  5. Wigglesworth, M. J., Murray, D. C., Blackett, C. J., Kossenjans, M., Nissink, J. W. Increasing the delivery of next generation therapeutics from high throughput screening libraries. Current Opinion in Chemical Biology. 26, 104-110 (2015).
  6. Zhao, Y., et al. Chemical genetic interrogation of natural variation uncovers a molecule that is glycoactivated. Nature Chemical Biology. 3 (11), 716-721 (2007).
  7. Park, S. Y., et al. Abscisic acid inhibits type 2C protein phosphatases via the PYR/PYL family of START proteins. Science. 324 (5930), 1068-1071 (2009).
  8. Ma, Y., et al. Regulators of PP2C phosphatase activity function as abscisic acid sensors. Science. 324 (5930), 1064-1068 (2009).
  9. Cao, M., et al. An ABA-mimicking ligand that reduces water loss and promotes drought resistance in plants. Cell Research. 23 (8), 1043-1054 (2013).
  10. Okamoto, M., et al. Activation of dimeric ABA receptors elicits guard cell closure, ABA-regulated gene expression, and drought tolerance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 12132-12137 (2013).
  11. Rodriguez, P. L., Lozano-Juste, J. Unnatural agrochemical ligands for engineered abscisic acid receptors. Trends in Plant Science. 20 (6), 330-332 (2015).
  12. Kim, T. H., et al. Chemical genetics reveals negative regulation of abscisic acid signaling by a plant immune response pathway. Current Biology. 21 (11), 990-997 (2011).
  13. Ito, T., et al. Novel Abscisic Acid Antagonists Identified with Chemical Array Screening. ChemBioChem. 16 (17), 2471-2478 (2015).
  14. Ye, Y., et al. A Novel Chemical Inhibitor of ABA Signaling Targets All ABA Receptors. Plant Physiology. 173 (4), 2356-2369 (2017).
  15. Takeuchi, J., et al. Designed abscisic acid analogs as antagonists of PYL-PP2C receptor interactions. Nature Chemical Biology. 10 (6), 477-482 (2014).
  16. Rauf, S., et al. Progress in modification of sunflower oil to expand its industrial value. Journal of the Science of Food and Agriculture. 97 (7), 1997-2006 (2017).
  17. Caraus, I., Alsuwailem, A. A., Nadon, R., Makarenkov, V. Detecting and overcoming systematic bias in high-throughput screening technologies: a comprehensive review of practical issues and methodological solutions. Briefings in Bioinformatics. 16 (6), 974-986 (2015).
  18. Costa, J. M., Grant, O. M., Chaves, M. M. Thermography to explore plant-environment interactions. Journal of Experimental Botany. 64 (13), 3937-3949 (2013).
  19. Merlot, S., et al. Use of infrared thermal imaging to isolate Arabidopsis mutants defective in stomatal regulation. The Plant Journal. 30 (5), 601-609 (2002).

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