ここでは、インビボとインビトロの両方で好中球の移動および浸潤を評価する3つの方法を紹介する。これらの方法は、好中球移行を標的とする有望な治療薬を発見するために使用することができる。
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この記事について
サマリー
要約
好中球は、自然免疫系の主要なメンバーであり、病原体および病理的炎症反応に対する宿主防御において極めて重要な役割を果たす。好中球は、サイトカインとケモカインの指導を介して炎症部位にリクルートすることができます。好中球の圧倒的な浸潤は、関節リウマチ(RA)のような無差別組織損傷を引き起こす可能性があります。腹膜滲出物から単離された好中球は、規定の化学誘引剤、N-ホルミル-メット・レウフェ(fMLP)、インビトロイントランスウェルまたはジグモンドチャンバーアッセイに応答する。空気袋実験は、生体内のリポ多糖(LPS)に対する好中球の走化力を評価するために使用することができる。アジュバント誘発性関節炎(AA)マウスモデルはRA研究で頻繁に使用され、抗骨髄ペルオキシダーゼ(MPO)または抗好中球エラスターゼ(NE)抗体を有する関節切片の免疫組織化学的染色は、十分に確立された測定方法である好中球浸潤。これらの方法は、好中球移行を標的とする有望な治療法を発見するために使用することができる。
概要
好中球は最も豊富な白血球であり、ヒト1の白血球集団全体の50〜70%を占める。好中球は、急性炎症時の主要な応答者の1つである。好中球は、組織常駐細胞2、3、4によって放出されるサイトカインおよびケモカインの誘導を介して炎症部位にリクルートすることができるが、これは好中球と血管内皮細胞5の表面上の細胞接着分子との相互作用によって媒介される。好中球は、防御をホストする基礎であり、活性酸素種(ROS)および他の組織損傷分子3、6の放出を介して組織に損傷を与える強力な能力のために、病理的炎症反応の役割を果たす。
これまでの研究では、マウスまたはヒトからの好中球分離プロトコルをいくつか記載している。Ohら、ヒト好中球を全ヒト血液7から単離する密度勾配分離法を実証した。しかし、マウスの血液から十分な好中球の分離は、血液量が少ないため困難である。あるいは、マウス腹膜液から多数の純粋で生存可能なマウス好中球を引き出し、これらの精製された好中球は、好中....
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プロトコル
すべての実験手順は、北京中華医学大学動物ケアおよび使用委員会によって審査され、承認されました.
注:C57BL/6マウス(7〜8週齢)を使用した。
1. 好中球の分離
- 腹膜滲出細胞の取得
- ddH2Oで新鮮な10%プロテオースペプトン溶液を準備し、マウスの数に応じて必要な量を計算します。
注:マウスの数をN、(2N+1)mLの溶液をあらかじめ溶解し、濾過する必要があります。 - 70%エタノールでワークスペースをスプレーします。インスリンインジェクターを使用して、1 mLのペプトン溶液と排出気泡を描画します。
- マウス1回につき1mLのペプトン溶液の最初の腹腔内注射を行う。
- 片手でマウスを頭下の位置につかみます。アルコール漬けの綿球で注射スポットを消毒します。
注:好ましい注射位置は、腹部の左下または右象限の側面にあります。 - 試薬を迅速に注入する。インスリンインジェクターを使用して各マウスの腹腔に1 mLを注入する。
注:針と皮膚の間の角度は、腸や他の臓器を傷つけられないように、約15〜30°でなければなりません。
- 片手でマウスを頭下の位置につかみます。アルコール漬けの綿球で注射スポットを消毒します。
- 炎症反応を一晩で発症させる。12時間後、第1の注射と同様に第2の注射を行う。
- 2回目の....
