このプロトコルは、空間的に制御された好中球群を提供するバイオ粒子マイクロアレイを生成する。これは、好中球が移行中に放出するメディエーターに容易にアクセスでき、定量的な画像分析を可能にします。
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この記事について
サマリー
要約
好中球の群れは、好中球が感染部位を封鎖し、組織の再編成を促進する協調プロセスである。群れの特徴を示す動物モデルにおいて、細胞移動の特徴的なパターンを示す動物モデルにおいて、古典的に生体内で研究されている。しかし、in vivoモデルには、アクセスと分析が困難な細胞間メディエーター、およびヒト好中球を直接分析することができないなど、いくつかの制限があります。これらの制限のため、ヒト好中球で群りを研究し、群れの間に生成される分子信号に容易にアクセスできるin vitroプラットフォームが必要です。ここでは、多段階マイクロスタンププロセスを使用して、生体内感染を模倣して群れを刺激するバイオ粒子マイクロアレイを生成します。バイオ粒子マイクロアレイは、制御された安定した方法で群れを作る好中球を誘導する。マイクロアレイでは、好中球は速度が上昇し、バイオ粒子クラスターの周りに安定した群れを形成します。さらに、好中球によって生成された上清が分析され、16個のタンパク質が群れの過程で異なって発現されていたことが発見された。このインビトロ・ストウォーミング・プラットフォームは、再現性のある空間的に制御された方法で好中球の移動およびタンパク質放出を直接分析します。
概要
好中球は、血流1で最も豊富な白血球であり、潜在的な診断および治療標的として注目を集めている2,3は、色あさ4、敗血症、外傷5、6、癌1、7、8、および様々な自己免疫疾患5,9を含む様々な病状に関与する可能性があるためである。好中球の群れは、多段階で厳しく調節されたプロセスであり、複雑さを伴う複雑性を有し、研究5、10、11の特に興味深い焦点となっている。群れの間、好中球は周囲の健康な組織5、10、11
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プロトコル
著者らは、親切に献血した健康なボランティアを認めている。血液検体は、オハイオ州立大学の生物医学委員会によって審査#2018H0268機関審査委員会(IRB)プロトコルに従って、インフォームド・ボランティアの同意の後に得られました。
1. バイオ粒子マイクロアレイの微細加工
- 標準的なフォトリソグラフィ手順を使用して、マスターシリコンウエハを生成します。
- コンピュータ支援設計(CAD)ソフトウェアを使用して目的の設計の証明を生成し、フォトマスクの製造者に送って、クロームフォトマスクを作ります。ここで使用される設計は、150 μmの中央から中央の間隔で円で満たされた直径30μmの4ミリメートルの長方形配列です。この設計は、さまざまなアプリケーションに合わせて変更できます。
- シリコンウェーハ上に40μmの厚い層の陰性フォトレジストをスピンコートします。ウェハを65°Cで5分間、95°Cで10分間焼きます。
- 150~160 mJ/cm2のクロムフォトマスクを通してウエハをUV光に露出させる(図1A)。
- 65°Cで5分間、95°Cで10分間焼き、フォトレジスト現像で10分間、イソプロピルアルコールでリンスします。この段階では、パターンがウエハ上に表示されているはずです(
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結果
好中球をバイオ粒子マイクロアレイに添加すると、バイオ粒子クラスターに接触する好中球が活性化し、群れ応答を開始します。バイオ粒子マイクロアレイは、タイムラプス蛍光顕微鏡法を用いて、バイオ粒子クラスターに向かう好中球の移動を追跡することを検証した(Video S1)。個々の好中球核の移動は、バイオ粒子クラスターに向かって移動する過程で追跡される。好中球がバイオ粒子クラスターに到達すると、その核はクラスター内の他の核と重なります。したがって、この方法を用いてクラスター内の好中球を正確に追跡することはできない。ザイモサンと大腸菌のバイオ粒子クラスターは、いずれも好中球群の生成をもたらす。我々の結果として、図2Bは大腸菌粒子によって生成された好中球群からのデータを使用する。図3および図2の他のパネルは、ジモサン粒子によって生成された好中球群を用いる。得られた結果は、好.......
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ディスカッション
インビトロ好中球群を刺激するバイオ粒子の均一な配列を生成するマイクロスタンププラットフォームを開発しました。私たちのプラットフォームのインビトロの性質は、私たちはin vivo群れの実験、すなわち群れの好中球5によって放出されるメディエーターを分析する能力が低い、で生じる合併症を回避することを可能にします。さらに、in vivoモデルは、通常、げっ歯類11、12、13、15、22、23、またはゼブラフィッシュ11、12、15、23.......