- ddH2Oで新鮮な10%プロテオースペプトン溶液を準備し、マウスの数に応じて必要な量を計算します。
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結果
腹膜滲出細胞はマウスの洗浄液から採取した。細胞をRPMI-1640完全培地の1 mLで再懸濁し、2段階(54.8%/70.2%)に重ね合わせた不連続な密度勾配(図1A)、および30分間の1,500 x gで遠心分離し(≥95%、~1 x107好中球/マウス)下界面から回収した(図1B)。
空気パウチ実験を行い、LPSin vivoによって刺激された好中球のリクルートメントを調べた(図2A)。エアポーチの白血球サブセットを滲出物で測定した(図2B)。
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ディスカッション
末梢血7、骨髄および組織18からの高度に精製された好中球の詳細なプロトコルは、長い間利用可能であった。ここでは、成熟した好中球がさらなる抗炎症および抗酸化研究のために不活性化されたままである腹膜液19から好中球を分離する方法を採用する。
空気ポーチ実験を用い、LPSによる好中球のインビボの浸潤を調べた。この方法は、生体内の一般的な炎症環境における細胞浸潤を直接測定する電位の方法として提案されている。
エアポーチアッセイは、好中球の機能を器官非特異的な方法でしか示すだけで、白血球のリクルートカスケードのいくつかのステップを取り除くのは注目に値する。特定の臓器への好中球の採用は、異なる器官特性、接着分子、およびケモカインに依存することができるので、臓器特異的な状態で好中球の機能状態を探索することは、好中球が特定の疾患において潜在的に果たす役割を研究するために非常に重要である
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開示事項
著者たちは開示するものは何もない。
謝辞
この研究は、中国自然科学財団(助成金番号81430099および31500704)、国際協力交流プロジェクト(助成金番号2014DFA32950)、北京中国医学大学の研究プログラム(中国) によって支援されました(補助金番号BUCM-2019-JCRC006および2019-JYB-TD013)。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.1% Fast Green Solution | Solarbio | 8348b | つのバイアル中の 20 mg の高速グレン FCF を別の 100 mL ビーカーに移します。20 mL の H2O をビーカーに加え、攪拌して染色液を溶解して 0.1% 高速緑色溶液を作り、Nalgene PES 75mm フィルター |
| 0.1% サフラニン O 染色液 | Solarbio | 8348a | 1 バイアル中の 20 mg のサフラニン O 染色液を 100 mL ビーカーに移します。20 mL の H2O をビーカーに加え、攪拌して染色液を溶解して 0.1% サフラニン O 染色液を作り、Nalgene PES 75mm フィルター |
| 0.5 M エチレンジアミン四酢酸溶液 (EDTA)、pH 8.0 | シグマ | 324506 | 滅菌 |
| 100% エタノール | 北京化学工業 | ||
| 100% メタノール | 北京化学工業 | ||
| 15 mL円錐形ポリプロピレン遠心分離機チューブ | ファルコン | 14-959-53A | |
| 23 G x 1 1/4 "針 | BD | 305120 | |
| 26 G x 3/8 "針 | BD | 305110 | |
| 3%ウシ血清アルブミン(BSA) | 0.3 g BSAを10 mL PBSに溶解 | ||
| %H2O2 | 1 mL 30% H2O2 をメタノールと 9 mL メタノールと混合 | ||
| 3,3'-ジアミノベンジジン (DAB) キット | ZSGB-BIO | ZLI-9018 | |
| 30 G x 1/2" ニードル | BD | 305106 | |
| 30% H2O2 | Beijing Chemical Works | ||
| 5 mL シリンジ | BD | Z683574 | |
| 50 mL円錐ポリプロピレン遠心分離チューブ | Falcon | 14-432-22 | |
| 50%エタノール | ミックス 500 mL 100%エタノールと500 mL dH2O | ||
| 54.8% Percoll | Mix 2.74 mL SIP with 2.26 mL 1×PBS、静止 | ||
| 70% エタノール | ミックス 700 mL 100% エタノール with 300 mL dH2O | ||
| 70.2% Percoll | Mix 3.51 mL SIP with 1.49 mL 1×PBS、静止 | ||
| 80% エタノール | ミックス 800 mL 100% エタノール with 200 mL dH2O | ||