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開示事項
著者らは利益相反を宣言していない。
謝辞
この研究は、ウィリアム・G・ロウリー化学・生体分子工学科とオハイオ州立大学総合がんセンターからの資金提供によって支えられた。このレポートで示されたデータは、オハイオ州立大学キャンパス顕微鏡イメージング施設で利用可能なイマリスx64(9.3.0ビットプレーン)を使用して処理された画像から来ました。この施設は、助成金P30 CA016058、国立がん研究所、ベセスダ、MDによって部分的にサポートされています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| "ビッグイージー" EasySep | STEMCELL Technologies | 18001 | 好中球単離キットで使用するマグネット |
| セルインキュベーター | Okolab | 777057437 / 77057343 | Okolabケージインキュベーター(温度とCO2制御用 |
| EasySep Human Neutrophil Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17957 | ヒト好中球 |
| Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | MEA54010 / MEF55037 | 倒立研究用顕微鏡 |
| 大腸菌 (K-12株) BioParticles テキサスレッドコンジュゲート | Invitrogen | E2863 | Bioparticle 粉末、Zetag® アレイ |
| Harris Uni-Core 8-mm 生検パンチ | Sigma Aldrich | Z708925 | PDMSスタンプをカットする |
| HetaSep | STEMCELL Technologies | 7906 | 新鮮ヒト血液中の赤血球からバフィーコートを分離するための赤血球凝集剤 |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | 核蛍光染色 |
| ヒトL1000アレイ | Raybiotech Inc. | AAH-BLG-1000-4 | 1000 ヒトタンパク質を検出する高密度アレイ |
| ヒト血清アルブミン (HSA) | シグマ・アルドリッチ | A5843 | 低エンドトキシン HSA、単離好中球の IMDM で 2 % 溶液を調製 |
| イスコーブの修飾ダルベッコス培地 (IMDM) | サーモフィッシャーサイエンティフィ | 12440053 | 単離された好中球 |
| K2-EDTA チューブ | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 02-657-32 | 採血用チューブ |
| 低反射クロームフォトマスク | フロントレンジフォトマスク | N/A | 寸法 5インチ x 5インチ x 0.09インチ (長さ x 幅 x 奥行き) |
| マイクロアレイスキャナー | パーキン・エルマー | ASCNGX00 | タンパク質パターンマイクロドメインの蛍光リーダー |
| 顕微鏡画像 Analsysis ソフトウェア - Imaris | Bitplane | 9.3.0 | 自動細胞追跡分析 |
| 用ソフトウェアNiS Elements Advanced Research Software Package | Nikon Instruments | MQS31100 | 自動ライブセルイメージングおよびスウォームサイズ計算用ソフトウェア |
| ポリ-L-リジンフルオレセインイソチオシアネート (PLL-FITC) | Sigma Aldrich | P3069-10MG | 30,000 - 70,000 MW PLL with FITCで標識、CP溶液の蛍光標識に使用 |
| SecureSeal 8ウェルイメージングスペーサー | Grace Bio-Labs | 654008 | 8ウェル、直径9mm、接着イメージングスペーサー |
| Silicon Wafer | University Wafer | 590 | Silicon 100 mm N/P (100) 0- 100 Ohm-cm 500 μm SSPテスト |
| スピンコーター | ローレル | WS-650MZ-23NPPB | コートに使用 40-µシリコンウェーハ上のフォトレジストのm層 |
| SU-8 2025 | MicroChem | 2025 | シリコンマスターウェーハを作るためのネガフォトレジスト |
| SU-8 Developer | MicroChem | Y020100 | フォトレジスト現像液。シリコンウェーハから非架橋SU-8 2025を取り外す |
| Sylgard 184 (ポリジメチルシロキサン、PDMS) | ダウ | 1673921 | マイクロスタンプとPDMSウェルを作るための2部構成シリコーンエラストマーキット |
| UV露光マスキングシステム | Kloé | UV-KUB 2 | UV光でクロムマスクを介してシリコンウェーハ上のフォトレジストを架橋するために使用されます |
| 水 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A1287303 | バイオ粒子を希釈するための高品質の水 |
| Zetag 8185 | BASF | 8185 | カチオン性高分子電解質(CP)、粉末、アクリルアミドと四級化カチオン性モノマーの共重合体は、水 |
| に溶解するとマイクロスタンピング用の「インク溶液」を形成しますZymosan A S. cerevisiae BioParticles Texas Red conjugate | Invitrogen | Z2843 | Bioparticle 粉末、Zetag アレイに添加する前に水に溶解 |
参考文献
- Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. Neutrophils in cancer: neutral no more. Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).
- Jones, C. N., et al. Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood.....
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