| 95% エタノール | ミックス 950 mL 100% エタノール with 50 mL dH2O | ||
| 酸性アルコール 超高速分化ソリューション | Beyotime | C0165S | |
| 抗体 | |||
| 抗ミエロペルオキシダーゼ抗体 | アブカム | ab208670 | |
| 抗好中球エラスターゼ抗体 | Abcam | ab21595 | |
| 自動血液分析装置 | Sysmex | XS-800i | |
| ウシ血清アルブミン (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| 完全フロイントのアジュバント、10 mg/ml | シグ | 1002036152 | |
| カバー スリップ | CITOGLAS | 10212432C | |
| ダイヤル厚さ計 | ミツトヨ | 7301 | |
| エッペンドルフ マイクロチューブ、1.5 mL | シグマ | Z606340 | |
| 胎児ウシ血清 (FBS) プレミアム | PAN | P30-1302 | |
| ガス麻酔システム | ZS Dichuang | ZS-MV-IV | |
| ヤギ 抗ウサギ IgG H&L (HRP) | PPLYGEN | C1309 | 免疫組織化学染色に用いる二次抗体です。 |
| ハンクスバランスソルトソリューション(HBSS) | バイオロジカルインダストリーズ、ベスハエメック、イスラエル | 02-016-1A | 滅菌 |
| ヘマトキシリン染色液 | ZSGB-BIO | ZLI-9609 | |
| ポ多糖(LPS) | シグマ | L3012 | |
| メディアとサプリメント | |||
| 修飾サフラニンO-fastグリーンFCF軟骨染色キット | Solarbio | G1371 | |
| N-ホルミル-メット-ロイ-PHE(fMLP) | シグマ | 47729 | |
| ペニシリンストレプトマイシン溶液、100回; | Invitrogen | 1514022 | |
| Percoll | GE Healthcare | 10245207 | 密度勾配培地 |
| 透過化バッファー | ミックス 100 μL Triton X-100 と 1 L dH2O で 0.01% Triton X-100 | ||
| リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、1× | 90%ddH2Oと10%(v / v)を10回混合します。PBS、オートクレーブ滅菌 | ||
| リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、10回; | NaCl 16 g、KCl 0.4 g、Na2HPO4·2H2O、0.48 g KH2PO4 (無水) 200 mL ddH2sub (無水)、pH 7.4 を調整、オートクレーブ滅菌プラスチック | ||
| 製品および機器粉末 | |||
| プロテオース ペプトン | オキソイド | 1865317 | |
| 回収バッファー | 18 mLの回収緩衝液Aと82 mLの回収緩衝液Bを混合し、dH2Oを1000 mLに加え、pHを6.0に調整 | ||
| IHC | 4.2 gのクエン酸(C6H5O7·200 mL dH2O) H<>sub2O) | ||
| 用回収緩衝液Bストック | 5.88 g クエン酸三ナトリウム二水和物 (C6H5Na3O7·2H20) in 200 mL dH2O | ||
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium | Sigma | R8758 | |
| RPMI-1640 Complete Medium | RPMI-1640 培地には、10% FBS と 1% ペニシリン/ストレプトマイシンが添加されています。 | ||
| Shu Rui U40 ディスポーザブル滅菌インスリン注射針 1 mL | BD | 328421 | |
| スライド | CITOGLAS | 10127105P-G | |
| SOLUTION | |||
| ストック アイソトニック パーコール (SIP) | コールの 90% (v/v) と 10% (v/v) を 10×PBS、 | ||
| エアポーチアッセイ | |||
参考文献
- Klein, C. Genetic defects in severe congenital neutropenia: emerging insights into life and death of human neutrophil granulocytes. Annual Review of Immunology. 29, 399-413 (2011).
- Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of Neutrophil Chemotaxis. A....
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